田菁納豆多酚提取工藝優化及其抗氧化活性

殷凱欣，梁寶靜，王家林，趙忠祥

（青島科技大學，山東青島 266042）

植物多酚是一種次生代謝產物，在天然植物中含量豐富、分布廣泛[1]，屬于多羥基酚類，根據所含苯酚環的數量和結構可以分為黃酮類、木脂素類、酚酸類和芪類四大類[2]，具有活躍的化學性質和多種生物活性。研究表明植物多酚具有較好的抗氧化活性，可以通過螯合金屬離子、清除自由基、抑制氧化酶活性發揮抗氧化作用，也可以通過保護機體內源性抗氧化酶實現間接抗氧化[3?4]。此外，植物多酚類物質還具有抑制食品中腐敗微生物的生長、阻礙多種食源性病原體的繁殖、抑制腫瘤中的細胞生長、降低癌癥風險[5]、降低血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇水平、降低心血管疾病死亡風險[6]、促進腸道益生菌生長、調節腸道微生物菌群[7]、調節機體脂肪代謝、抑制脂肪細胞的增殖和分化、誘導其凋亡、刺激機體產熱以加速能量消耗、減肥降脂[8]等功能。植物多酚提取物常作為天然的防腐劑用于果蔬[9]、肉類及肉制品[10]、水產品[11]的保鮮，且在醫療和保健、化工等領域都有廣泛的應用。

田菁（Sesbaniacannabina）是一種一年生多用途豆科植物，存在莖瘤和根瘤兩種結瘤方式，具有極強的耐旱、耐澇、耐鹽堿[12]、耐貧瘠、抗病蟲害和固氮能力，適應性強且作為夏季綠肥在土壤改良方面得到了廣泛的應用[13]。田菁種子中含有豐富的營養物質，其中含量最多的是蛋白質，含量為30%～40%[14]，還含有大量的多酚類活性物質以及銅、鐵、錳、鋅等微量元素[15]。

田菁納豆是以田菁為原料，由納豆芽孢桿菌在適宜條件下發酵制成的納豆制品。在發酵過程中，田菁中復雜的大分子蛋白質分解成小分子的氨基酸和多肽，同時部分縮合單寧也會釋放出來，納豆成熟后會產生納豆激酶，增加了游離多酚的含量，提高了田菁的營養價值，也拓寬了田菁的應用范圍。目前關于田菁多酚的報道較少，本研究以田菁納豆為材料，乙醇為溶劑浸提多酚，進而確定田菁納豆多酚的最佳提取工藝，以期為后續的深入研究提供一定的理論依據，為田菁的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

田菁：山東省農業科學院黃河三角洲現代農業研究院試驗田；納豆芽孢桿菌：青島科技大學生物工程實驗室保藏菌種。

沒食子酸（純度≥99%）：天津市科密歐化學試劑有限公司；福林酚（分析純）：北京普西唐生物科技有限公司；2，2′?聯氨?雙（3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸）二銨鹽[2，2′?azino?bis（3?ethylbenzothiazoline?6?sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]（純度98%）、2，4，6?三吡啶基三嗪（純度99%），L?抗壞血酸（VC、純度＞99%）：上海麥克林生化科技有限公司；1，1?二苯基?2?苦基肼（1，1?diphenyl?2?picryl?hydrazyl radical，DPPH）（純度98%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋（XT5202?D31?RO5C）：杭州雪中炭恒溫技術有限公司；離心機（LG10?2.4A）：北京京立離心機有限公司；真空冷凍干燥機（FD?1A?50）：上海比朗儀器制造有限公司；超凈工作臺（SW?CJ?1FD）：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；紫外可見分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 田菁納豆的制備及處理

30 g 田菁→除雜、洗凈、浸泡→121 ℃滅菌30 min→3%接種量接種納豆芽孢桿菌→37 ℃恒溫培養24 h→4 ℃后熟24 h→凍干磨粉→4 ℃密封冷藏。

1.3.2 沒食子酸標準曲線的繪制

配制沒食子酸工作液，濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL。分別吸取1 mL 不同濃度的沒食子酸工作液，加入2 mL 福林酚試劑，搖勻，避光靜置6 min，再加入10% 碳酸鈉溶液4 mL，去離子水定容至10 mL，混勻，避光靜置1 h。以試劑空白為參照，于765 nm 波長下測定其吸光度。以沒食子酸質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[16]。

1.3.3 田菁納豆多酚提取量的計算

準確稱取1 g 田菁納豆凍干粉，在不同乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間下浸提田菁納豆中的多酚，5 000 r/min 離心10 min，離心2 次，得到田菁納豆多酚提取液[17]。將田菁納豆多酚提取液稀釋25 倍作為待測液備用，取1 mL 上述待測液于試管中，按照1.3.2 的方法比色，于765 nm 下測定其吸光度，根據沒食子酸標準曲線換算出相應的濃度，田菁納豆多酚提取量（D，mg/g）按以下公式計算。

式中：C為根據標準曲線求得的田菁納豆多酚質量濃度，μg/mL；V為田菁納豆多酚粗提液體積，mL；N為稀釋倍數；M為田菁納豆凍干粉質量，g。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 乙醇濃度對田菁納豆多酚提取量的影響

固定料液比1∶15（g/mL）、溫度60 ℃的條件下提取80 min，乙醇濃度取10%、20%、30%、40%、50%、60%，平行3 次，考察乙醇濃度對多酚提取量的影響[17]。

1.3.4.2 提取溫度對田菁納豆多酚提取量的影響

固定料液比1∶15（g/mL）、乙醇濃度30% 的條件下提取80 min，提取溫度取30、40、50、60、70、80 ℃，每組平行3 次，考察提取溫度對多酚提取量的影響。

1.3.4.3 提取時間對田菁納豆多酚提取量的影響

固定乙醇濃度30%、料液比1∶15（g/mL）、溫度60 ℃，提取時間取60、70、80、90、100、110 min，每組平行3 次，考察提取時間對多酚提取量的影響。

1.3.4.4 料液比對田菁納豆多酚提取量的影響

固定乙醇濃度30%、溫度60 ℃的條件下提取80 min，料液比取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），每組平行3 次，考察料液比對多酚提取量的影響。

1.3.5 響應面試驗

由單因素試驗選出對多酚提取量影響較大的3 個因素，將上述3 個因素作為自變量，以田菁納豆多酚提取量為響應值，進行三因素三水平的響應面試驗，進一步優化田菁納豆多酚提取條件，響應面因素及水平見表1。

表1 響應面因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.6 田菁納豆多酚抗氧化能力的測定

以VC為陽性對照，參考舒旭晨等[18]的方法，測定田菁納豆多酚的羥自由基清除率。參考孫曉波等[19]的方法，測定田菁納豆多酚清除DPPH 自由基的能力。參考楊亞超等[20]的方法，研究田菁納豆多酚對ABTS+自由基的清除作用。參考張清月等[21]的方法，測定田菁納豆多酚對鐵離子的還原能力。

1.4 數據處理

采用Excel 進行數據的處理和分析，Design Expert 10 和Origin 2018 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

沒食子酸標準曲線如圖1所示。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard cure of gallic acid

由圖1 可知，根據試驗數據得到沒食子酸標準曲線的回歸方程為y=0.014 1x+0.018 7，y為吸光度，x為沒食子酸質量濃度，R2=0.999 5，表明在所選質量濃度范圍內線性關系表現良好，可用于田菁納豆多酚提取量的測定。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對田菁納豆多酚提取量的影響

乙醇濃度對田菁納豆多酚提取量的影響結果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對田菁納豆多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on amount of polyphenols extracted from Sesbania natto

由圖2 可知，隨乙醇濃度增大，田菁納豆多酚提取量先增大后減小。乙醇濃度在10%～30% 時，多酚提取量不斷升高，當乙醇濃度為30% 時，多酚提取量達到峰值，乙醇濃度超過30% 時，多酚提取量驟降?？赡茉蚴且掖紳舛鹊蜁r，水相比例較大，水溶性雜質溶出較多而抑制多酚類物質的溶出；乙醇濃度為30%時溶液的極性和田菁納豆多酚的極性相近，易于溶出；乙醇濃度高時，溶劑極性降低，體系中的醇溶性雜質或脂溶性雜質更易浸出，此外，蛋白質也會變性，結合型多酚被破壞，多酚溶出減少從而多酚提取量隨之降低[22]。綜上，將響應面試驗中乙醇濃度定為20%、30%、40%。

2.2.2 提取溫度對田菁納豆多酚提取量的影響

提取溫度對田菁納豆多酚提取量的影響結果如圖3所示。

圖3 提取溫度對田菁納豆多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on amount of polyphenols extracted from Sesbania natto

由圖3 可知，當提取溫度升高，田菁納豆多酚提取量隨之增大，這可能是由于適度升溫，分子間運動加快，更利于多酚的溶出，提取溫度達到60 ℃時，多酚提取量最高，繼續升溫，多酚提取量反而下降。溫度過高，多酚化學結構遭到破壞，出現分解、氧化等反應。同時提取溫度高，溶劑中乙醇會揮發，其他雜質也會溶出，因此多酚提取量減小[23]。選擇提取溫度50、60、70 ℃進行響應面優化試驗。

2.2.3 提取時間對田菁納豆多酚提取量的影響

提取時間對田菁納豆多酚提取量的影響結果如圖4所示。

圖4 提取時間對田菁納豆多酚提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on amount of polyphenols ex?tracted from Sesbania natto

由圖4 可知，當提取時間少于80 min 時，溶劑與提取物充分接觸，表現為多酚提取量逐漸增大。當繼續延長提取時間，多酚提取量減小。提取時間超過100 min時，多酚提取量驟減，可能是因為提取時間過長，田菁納豆中的多酚與空氣接觸發生氧化分解。因此選擇提取時間70、80、90 min 作為響應面分析的3 個水平。

2.2.4 料液比對田菁納豆多酚提取量的影響

料液比對田菁納豆多酚提取量的影響結果如圖5所示。

圖5 料液比對田菁納豆多酚提取量的影響Fig.5 Effect of material?to?liquid ratio on amount of polyphenols extracted from Sesbania natto

由圖5 可知，隨溶劑添加量增加，田菁納豆的多酚提取量先增大，在料液比1∶15（g/mL）后趨于平緩，這可能是因為溶劑添加量增加導致細胞內外濃度差增大，利于多酚的溶出，繼續增大溶劑添加量，田菁納豆中大多數多酚類物質已全部溶出，趨于飽和狀態，多酚提取量也不會繼續增大，因此確定最佳料液比為1∶15（g/mL）。

2.3 響應面優化試驗結果與分析

2.3.1 響應面試驗設計與結果

響應面試驗設計方案及方差分析結果見表2、表3。

表2 響應面優化試驗方案及結果Table 2 Experimental scheme and results of response surface op?timization

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance of response surface experimental results

根據表2 數據，可獲得多元回歸方程Y= 117.91-1.15A+0.19B+3.75C+2.17AB+3.07AC-2.92BC-13.41A2-19.03B2-13.22C2。利用Design Expert 10 軟件對結果進行分析，結果見表3。

由表3 可知，模型的失擬項P＞0.05，說明該模型擬合度較好。AC、BC對多酚提取量影響顯著（P＜0.05），C、A2、B2、C2對多酚提取量的影響極顯著（P＜0.01），3 個因素對田菁納豆多酚提取量的影響順序為提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間。

2.3.2 各因素交互作用分析

各因素交互作用對田菁納豆多酚提取量的影響見圖6～圖8。

圖7 乙醇濃度和提取溫度交互作用對田菁納豆多酚提取量的影響Fig.7 Effect of interaction between ethanol concentration and extraction temperature on amount of polyphenols extracted from Sesbania natto

圖8 提取時間和提取溫度交互作用對田菁納豆多酚提取量的影響Fig.8 Effect of interaction between extraction time and extraction temperature on amount of polyphenols extracted from Sesbania natto

由圖6～圖8 可知，響應曲面陡峭，表明乙醇濃度和提取溫度、提取時間和提取溫度交互作用對田菁納豆多酚提取量影響顯著，各響應曲面都有最高點，說明在試驗范圍內多酚提取量都有最大值。這與方差分析結果一致。

2.3.3 驗證試驗

經過響應面分析，田菁納豆多酚提取的最佳工藝條件為乙醇濃度29.72%、提取時間79.93 min、提取溫度61.39 ℃，在此條件下，田菁納豆多酚提取量是118.19 mg/g。綜合考慮實際的操作條件，確定最佳條件：乙醇濃度30%，提取時間80 min，提取溫度61 ℃，經過3 次平行，試驗結果顯示田菁納豆多酚提取量為119.24 mg/g，與理論值相差不大，表明模型可行。

2.4 田菁納豆多酚抗氧化能力分析

2.4.1 羥自由基清除能力的測定結果田菁納豆多酚和VC的羥自由基清除率如圖9所示。

圖9 田菁納豆多酚和VC 的羥自由基清除率Fig.9 Hydroxyl radical scavenging rate of polyphenols extracted from Sesbania natto and VC

由圖9 可知，隨著質量濃度的增大，田菁納豆多酚對羥自由基的清除率呈現上升趨勢，說明田菁納豆多酚質量濃度與清除率具有一定的線性關系，而VC表現為先上升后趨于平穩，且VC清除羥自由基的能力高于田菁納豆多酚。當質量濃度為3.5 mg/mL 時，田菁納豆多酚和VC對羥自由基的清除率均達到最大值，分別是62.18%、99.83%，田菁納豆多酚對羥自由基具有一定的清除能力。

2.4.2 DPPH 自由基清除能力的測定結果

田菁納豆多酚和VC的DPPH 自由基清除率如圖10所示。

圖10 田菁納豆多酚和VC 的DPPH 自由基清除率Fig.10 DPPH free radical scavenging rate of polyphenols ex?tracted from Sesbania natto and VC

由圖10 可知，田菁納豆多酚質量濃度為1.30～2.60 mg/mL 時，田菁納豆多酚的DPPH 自由基清除率隨濃度的增大而增大，VC在試驗質量濃度內對DPPH自由基的清除能力較穩定，VC清除DPPH 自由基的能力優于田菁納豆多酚。田菁納豆多酚、VC對DPPH 自由基的最大清除率分別為83.70%、96.26%。綜上，田菁納豆多酚具有一定的DPPH 自由基清除能力。

2.4.3 鐵離子還原能力的測定結果

田菁納豆多酚和VC對鐵離子的還原能力如圖11所示。

圖11 田菁納豆多酚和VC 對鐵離子的還原能力Fig.11 Reducing ability of polyphenols extracted from Sesbania natto and VC to ferric ions

由圖11 可知，在0.7 mg/mL 質量濃度下，VC對于鐵離子的還原能力高于田菁納豆多酚，質量濃度在1.4～3.5 mg/mL 時，田菁納豆多酚對鐵離子的還原能力一直強于VC，說明高質量濃度下，田菁納豆多酚具有良好的鐵離子還原能力。田菁納豆多酚、VC對鐵離子的最大還原力分別為3.12、2.87。

2.4.4 ABTS+自由基清除能力的測定結果

田菁納豆多酚和VC的ABTS+自由基清除率如圖12所示。

圖12 田菁納豆多酚和VC 的ABTS+自由基清除率Fig.12 ABTS+free radical scavenging rate of polyphenols ex?tracted from Sesbania natto and VC

由圖12 可知，隨著樣液體積的增大，多酚濃度逐漸增大，ABTS+自由基清除率也增大，且濃度與清除率呈正相關關系，田菁納豆多酚、VC對ABTS+自由基的最大清除率分別是53.47%、99.89%，表明田菁納豆多酚具有一定的ABTS+自由基清除能力。

3 結論

采用乙醇溶劑浸提田菁納豆中的多酚，通過響應面法優化田菁納豆多酚的提取工藝，得到最佳提取條件：乙醇濃度30%，提取時間80 min，提取溫度61 ℃，料液比1∶15（g/mL）。在最佳提取工藝條件下，田菁納豆多酚提取量為119.24 mg/g。田菁納豆多酚對羥自由基、DPPH 自由基和ABTS+自由基具有一定的清除能力，對鐵離子的還原能力較強，表明田菁納豆多酚有望成為一種天然抗氧化劑。本研究為田菁的相關研究提供數據支持，有助于田菁種子的開發利用。