食品中黃曲霉毒素M1的間接競爭酶聯(lián)免疫法的建立

侯悅，陳瑞鵬，蘆然，高志賢，周煥英*，楊仕平

（1.上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海 200000；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050）

霉菌毒素作為霉菌的次級代謝物，具有高毒性，常常污染食品和農(nóng)產(chǎn)品[1?2]。霉菌毒素對人和動物的健康會產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3?5]，如免疫抑制、腎毒性、致畸性、致癌性和誘變作用[6?8]。黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的霉菌毒素，黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）是AFB1在動物體內(nèi)經(jīng)2 次反應(yīng)產(chǎn)生的羥基化代謝物[9?10]，對人體有致癌突變作用[11?12]。

歐盟食品和牛奶中AFM1的最大殘留限量（maxi?mum residue limit，MRL）為50 ng/L[11，13]。我國對牛奶中AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)為不高于0.5 μg/kg。AFM1具有耐熱特性，能夠殘留在滅菌牛奶和巴氏殺菌牛奶中[14?15]。除了牛奶，AFM1還能存在于其他食品中，包括各種乳制品[16?17]、嬰兒配方奶粉食品（infant formula food，IFM）[18]、谷物基嬰兒食品[19]、母乳[20?22]、雞蛋和動物肉組織[23]。目前我國檢測食品中AFM1的國家標(biāo)準(zhǔn)方法有液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜分析法、免疫親和層析凈化高效液相色譜分析法、免疫層析凈化熒光分光光度分析法和雙流向酶聯(lián)免疫分析法等。

目前AFM1的高通量快速檢測方法主要基于酶聯(lián)免疫吸附（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）方法，包括直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（direct competi?tive enzyme?linked immunosorbent assay，dc?ELISA）、間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（indirect competitive enzyme?linked immunosorbent assay，ic?ELISA）等。其中，ic?ELISA 方法操作復(fù)雜，整體試驗(yàn)耗時(shí)較長[24]，但其檢測靈敏度較高。國內(nèi)外檢測試劑盒檢測AFM1的ELISA法多基于直接競爭原理，檢測限往往為ng/mL 級別。目前，缺少基于間接競爭的AFM1檢測方法研究，為填補(bǔ)空白，本研究建立一種基于間接競爭酶聯(lián)免疫吸附檢測AFM1的方法，通過優(yōu)化試驗(yàn)條件，檢出限可達(dá)pg/mL 級別，大大提高了檢測靈敏度，本方法適用于食品中AFM1的現(xiàn)場高靈敏檢測，對于保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳粉、玉米面、堅(jiān)果棒：市售；AFM1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；AFM1單克隆抗體、羊抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（immunoglobulin G horseradish peroxidase，IgG?HRP）：北京艾旗斯德科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：美國海克隆實(shí)驗(yàn)室公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、蔗糖、三正丁胺、氯甲酸異丁酯（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司；單組分3，3′，5，5′?四甲基聯(lián)苯胺（3，3′，5，5′?tetramethylbenzi?dine，TMB）顯色液、吐溫?20（96%）：北京索萊寶科技有限公司；濃硫酸（分析純）：天津渤大硫酸工業(yè)有限公司；1，4?二氧六環(huán)（≥99.0%）、N，N?二甲基甲酰胺（N，N?dimethyl formamide，DMF）（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；試驗(yàn)中所用水為超純水。

主要試劑的配制如下。

PBST（phosphate buffered solution）洗滌液：0.05%吐溫?20 溶解于PBS 緩沖液中。

碳酸鹽緩沖液（carbonate buffer solution，CBS）包被液：稱取Na2CO31.59 g、NaHCO32.93 g，用超純水定容至1 000 mL。

抗體稀釋液：1%BSA、5%蔗糖、0.05%吐溫?20 溶解于PBS 緩沖液中。

終止液（2 mol/L H2SO4）：10 mL 98% 濃硫酸加入60 mL 超純水中，再定容至100 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

AL240 電子天平：上海梅特勒?托利多有限公司；MS3 渦旋震蕩儀：德國IKA 公司；MK3 酶標(biāo)儀：美國賽默飛公司；96 孔酶標(biāo)板：康寧公司；DHG?9245A 恒溫培養(yǎng)箱：上海恒科儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 AFM1全抗原的制備

采用琥珀酸酐法合成AFM1?BSA 免疫抗原。A 液：稱取1.5 mg AFM1溶于100μL DMF 與1，4?二氧六環(huán)的溶液（體積比為1∶1）中，加入0.5μL 三正丁胺，冰浴下攪拌反應(yīng)10 min；加入0.35μL 氯甲酸異丁酯，室溫下攪拌1 h。B 液：將3 mg BSA 溶于100μL 50%DMF 溶液中。按起始摩爾比30∶1，將A 液加入B 液中，并保持pH 值為8.5，冰浴下攪拌反應(yīng)4 h；取出于0.01 mol/L、pH7.4 的PBS 中4 ℃透析3 d，每天更換4 次透析液，樣品取出后凍干，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ic?ELISA 檢測方法

1）包被：用CBS 包被液按一定比例稀釋AFM1全抗原，每孔100μL 置于96 孔酶標(biāo)板中，將包被稀釋液加入空白孔中，然后將其置于4 ℃包被12 h。

2）洗滌：取出涂有AFM1全抗原的酶標(biāo)板，一次性用力搖出孔中的液體，在方巾紙上拍打數(shù)次，注意避免孔內(nèi)液體因串孔導(dǎo)致的樣品污染，拍完后快速將96 孔酶標(biāo)板翻轉(zhuǎn)過來，向每孔中加入220μL PBST 洗滌液，計(jì)時(shí)3 min，清洗3 次。

3）封閉：每孔加入150 μL 封閉溶液，溶劑為PBS緩沖液，該封閉液需要現(xiàn)配現(xiàn)用，37 ℃孵育1 h。

4）洗滌：向酶標(biāo)板的樣品孔內(nèi)加220 μL PBST 洗滌液，計(jì)時(shí)3 min，清洗3 次，具體操作與（2）相同。

5）加入單抗：用抗體稀釋液按照一定比例稀釋AFM1單克隆抗體后，每孔加入100μL，在37 ℃下孵育1 h，并向陰性對照和空白對照孔中加入100 μL 抗體稀釋液。

6）洗滌：向酶標(biāo)板的樣品孔內(nèi)加220 μL PBST 洗滌液，計(jì)時(shí)3 min，清洗3 次，具體操作與（2）相同。

7）加入二抗：將IgG?HRP 二抗用抗體稀釋液稀釋一定比例后，每孔加入100 μL，37 ℃下孵育1 h，向空白孔中加入100μL 抗體稀釋液。

8）洗滌：向酶標(biāo)板的樣品孔內(nèi)加220 μL PBST 洗滌液，計(jì)時(shí)3 min，清洗3 次，具體操作與（2）相同。

9）TMB 顯色：向每孔內(nèi)加入單組分TMB 顯色液100μL，37 ℃下孵育顯色。

10）終止：樣品孔內(nèi)每孔加50μL 2 mol/L 濃硫酸，以停止顯色。加入濃硫酸后可通過肉眼發(fā)現(xiàn)孔內(nèi)溶液由藍(lán)變黃。

11）檢測：利用酶標(biāo)儀在波長450 nm 處進(jìn)行檢測。

1.3.3 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

在ic?ELISA 試驗(yàn)中，目標(biāo)物全抗原及單抗的濃度、包被溫度及時(shí)間、封閉溶液的種類、二抗IgG?HRP 的濃度、TMB 孵育時(shí)間等均會不同程度改變體系靈敏度，從而改變體系的檢測范圍、檢測限[25]。本研究通過陽性值、陰性對照和空白對照等參數(shù)結(jié)果選擇最適條件。

1.3.3.1 AFM1全抗原和AFM1單克隆抗體濃度的優(yōu)化

使用棋盤法對AFM1全抗原和AFM1單克隆抗體稀釋比例進(jìn)行優(yōu)化，其中AFM1全抗原包被濃度按照1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000 倍稀釋。AFM1單抗按照同樣比例稀釋，其余步驟同1.3.2，觀察不同稀釋比例的全抗原和單抗對吸光度OD 值的影響，優(yōu)化出最佳全抗原、單抗的稀釋比例。陰性對照不加單抗，空白對照不加單抗和IgG?HRP。

1.3.3.2 包被條件的優(yōu)化

在CBS 包被液稀釋抗原的條件下，抗原因?yàn)楹姓姾梢子诟皆诿笜?biāo)板上[26]。為確定最佳包被條件，將其在4 ℃冰箱中包被12 h，并在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中包被1 h 或2 h。根據(jù)最大P/N值確定最佳的包被條件，其中，P為陽性值，N為陰性值。

1.3.3.3 最佳封閉液的優(yōu)化

封閉液會影響檢測環(huán)境的背景信號，對結(jié)果有直接的影響，故優(yōu)化封閉液的種類十分必要。在最優(yōu)AFM1全抗原濃度、AFM1單抗?jié)舛群妥顑?yōu)包被條件的基礎(chǔ)上，選擇5% 脫脂奶粉（skimmed milk powdero，SMP）、1% 牛血清白蛋白（BSA）和1% 卵白蛋白（oval?bumin，OVA）作為封閉溶液，空白對照孔中僅加入PBS 緩沖液，并按照1.3.2 進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)最大P/N值確定最佳封閉溶液。

1.3.3.4 最佳酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊膬?yōu)化

影響ic?ELISA 靈敏度的重要因素還包括IgG?HRP 的濃度。為了提高體系的靈敏度，利用抗體稀釋液按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000 和1∶4 000 5 種不同濃度，對羊抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（IgG?HRP）進(jìn)行稀釋，并按照1.3.2 進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)最大P/N值確定最合適的IgG?HRP 濃度。

1.3.3.5 TMB 顯色時(shí)間的優(yōu)化

在最優(yōu)AFM1全抗原和AFM1單抗?jié)舛取粭l件、最優(yōu)封閉溶液種類和最優(yōu)IgG?HRP 稀釋比例的基礎(chǔ)上，優(yōu)化TMB 顯色時(shí)間，設(shè)置5 個時(shí)間長度，分別為10、15、20、25 min 和30 min，步驟與1.3.2 相同，TMB顯色的最佳時(shí)間由最大P/N值確定。

1.3.4 ic?ELISA 方法的建立

AFM1標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶液稀釋至1 mg/mL，儲存在-20 ℃條件下，根據(jù)試驗(yàn)需求用PBS 緩沖液配制梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在確定最佳試驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，按照步驟1.3.2 進(jìn)行操作，建立ic?ELISA 試驗(yàn)體系。加入單抗的同時(shí)需要加入AFM1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行競爭，其中AFM1標(biāo)準(zhǔn)品競爭濃度設(shè)置為0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 ng/mL，按照濃度分別加50 μL AFM1標(biāo)準(zhǔn)品，再加入50μL AFM1單克隆抗體，濃度為方法1.3.3.1 中確定的AFM1單克隆抗體最佳濃度的2 倍。空白對照中加入100μL 抗體稀釋液代替標(biāo)準(zhǔn)品；陰性對照不加AFM1標(biāo)準(zhǔn)品，加入100 μL 最佳濃度的AFM1單克隆抗體，37 ℃競爭反應(yīng)1 h。抑制率（A，%）公式如下。

A=[（R0-R）/R0]×100

式中：R0為AFM1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0 時(shí)的吸光度；R為一定濃度AFM1的吸光度。

以AFM1濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制ic?ELISA 抑制曲線和抑制回歸曲線，IC10代表抑制率為10% 時(shí)所對應(yīng)的抑制AFM1濃度，規(guī)定IC20～I(xiàn)C80為檢測范圍，最低檢測限為IC10[25]。

1.3.5 實(shí)際樣品檢測

1.3.5.1 樣品預(yù)處理

稱取10 g 待測樣品（精確到0.1 g）于200 mL 燒杯中，加水溶解，轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度線。搖勻后，取10 g 樣品6 000 r/min 離心10 min。取下層液體約1 g 于另一試管內(nèi)，用于檢測。

1.3.5.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)

將不同濃度的AFM1標(biāo)準(zhǔn)品（1 000、500、100 ng/mL）添加到實(shí)際樣品中，測定樣品回收率，每個樣品重復(fù)3 次[26]。加標(biāo)回收率（B，%）的計(jì)算公式如下。

B=[（C加標(biāo)后-C樣品）/C標(biāo)準(zhǔn)品]×100

式中：C加標(biāo)后為實(shí)際樣加入AFM1后的測定濃度，pg/mL；C樣品為實(shí)際樣加入AFM1前的檢測濃度，pg/mL；C標(biāo)準(zhǔn)品為AFM1的濃度，pg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有分析測定均為3 次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFM1 全抗原及單克隆抗體濃度優(yōu)化

當(dāng)AFM1全抗原濃度過低時(shí)，板內(nèi)全抗原包被量不足，則全抗原與AFM1單抗的結(jié)合較少，由于單抗空余位點(diǎn)較多，增加了其與其他物質(zhì)非特異性結(jié)合的概率，直接影響了體系的準(zhǔn)確性；而AFM1全抗原濃度過高又會導(dǎo)致空間位阻，降低抗原抗體結(jié)合效率，造成成本的增加。本研究采用棋盤法對AFM1全抗原和單抗的稀釋比例進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 最佳AFM1 全抗原和單克隆抗體稀釋比例的選擇Fig.1 Selection of optimal AFM1 whole antigen and monoclonal antibody dilution ratios

由圖1 可知，當(dāng)OD 值小于1 時(shí)，抗原抗體結(jié)合不夠充分，造成該方法靈敏度不理想；當(dāng)OD 值大于1時(shí)，抗原抗體結(jié)合較多，可能引起空間位阻，降低二者結(jié)合效率，增加試驗(yàn)成本。綜合考慮，OD 值約為1 時(shí)，全抗原和單抗的工作濃度最佳，即最佳的AFM1全抗原和AFM1單抗的最合適稀釋比分別為1∶32 000 和1∶2560000。

2.2 最佳包被條件優(yōu)化

利用不同包被時(shí)間及溫度下的P/N值確定最優(yōu)包被條件，結(jié)果如表1所示。

表1 最佳包被條件的選擇Table 1 Selection of optimum coating conditions

由表1 可知，4 ℃下測得的12 h 陽性值和P/N值明顯高于其他兩組對照，因此選擇在4 ℃下孵育12 h作為最合適的包被條件。

2.3 最佳封閉液優(yōu)化

全抗原被包被在酶標(biāo)板后用一定濃度的不相關(guān)蛋白質(zhì)溶液重新包裹的過程稱為封閉，即用無關(guān)蛋白質(zhì)填補(bǔ)酶標(biāo)板上未被包被的縫隙，避免雜物在隨后ELISA 步驟中再吸附[27]。將3 種封閉劑和僅加入PBS緩沖液的4 種封閉方式作比較，根據(jù)最大P/N值，選擇最合適的封閉溶液種類，結(jié)果如圖2所示。

圖2 最佳封閉液的選擇Fig.2 Selection of the best blocking solution

由圖2 可知，空白對照、5%SMP、1%OVA 組的P/N值均較小，這是因?yàn)楸尘靶盘栔递^高，N值較大，導(dǎo)致P/N值小，均低于15，說明背景信號在這3 種封閉條件下對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大的環(huán)境影響。當(dāng)封閉溶液為1%BSA 時(shí)，吸光度OD 值顯示P/N值最大，表明1%BSA作為封閉溶液對檢測條件的背景信號干擾不大，因此，在試驗(yàn)中選擇1%BSA 為最合適的封閉溶液。

2.4 二抗?jié)舛葍?yōu)化

為獲得檢測體系的最大靈敏度，需要優(yōu)化最佳的二抗工作濃度[28]。最優(yōu)濃度是指當(dāng)IgG?HRP 稀釋到該濃度時(shí)，ic?ELISA 產(chǎn)生最低的背景吸光度，從而獲得最高靈敏度。在先前優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，IgG?HRP 用抗體稀釋液以1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000的比例梯度稀釋，最大P/N值對應(yīng)的稀釋比例即為IgG?HRP 的最優(yōu)濃度，結(jié)果如圖3所示。

由圖3 可知，P/N值在稀釋比為1∶3 000 時(shí)最大。因此，選擇IgG?HRP 的最佳稀釋比例為1∶3 000。

2.5 最佳顯色時(shí)間優(yōu)化

ELISA 信號值的大小由TMB 顯色液的顏色深度決定，而顏色深度與顯色孵育時(shí)間有關(guān)，因此操作步驟中顯色反應(yīng)的優(yōu)化對于保證ic?ELISA 最終的測定結(jié)果非常重要[29]。TMB 顯色時(shí)間的長短是影響ic?ELISA靈敏度的重要因素之一，為提高ic?ELISA 檢測的穩(wěn)定性，優(yōu)化TMB 顯色時(shí)間，設(shè)置5 個顯色時(shí)間，分別為l0、15、20、25 min 以及30 min，結(jié)果如圖4所示。

由圖4 可知，顯色時(shí)間為25 min 時(shí)，對應(yīng)P/N值最大，為22.36，因此確定TMB 最優(yōu)顯色時(shí)間為25 min。

2.6 ic?ELISA 試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)之前所有的優(yōu)化結(jié)果，確定完整的ic?ELISA試驗(yàn)條件：AFM1全抗原的稀釋比為1∶32 000，單抗的稀釋比為1∶256 000，在4 ℃條件下包被12 h，封閉溶液選擇1% BSA，酶標(biāo)二抗的稀釋比是1∶3 000，顯色時(shí)間為25 min。之后采用PBS 緩沖液制備梯度濃度（0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 ng/mL）的AFM1標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行ic?ELISA 試驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 AFM1 間接競爭試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 AFM1 indirect competition experiment results

由圖5 可知，隨著AFM1標(biāo)準(zhǔn)品濃度的不斷提高，對應(yīng)的抑制率不斷提高，表明競爭明顯。

2.7 AFM1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過ic?ELISA 試驗(yàn)體系測得的AFM1的標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線、線性回歸方程分別如圖6、圖7所示。

圖6 AFM1 標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線Fig.6 Standard fitted curve of AFM1

圖7 AFM1 線性回歸方程Fig.7 Linear regression equation of AFM1

由圖6 可知，AFM1濃度在50～10 000 pg/mL 時(shí)，其吸光度整體逐漸下降，說明當(dāng)AFM1濃度較低時(shí)，僅有較少的AFM1標(biāo)準(zhǔn)品與全抗原競爭結(jié)合AFM1單抗的位點(diǎn)，競爭率較低；當(dāng)AFM1濃度增加時(shí)，出現(xiàn)更多的AFM1標(biāo)準(zhǔn)品與全抗原競爭結(jié)合AFM1單抗的位點(diǎn)，競爭率明顯增加。由圖7 可知，AFM1在9.743～2.605×103pg/mL 的濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.247 2x-0.044 4，R2=0.992 7，經(jīng)計(jì)算，檢出限IC10為3.84 pg/mL。

2.8 實(shí)際樣品測定

使用ic?ELISA 方法檢測實(shí)際樣品中AFM1含量，以驗(yàn)證該體系在食品分析中的實(shí)際應(yīng)用穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

表2 基于ic?ELISA 方法的AFM1 實(shí)際樣品檢測結(jié)果Table 2 AFM1 actual sample detection results based on ic?ELISA

由表2 可知，將不同濃度的AFM1標(biāo)準(zhǔn)品添加到不同的樣品中，加標(biāo)濃度分別為1 000、500 pg/mL 和100 pg/mL。采用該免疫法測定的AFM1的回收率為88.43%～105.75%，表明該方法滿足食品中AFM1分析和檢測的需要。

3 結(jié)論

AFM1存在極大的食品安全隱患，且該毒素在人類生活環(huán)境中隨處可見，對公眾健康和飲食安全造成嚴(yán)重的危害。本研究在合成AFM1全抗原的基礎(chǔ)上，建立了AFM1的ic?ELISA 檢測方法，方法線性范圍為9.743～2.605×103pg/mL，檢出限為3.84 pg/mL，加標(biāo)回收率為88.43%～105.75%。本方法大大提升了檢測靈敏度，具有適用性好、操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可為食品質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支撐。