lncRNA SNHG7通過miR-122-5p/CCND1軸調節胃癌細胞的增殖、凋亡及腫瘤免疫逃逸

閆丹措 馬穎才 逯艷艷 楊桂英 東金花 趙奕 劉芝蘭

(青海省人民醫院消化內科,青海 西寧 810000)

胃癌作為人類常見的惡性消化道腫瘤,在全球腫瘤死亡率中居第二位,常采用手術結合放化療的方式進行臨床治療,但中晚期患者療效并不顯著,其生活質量及生存率還不理想,因而積極改進胃癌治療方法對提升患者預后具有重大價值〔1,2〕。長鏈非編碼RNA(lncRNA)小核仁RNA宿主基因(SNHG)7已被證明是在包括食管癌、乳腺癌和胃癌等在內的人類腫瘤中發揮重要致癌作用的lncRNA,可通過調節細胞存活、凋亡、生長及遷移等多種生物學作用促進腫瘤的發生和進展〔3〕。SNHG7在胃癌中顯著上調,與胃癌細胞的順鉑耐藥、胃癌患者浸潤深度和遠處轉移呈正相關;SNHG7可通過增強胃癌細胞遷移、侵襲和增殖活性而在胃癌中發揮致癌作用,可作為胃癌的潛在治療靶點〔4,5〕。miR-122是在包括胃癌、卵巢癌在內的多種癌癥中起到抑瘤作用的微小RNA,其中miR-122-5在胃癌細胞和組織中表達降低〔6〕,提高miR-122-5p表達水平可降低卵巢癌和胃癌細胞遷移、侵襲和增殖活力,并加速其凋亡〔6,7〕;而細胞周期蛋白(CCN)D1可通過調控細胞周期而促進腫瘤的發生,下調CCND1表達可阻滯胃癌細胞周期,抑制胃癌細胞增殖及胃癌的發生進展,以上顯示miR-122-5p和CCND1均是有前景的胃癌治療靶點〔8〕。研究顯示,miR-122-5p可能通過調控CCND1介導乳腺癌患者的基線體質量指數,最終影響腫瘤的復發〔9〕,另外SNHG7可通過下調miR-122-5p促進肝癌細胞生長和轉移〔10〕。因而預測lncRNA SNHG7可能通過miR-122-5p/CCND1軸調節胃癌細胞的增殖、凋亡及腫瘤免疫逃逸過程,本文通過敲低胃癌細胞MKN-45中lncRNA SNHG7的表達對以上假設進行研討。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 lncRNA SNHG7 siRNA、miR-122-5p inhibitor陰性對照、miR-122-5p inhibitor、lncRNA SNHG7過表達質粒(pc-lncRNA SNHG7)、lncRNA SNHG7空載質粒(pc-NC)、突變型miR-122-5p 3′-非翻譯區(UTR)報告質粒(mut-miR-122-5p)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)與CCND1、U6、miR-122-5p、lncRNA SNHG7引物、野生型miR-122-5p 3′-UTR報告質粒(wt-miR-122-5p)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;胎牛血清(貨號164210-500)、人胃黏膜上皮細胞(貨號CP-H048)、人胃黏膜上皮細胞完全培養基(貨號CM-H048)、人胃癌組織源細胞(貨號CP-H139)、人胃癌組織源細胞完全培養基(貨號CM-H139)、NCI-N87細胞(貨號CL-0169)、SNU-1細胞(貨號CL-0474)、MKN-45細胞(貨號CL-0292)、RPMI1640培養基(貨號PM150110)、青鏈霉素混合液(貨號PB180120)均購自武漢普諾賽生命科技有限公司;人外周血CD8+T細胞購自北京匯智和源生物技術有限公司;總RNA提取試劑盒(貨號R1200)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號D0010)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(貨號T2210)、Opti-MEM減血清培養基(貨號31985070)、5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細胞增殖檢測試劑盒(貨號CA1170)均購自北京索萊寶科技有限公司;抗人CD3抗體(貨號61347)、兔源抗大鼠細胞增殖核抗原(PCNA)一抗(貨號13110)、兔源抗大鼠天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3一抗(貨號9662)、兔源抗大鼠CCND1一抗(貨號55506)、膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒(貨號V13242)、兔源抗大鼠B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(Bax)一抗(貨號PA5-11378)、抗人CD28抗體(貨號91920)、人白細胞介素(IL)-2重組因子(貨號31058)均購自美國Cell Singaling Technology公司;山羊抗兔IgG二抗(貨號A0208)、蛋白裂解液(貨號P0013K)、兔源抗大鼠β-tubulin一抗(貨號AF1216)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(貨號P0011)、CCK-8試劑盒(貨號C0037)均購自上海碧云天生物技術有限公司等。實時熒光定量PCR儀(型號IC5MCIer)、全自動酶標儀(型號iMark)均購自美國BIO-RAD公司;倒置熒光雙目顯微鏡(型號FSX100)購自日本Olympus公司;流式細胞儀(型號Countstar Rigel)購自上海睿鈺生物科技有限公司;穩壓穩流電泳儀(型號EPS-600)購自上海天能科技有限公司;垂直電泳、印跡系統(miniVE)購自美國Cytiva公司等。

1.2實時熒光定量PCR檢測各細胞中lncRNA SNHG7、miR-122-5p與CCND1表達 快速解凍購買的人胃黏膜上皮細胞、人胃癌組織源細胞及人胃癌細胞株MKN-45、SNU-1、NCI-N87,復蘇后離心,以RPMI1640培養基洗滌各細胞沉淀后,以相應的完全培養基分別重懸人胃黏膜上皮細胞及人胃癌組織源細胞后混勻,以加入10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI1640培養基分別重懸人胃癌細胞NCI-N87、SNU-1、MKN-45后混勻,均放入恒溫培養箱(37.5 ℃、5%CO2)中無菌培養,各細胞長滿后進行傳代并收集細胞沉淀。參照總RNA提取試劑盒說明書的指導步驟對各細胞中總RNA進行提取純化,并參照一步法實時熒光定量PCR試劑盒說明書的指導步驟進行PCR,設定條件如下:50 ℃ 5 min,95 ℃ 3 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,循環數40,lncRNA SNHG7與CCND1的內參選用GAPDH,miR-122-5p的內參選用U6,通過2-ΔΔCt分析各基因循環閾值并量化其相對表達,引物序列:lncRNA SNHG7:上游引物5′-TTGCTGGCGTCTCGGTTAAT-3′、下游5′-GGAAGTCCATCACAGGCGAA-3′,CCND1:上游引物5′-CTGTGCATCTACACCGACAACT-3′、下游5′-GCATTTTGGAGAGGAAGTGTTC-3′,GAPDH:上游引物5′-AACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3′、下游5′-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3′,miR-122-5p:上游引物5′-TATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3′、下游5′-GCCCGTGGAGTGTGACAATGGT-3′,U6:上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′、下游5′-CGCTTCAC-GAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.3分組轉染MKN-45細胞及收集標本 在一個無菌12孔板中接種傳代MKN-45細胞,培養24 h后隨機分為對照組、si-lncRNA SNHG7組、si-NC組、si-lncRNA SNHG7+miR-122-5p inhibitor組,將細胞完全培養基換成Opti-MEM減血清培養基,使用脂質體2000并遵照其指導操作說明對細胞分組進行轉染,si-lncRNA SNHG7組、si-NC組細胞分別轉染lncRNA SNHG7 siRNA及其陰性對照,si-lncRNA SNHG7+miR-122-5p inhibitor組細胞轉染lncRNA SNHG7 siRNA和miR-122-5p inhibitor,6 h后將Opti-MEM減血清培養基換成新鮮完全培養基后繼續培養24 h,收集各組細胞做后續檢測。

1.4檢測MKN-45細胞增殖情況 將1個無菌的96孔板的培養孔隨即分為空白對照組、對照組、si-lncRNA SNHG7組、si-NC組、si-lncRNA SNHG7+miR-122-5p inhibitor組,每組設6個孔,除了空白對照組外其余各組接種傳代的MKN-45細胞于恒溫培養箱(37.5 ℃、5%CO2)中無菌培養12 h后,以上述1.3中的方法對除了空白對照組外的其余各組進行轉染,24 h后加入10 μl CCK-8試劑孵育1.5 h后用酶標儀測出各組細胞在450 nm波長下的吸光度(A),然后算出其細胞活力,細胞活力(%)=(A轉染組-A空白對照組)/(A對照組-A空白對照組)×100%。

在無菌的24孔板中接種傳代MKN-45細胞,于恒溫培養箱(37.5 ℃、5%CO2)中無菌培養12 h后以上述1.3中的方法對各組細胞進行轉染,24 h后向各孔細胞中加入50 μmol/L EdU溶液,繼續培養2 h后倒掉培養基,剩余貼壁的細胞經洗滌、固定后按照EdU細胞增殖檢測試劑盒說明指導檢測各組細胞增殖情況,采用ImageJ軟件分析熒光顯微鏡下采集的圖片,計算各組細胞EdU陽性率=EdU陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.5檢測MKN-45細胞凋亡情況 將1.3中收集的各組MKN-45細胞以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、重懸,混勻后以10 μl AnnexinⅤ-FITC孵育后,以5 μl PI避光孵育,再次以PBS洗滌、重懸、混勻后上機檢測,采用Muticycle AV軟件分析流式細胞儀中數據獲得各組細胞凋亡率。

1.6檢測活化CD8+T細胞對各組MKN-45細胞的殺傷率 將購買的人外周血CD8+T細胞以1 μg/ml抗CD3抗體、1 μg/ml抗CD28抗體和10 ng/ml IL-2激活24 h后〔11〕,對其進行計數后以20∶1的比例與1.3中收集的各組細胞共同接種在96孔板中培養,同時在另一個96孔板中接種與共培養組數目相同的人外周血CD8+T細胞進行培養,以單獨培養的MKN-45細胞作為對照靶細胞,各組細胞培養24 h后依照1.4中方法測出其A值后算出每組活化CD8+T細胞對各組MKN-45細胞的殺傷率,公式:殺傷率=〔1-(A共培養-A對照效應細胞)/A對照靶細胞〕×100%。

1.7檢測MKN-45細胞miR-122-5p及CCND1、PCNA、Bax、caspase-3表達 以上述1.2中的方法通過實時熒光定量PCR實驗檢測各組MKN-45細胞中miR-122-5p表達。以蛋白裂解液裂解1.3中收集的各組MKN-45細胞,離心提取其中總蛋白后用BCA試劑盒并參照其說明書指導步驟測出其濃度,然后每組取出18 μg蛋白變性后上樣,以垂直電泳、印跡系統通過電泳及濕轉實驗將蛋白分離后轉至硝酸纖維素膜上,分別孵育CCND1(1∶2 000)、PCNA(1∶3 000)、Bax(1∶2 500)、caspase-3(1∶1 000)及β-tubulin(1∶2 000)一抗后孵育山羊抗兔二抗(1∶1 000),顯色后拍照,以ImageJ軟件定量所得圖像中各蛋白灰度并量化其相對表達。

1.8檢測MKN-45細胞中lncRNA SNHG7對miR-122-5p的靶向調控 在一個無菌的24孔板中接種傳代MKN-45細胞,培養24 h后將pc-lncRNA SNHG7、pc-NC分別與mut-miR-122-5p、wt-miR-122-5p共同轉染到MKN-45細胞中,24 h后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組細胞雙熒光素酶活性并算出其相對值,具體方法依照試劑盒說明書中所示。

1.9統計學方法 采用SPSS24.0軟件進行方差分析,兩兩間比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1人胃黏膜上皮細胞、人胃癌組織源細胞和人胃癌細胞株MKN-45、NCI-N87、SNU-1中lncRNA SNHG7、miR-122-5p與CCND1 mRNA的表達 與人胃黏膜上皮細胞相比,人胃癌組織源細胞和人胃癌細胞株MKN-45、SNU-1、NCI-N87中miR-122-5p表達顯著降低,lncRNA SNHG7、CCND1 mRNA表達顯著升高(均P<0.05)。見表1。

表1 各細胞中CCND1 mRNA與miR-122-5p、lncRNA SNHG7的相對表達水平

2.2lncRNA SNHG7對MKN-45細胞增殖的影響 與對照組相比,si-lncRNA SNHG7組細胞活力與EdU陽性率均顯著降低(P<0.05),si-NC組細胞活力與EdU陽性率均無顯著差異(P>0.05);與si-lncRNA SNHG7組相比,si-lncRNA SNHG7+miR-122-5p inhibitor組細胞活力與EdU陽性率均顯著升高(P<0.05)。見圖1、表2。

2.3lncRNA SNHG7對MKN-45細胞免疫逃逸的影響 與對照組相比,si-lncRNA SNHG7組活化CD8+T細胞對MKN-45細胞的殺傷率明顯升高(P<0.05),si-NC組活化CD8+T細胞對MKN-45細胞的殺傷率無顯著差異(P>0.05);與si-lncRNA SNHG7組相比,si-lncRNA SNHG7+miR-122-5p inhibitor組活化CD8+T細胞對MKN-45細胞的殺傷率明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.4lncRNA SNHG7對MKN-45細胞凋亡的影響 與對照組相比,si-lncRNA SNHG7組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05),si-NC組細胞凋亡率無顯著差異(P>0.05);與si-lncRNA SNHG7組相比,si-lncRNA SNHG7+miR-122-5p inhibitor組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

1～4:對照組、si-lncRNA SNHG7組、si-NC組、si-lncRNA SNHG7+miR-122-5p inhibitor組;圖2、3同圖1 EdU染色檢測各組MKN-45細胞增殖(×200)

表2 各組MKN-45細胞活力、EdU陽性率、細胞凋亡率、殺傷率

圖2 流式細胞術檢測各組MKN-45細胞凋亡

2.5lncRNA SNHG7對MKN-45細胞miR-122-5p、CCND1 mRNA及增殖、凋亡蛋白表達的影響 與對照組相比,si-lncRNA SNHG7組細胞miR-122-5p、caspase-3、Bax蛋白表達均明顯升高,PCNA、CCND1蛋白表達均明顯降低(均P<0.05);與si-lncRNA SNHG7組相比,si-lncRNA SNHG7+miR-122-5p inhibitor組細胞miR-122-5p、caspase-3、Bax蛋白表達均明顯降低,PCNA、CCND1蛋白表達均明顯升高(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組細胞miR-122-5p及caspase-3、Bax、PCNA、CCND1蛋白相對表達水平

圖3 Western印跡檢測各組細胞增殖及凋亡蛋白表達

2.6MKN-45細胞中lncRNA SNHG7對miR-122-5p的靶向調節 通過TCGA數據庫查詢lncRNA SNHG7與miR-122-5p間的結合位點,見圖4。與wt-miR-122-5p+pc-NC組(1.04±0.25)比較,wt-miR-122-5p+pc-lncRNA SNHG7組熒光素酶相對活性顯著降低(0.35±0.07,P<0.05);mut-miR-122-5p+pc-NC組與mut-miR-122-5p+pc-lncRNA SNHG7組之間熒光素酶相對活性無顯著差異(1.01±0.14 vs 0.98±0.23,P>0.05)。

圖4 lncRNA SNHG7和miR-122-5p間的結合位點

3 討 論

近年來胃癌在我國發病率一直很高,因早期難以診斷,患者進行治療時大多數已發展到中晚期,常規的手術切除、放化療等治療手段預后很難達到預期,導致患者死亡率也一直處于高水平,如今免疫治療在臨床中越來越受重視,因此積極探尋提升免疫治療療效的策略具有重要臨床意義〔12,13〕。SNHG7參與了胰腺癌、神經母細胞瘤、結直腸癌等人類多種癌癥的發生和發展,與各種腫瘤患者的預后不良密切相關,SNHG7的高表達與不良總體生存率顯著正相關,促進腫瘤惡性進展〔14〕;SNHG7在包括胃癌在內的癌癥中顯著上調,沉默SNHG7可顯著致敏對順鉑耐藥的胃癌細胞,促進其糖酵解速率及凋亡〔4〕;敲低SNHG7還可阻滯卵巢癌細胞周期,增強其對紫杉醇的敏感性,抑制其細胞活力、遷移和侵襲〔15〕。本研究結果表明,lncRNA SNHG7參與調控胃癌細胞增殖、凋亡及其進展過程,敲低SNHG7可降低胃癌細胞株MKN-45的增殖活性,減輕其免疫逃逸,增強活化CD8+T細胞殺傷力,上調凋亡點半表達,促使胃癌細胞凋亡,最終對胃癌起到明顯的抗癌作用。

miR-122-5p在肝癌、胃癌中明顯下調,對病情進展起著重要作用,恢復miR-122-5p的表達可顯著抑制肝癌細胞增殖,在體外降低胃癌細胞增殖和轉移活性,并抑制胃癌腫瘤在體內的生長〔16,17〕。CCND1在腫瘤發生及進展中具有關鍵作用,CCND1在胃癌組織中明顯高表達,下調CCND1可導致胃癌細胞周期停滯和生長抑制,并顯著抑制其細胞增殖、遷移和侵襲,進而延緩其腫瘤在體內的惡性進展〔18,19〕。在乳腺癌患者體內,miR-122-5p可能通過調控CCND1的表達影響其體質量指數和腫瘤的復發〔9〕。在肝癌細胞內,SNHG7可下調miR-122-5p,進而增強其增殖及轉移〔10〕,并可通過促進神經母細胞瘤中CCND1表達起到致癌作用〔20〕。因而,可推測調控miR-122-5p/CCND1軸可能是敲低SNHG7抑制胃癌細胞的增殖及腫瘤免疫逃逸并促進其凋亡的分子機制。本研究結果證實,miR-122-5p/CCND1介導SNHG7對MKN-45細胞增殖、凋亡及腫瘤免疫逃逸的調控過程。本研究結果還表明,降低miR-122-5p表達可拮抗SNHG7的敲低對MKN-45細胞增殖的抑制作用,削弱其對MKN-45細胞的促凋亡與抗腫瘤免疫逃逸作用,最終逆轉其對胃癌的抗癌作用,揭示敲低SNHG7可抑制胃癌細胞增殖及腫瘤免疫逃逸并促進其凋亡是通過上調miR-122-5p表達實現的。