蓮子心總生物堿及總生物堿高氯酸鹽對MG63細胞遷移和遷移體生成的影響

林立男，熊 梅，曾建偉，周 芬，蔡 雯，許仲坤，黃美雅，蔡良知，黃云梅，3*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；4.福建中醫藥大學科技創新與轉化中心，福建 福州 350122；5.福建中醫藥大學《福建中醫藥》雜志社，福建 福州 350122；6.福建省婦幼保健院，福建 福州 350001）

蓮子心為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）成熟種子中的干燥幼葉及胚根。現代研究表明蓮子心中提取的總生物堿（total alkaloids of Lianzixin，TAL）活性成分對多種腫瘤細胞增殖具有明顯的抑制作用［1-3］。但TAL 溶解度小，穩定性差，將TAL 制成蓮子心總生物堿高氯酸鹽（total alkaloids of Lianzixin perchlorate，TALP）后可大大提高其溶解度和穩定性，但其藥效是否發生變化需要實驗探討。骨肉瘤（osteosarcoma，OS）作為原發于骨組織中發病率最高的惡性腫瘤，其轉移率高，治療上存在有效治療藥物少、缺少特異性靶點等問題［4］。研究發現多種惡性腫瘤細胞在遷移過程中尾部會產生一種特殊的結構——遷移體［5］，腫瘤細胞遷移體可通過影響巨噬細胞分化誘導腫瘤細胞免疫逃逸［6］，抗腫瘤納米藥物可通過與遷移體結合抑制腫瘤細胞轉移［7］，提示遷移體可能成為腫瘤治療的潛在靶點。但骨肉瘤細胞中是否存在遷移體，TAL 和TALP 是否抑制其遷移和遷移體產生未見報道。本研究擬應用TAL 和TALP 干預骨肉瘤MG63細胞，檢測MG63 細胞增殖和遷移情況，了解其遷移過程中是否產生遷移體及藥物對遷移體產生的影響，并探討TAL 和TALP 治療骨肉瘤的相關作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞與藥物 MG63 細胞購自中國科學院細胞庫。蓮子心藥材購自福建文鑫蓮業有限公司，經福建中醫藥大學藥學院楊成梓教授鑒定為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）干燥幼葉及胚根。TAL 由1 kg 蓮子心粉碎，過60 目篩，分別加70%乙醇3 L 回流提取2 次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮，得浸膏85 g，上硅膠柱，收集氯仿-三乙胺（9∶1）的洗脫液，濃縮，干燥，得TAL 粉末。取TAL 適量，加70%～72%高氯酸溶液反應，經二氯甲烷萃取，濃縮，得TALP 粉末。

1.2 實驗試劑 α-MEM 培養基（批號：G4554）、丙酮酸鈉溶液（批號：G4212）、電鏡固定液（批號：G1102）均購自武漢賽維爾生物技術有限公司；胎牛血清（批號：10270-106）和0.25%胰蛋白酶（批號：25200-056）均購自美國Gibco 公司；4%臺盼藍染色液（批號：BL627L）和細胞增殖-毒性檢測試劑盒（批號：521942）均購自安徽白鯊生物科技有限公司；細胞三抗（上海漢恒生物科技有限公司，批號：HB-PPS-100）；無菌PBS（武漢博士德生物工程有限公司，批號：PYG0021）；無血清細胞凍存液（蘇州新賽美生物科技有限公司，批號：C40100）；纖連蛋白（北京索萊寶科技有限公司，批號：F8180）；小麥胚芽凝集素（WGA，美國Life Techologies 公司，批號：W11262）。

1.3 實驗儀器 自動細胞計數儀（中國睿鈺生物科技有限公司，型號：Countstar tigel 53）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司，型號：DMI8）；多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號：Multi-skan FC）；高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，型號：GL-21M）；激光掃描共聚焦顯微鏡（德國ZEISS 公司，型號：Zeiss710）；透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司，型號：H7650）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 MG63 細胞用α-MEM 完全培養基（α-MEM＋10%新鮮胎牛血清＋1%丙酮酸鈉溶液＋1%細胞三抗），在37 ℃、5%CO2培養箱中培養，3 d 傳代1 次。

2.2 CCK8 法檢測細胞增殖率 分別取1 mg TAL和TALP 粉末溶于10 μL DMSO，然后加入10 mL α-MEM 完全培養基，混勻，0.22 μm 過濾器過濾，得到100 μg/mL 含藥培養基，再用α-MEM 完全培養基分別稀釋成10、20、40、60、80 μg/mL TAL 和TALP培養液。取96 孔板4 個，按照4×103個/孔接種細胞，分為空白組、TAL 組和TALP 組，過夜細胞貼壁后，空白組加入不含藥物的α-MEM 完全培養基，TAL 組和TALP 組以含10、20、40、60、80、100 μg/mL分別加入TAL 和TALP 培養液，每個濃度設置6 個復孔；24、48 h 后棄去舊培養基，每個孔加入90 μL新α-MEM 完全培養基和10 μL CCK8 溶液，于培養箱中孵育3 h，用酶標儀在450 nm 波長處測定吸光度（OD 值），計算不同濃度TAL 和TALP 培養液對細胞增殖率的影響。增殖率＝（實驗組OD 值/空白組OD 值）×100%。運用GraphPad prism 8 軟件，以增殖率為縱坐標、劑量的對數為橫坐標，繪制二者的量-效關系曲線，并求出增殖率為50%時所對應的劑量，即為細胞的半數抑制濃度（IC50）。

2.3 劃痕實驗 取12 孔板，每個孔接種2×105個細胞培養過夜，使其貼滿每個孔底部。用200 μL的槍頭垂直于孔板劃線，然后棄去培養液，用PBS沖洗2 遍。空白組加入對照培養基（α-MEM 培養基＋1%胎牛血清），TAL 組和TALP 組在對照培養基的基礎上為避免藥物對細胞活力的影響，根據CCK8實驗結果，取24 h IC50的50%劑量約為50.0 μg/mL稀釋成不同濃度的含藥培養基來培養細胞，即TAL組和TALP 組以50.0、25.0、12.5、6.25 μg/mL 濃度分別加入TAL 和TALP 培養液，細胞培養0 、24 h 后分別拍照記錄。用ImageJ 軟件測量細胞間0 h 和24 h劃痕面積并計算遷移率和遷移抑制率：遷移率＝（0 h 劃痕面積－24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%；遷移抑制率＝（1－藥物組遷移率/對照組遷移率）×100%。運用GraphPad prism 8 軟件，以遷移抑制率為縱坐標，藥物濃度的對數（logC）為橫坐標，繪制二者的量-效關系曲線，求出遷移抑制率為50%時所對應的劑量，用于遷移體計數實驗。

2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察遷移體生成和生長情況

2.4.1 靜態觀察遷移體顯微形態 在35 mm 玻底培養皿中加入5 μg/mL 纖連蛋白溶液1 mL，室溫孵育1 h后吸棄；每皿種3×104個細胞，37 ℃，5% CO2培養箱培養15～20 h，用-20 ℃ 甲醇在室溫固定10 min；再用PBS 輕輕蕩洗3 次，每次3 min，用5.0 μg/mL WGA 染液室溫孵育15 min 來標記細胞［8］，用PBS 輕輕蕩洗3 次，每次3 min。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察MG63 細胞遷移體的顯微形態。

2.4.2 動態觀察遷移體生長過程 按照“2.4.1”項下方法進行纖連蛋白鋪皿并接種細胞后，加入含5.0 μg/mL WGA 的完全培養基，37 ℃，5%CO2培養箱培養15～20 h，在激光掃描共聚焦顯微鏡下實時觀察細胞遷移體的生長過程，每隔20 min拍照1次。

2.5 遷移體的提取及其超微結構觀察 取40 個150 mm 的細胞培養皿各加入5 μg/mL 纖連蛋白溶液10 mL，室溫孵育1 h 后吸棄；每皿接種8×105個細胞，混勻，37 ℃，5%CO2培養箱培養15～20 h；將細胞消化后收集在50 mL 離心管中，以1 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液；以4 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液；以18 000 r/min、4 ℃離心30 min，去上清。收集到的遷移體通過電鏡固定液固定、樹脂包埋、超薄切片和鉛-鈾染色后，于透射電子顯微鏡下觀察遷移體超微結構并拍照。

2.6 藥物干預和遷移體計數 按照“2.4.1”項下方法進行纖連蛋白鋪皿并接種細胞，分為空白組、TAL 組和TALP 組，空白組不加藥物，TAL 組和TALP 組根據劃痕實驗結果，取細胞遷移抑制率約為50%時的藥物濃度，即15 μg/mL TAL 培養液、20 μg/mL TALP 培養液進行干預15～20 h 后，按照“2.5”項下方法進行WGA 染色，激光掃描共聚焦顯微鏡下拍照，每組取12 個細胞計數，計算每個細胞遷移體的平均數量。

2.7 統計學方法 采用SPSS 24.0統計軟件進行數據處理。計量資料屬正態分布的以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 各組細胞增殖情況 與空白組比較，40、60、80、100 μg/mL TAL 干預24 h 后細胞增殖率明顯下降（P＜0.05），且TAL 濃度越大細胞增殖率下降越明顯，見圖1。20、40、60、80、100 μg/mL TAL 干預48 h 后細胞增殖率顯著下降（P＜0.05），且TAL 濃度越大細胞增殖率下降越明顯，見圖2。

圖1 TAL 干預24 h 對MG63 細胞增殖率的影響

圖2 TAL 干預48 h 對MG63 細胞增殖率的影響

與空白組比較，40、60、80、100 μg/mL TALP 干預24 h 和48 h 后細胞增殖率均顯著下降，且TALP濃度越大細胞增殖率下降越明顯，見圖3 和圖4。

圖3 TALP 干預24 h 對MG63 細胞增殖率的影響

圖4 TALP 干預48 h 對MG63 細胞增殖率的影響

3.2 各組細胞遷移情況 與空白組比較，TAL 和TALP 干預濃度＞12.5 μg/mL 時可顯著抑制細胞遷移，見圖5和圖6。細胞遷移抑制率為50%時TAL和TALP藥物濃度分別為15.05 μg/mL和20.16 μg/mL，見圖7。

圖6 TAL 和TALP 干預后MG63 細胞遷移率變化

圖7 藥物濃度的對數與遷移抑制率量效曲線

3.3 遷移體顯微形態 WGA 染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察可見細胞尾部有長長的細絲狀結構，即為收縮絲；在收縮絲的尖端或交叉點上可見膨大的囊泡狀結構，即為遷移體。見圖8。

圖8 MG63 細胞遷移體顯微形態

3.4 遷移體生長的動態過程 通過連續觀察拍攝MG63 細胞遷移，可見收縮絲末端或交叉處的囊泡從無到有、從小到大的生長過程。見圖9。

圖9 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察遷移體生長的動態過程

3.5 遷移體超微結構 透射電鏡下可見提取的遷移體為類圓形結構，直徑在0.5～3.0 μm，表面為雙層膜包繞，內部可見數量不等的小囊泡，整個遷移體酷似石榴狀。見圖10。

圖10 透射電子顯微鏡下觀察遷移體超微結構

3.6 遷移體數量變化 空白組細胞形態舒展，收縮絲多而長，尾部或分叉處可見較多遷移體。與空白組比較，TAL 組和TALP 組細胞都出現不同程度收縮，收縮絲比空白組短而細，遷移體較稀疏，見圖11。結果顯示：與空白組比較，TAL 15 μg/mL 組和TALP 20 μg/mL 組細胞平均遷移體數量顯著減少（P＜0.05）。見圖12。

圖11 TAL 和TALP 干預后細胞遷移體變化

圖12 TAL 和TALP 干預后細胞遷移體數量變化

4 討 論

既往的研究表明蓮心堿及其衍生物對多種腫瘤細胞有抑制作用。曾建偉等［3］研究發現TAL 對人肝癌細胞株HepG2、胃癌細胞SGC-7901、乳腺癌細胞株MCF-7和結腸癌細胞RKO有明顯抑制作用。張錫宇［9］研究發現甲基蓮心堿可通過激活p38 MAPK 信號通路，磷酸化p-p21Ser130 而延長p21 蛋白半衰期，導致p21 蛋白在細胞內累積進而引起細胞周期G1 期停滯，抑制成骨肉瘤細胞生長。本研究發現TAL 對人骨肉瘤細胞MG63 的增殖有顯著抑制作用，TALP 對細胞的半數抑制濃度略高于TAL，但仍能顯著抑制MG63 細胞增殖，抗腫瘤藥效未發生本質變化。鑒于TALP 具有較高的穩定性，在實際應用中可能更有利于推廣。

惡性腫瘤除了增殖快，其難以治愈的重要原因之一是腫瘤細胞極易發生轉移，這與腫瘤細胞高度的遷移性能有關。為了進一步研究蓮子心總生物堿是否有抗腫瘤轉移的作用，我們應用劃痕實驗觀察其對細胞遷移的影響，發現與空白組比較，TAL 和TALP 干預均可顯著抑制MG63 細胞的遷移，提示TAL 和TALP 可能對骨肉瘤轉移有抑制作用。

細胞遷移是細胞接收到遷移的信號或感受到某些物質的濃度梯度變化后產生的移動，由細胞前端偽足的延伸、前端偽足與細胞外基質形成新的黏附、胞體向前移動、后方黏附的釋放和細胞胞體收縮組成的一系列循環過程［10］。2015 年俞立教授團隊發現培養的細胞在遷移過程中，細胞的尾部會出現細長的收縮絲，且在尖端或分叉處可形成直徑為0.5～3.0 μm 的囊泡，透射電子顯微鏡下可見這些囊泡的內部還包含數量不等的小囊泡，整個結構類似于石榴，故將其命名為“石榴樣結構”。鑒于石榴樣結構的形成取決于細胞遷移過程，故正式命名為“遷移體”［5］。在后續的研究中，該團隊發現遷移體還廣泛存在于多種體細胞和腫瘤細胞中。本研究中我們發現MG63 細胞遷移過程中細胞尾部亦產生收縮絲和膨大的囊泡結構，并觀察到該囊泡在收縮絲上從無到有、從小到大的生長過程。為了進一步確認該結構的性質，我們通過梯度離心提取囊泡，在透射電子顯微鏡下觀察到遷移體的石榴樣結構，表明人骨肉瘤細胞MG63 確實在遷移過程中產生遷移體。

遷移體在細胞遷移過程中產生，并在細胞離開后可留在原處一段時間，從而保留了細胞遷移過程的時間和空間信息。同時遷移體內部包含豐富的蛋白和基因等內容物，這些內容物最終將在遷移體裂解后釋放到細胞外，或隨著遷移體直接被周圍的細胞攝取，從而傳遞相應的信息。遷移體包含的時空信息以及蛋白和基因等都可能影響后續相關細胞的遷移或其他功能活動［11-12］。本研究發現TAL和TALP 干預MG63 細胞后，遷移體產生的數量顯著減少，提示TAL 和TALP 可能通過抑制細胞遷移體的生成，影響后續腫瘤細胞的功能活動，從而改善骨肉瘤的預后。本研究僅對藥物干預后MG63細胞遷移與遷移體形成的變化進行了初步探討，遷移體生成的變化如何影響腫瘤生長和轉移的具體機制有待進一步深入研究。

綜上所述，TAL 和TALP 對骨肉瘤MG63 細胞的增殖和遷移有抑制作用；在MG63 細胞遷移時可產生遷移體，而TAL 和TALP 的干預則能夠顯著減少遷移體數量：因此TAL 和TALP 抑制MG63 骨肉瘤細胞的機制可能與其影響遷移體的產生有關。