HPLC-VWD法測定鉤藤不同部位4種化學成分的含量

徐鮮鈞，文佳珂，李 晉

（1.福建省武夷山生物研究所，福建 南平 354300；2.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617）

鉤藤為茜草科植物鉤藤［Uncaria rhynchophylla（Miq.） Miq. ex Havil.］、大葉鉤藤［Uncaria macrophylla Wall.］、毛鉤藤［Uncaria hirsuta Havil.］、華鉤藤［Uncaria sinensis （Oliv.） Havil.］或無柄果鉤藤［Uncaria sessilifrudus Roxb.］的干燥帶鉤莖枝，具有清熱平肝、熄風止痙的功效［1］。有研究表明：鉤藤具有抗氧化、抗壓、抗癲癇、抗焦慮、抗抑郁等多重藥理作用［2-7］，臨床常用來治療神經及心血管系統疾病［8-9］，如高血壓、癲癇、阿爾茨海默病等［10-11］。鉤藤化學成分較復雜，主要含有生物堿、黃酮、三萜、酚類等，其中生物堿類成分［12］，尤其是鉤藤堿與異鉤藤堿被認為是鉤藤發揮降壓作用的主要活性成分［13］。然而，鉤藤中的其他成分，如異去氫鉤藤堿、毛鉤藤堿以及一些酚酸類成分（綠原酸、隱綠原酸等）也存在降壓活性［14-16］。

本研究以綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿4 種化學成分為考察指標，對2 個產地鉤藤3 個不同部位（根、葉、帶鉤莖枝）的化學成分含量進行研究，通過含量差異分析，為鉤藤質量研究及進一步的資源開發提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；G1314A1200 VWD 檢測器（美國Agilent 公司）；超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；200T 粉碎機（武義海納電器有限公司）；MSA225P-0CE-DU 十萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；Milli-Q academic 超純水機（美國Millipore 公司）。

1.2 材料 超純水（美國Millipore 公司）；甲酸（美國Anaqua Chemicals Supply 公司）；乙腈和甲醇（天津市康科德科技有限公司）。鉤藤藥材采集于福建省武夷山市五夫鎮和上梅鄉，經曬干或烘干后用于實驗，經天津中醫藥大學常艷旭教授鑒定為鉤藤［Uncaria rhynchophylla （Miq.） Miq. ex Havil.］。

1.3 對照品 綠原酸（批號：DSTDL002101）、異去氫鉤藤堿（批號：DST200825-018）、毛鉤藤堿（批號：DST210201-009），純度均＞98.0%，均自購于成都德斯特生物技術有限公司；隱綠原酸（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-1803240，純度≥99.07%）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）。梯度洗脫，洗脫梯度為：0～5 min，5%～9%（B）；5～14 min，9%～9%（B）；14～23 min，9%～14%（B）；23～35 min，14%～18%（B）；35～55 min，18%～18%（B）；55～86 min，18%～35%（B）；86～88 min，35%～95%（B）。流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；波長：254 nm；進樣體積：10 μL。鉤藤樣品溶液及混合對照品溶液色譜圖見圖1。

圖1 鉤藤混合對照品溶液及樣品溶液色譜圖

2.2 供試品溶液的制備 武夷山市五夫鎮和上梅鄉生產的鉤藤鮮品曬干或烘干后，將其根、葉、帶鉤莖枝粉碎，過50 目篩，精密稱取藥材粉末0.50 g，加75%甲醇10 mL，超聲（350 W，40 KHz）1 h，離心，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿對照品各1.00 mg，加甲醇配成濃度為1 mg/mL 對照品溶液，儲存于4 ℃冰箱中備用。

2.4 供試品溶液的制備與考察

2.4.1 提取條件優化 ① 提取溶液濃度的選擇：以4 種化合物總提取量為評價指標，當提取功率250 W、提取時間為40 min 時，分別考察25%、50%、75%甲醇及純甲醇溶液對鉤藤中綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿4 種化合物提取量的影響；② 提取時間優化：以4 種化合物總提取量為評價指標，當提取溶劑為75%甲醇溶液、提取功率250 W 時，考察提取時間為40、50、60、70 min 時對4 種化合物提取量的影響；③ 提取功率優化：以4種化合物總提取量為評價指標，當提取溶劑為75%甲醇溶液，提取時間60 min 時，考察超聲功率為150、250、350、450W 時對4 種化合物提取量的影響。結果顯示：75%甲醇溶液為最佳提取溶劑，60 min 為最佳提取時間，350 W 為最佳提取功率。

2.4.2 線性關系考察 取“2.3”項下的對照品溶液，配制綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿濃度分別為400、20、200、200 μg/mL 混合對照品溶液，再稀釋成不同濃度的系列混合對照品溶液。按“2.1”項下條件分析，以峰面積為Y 坐標，對照品濃度為X 坐標，繪制標準曲線，得到4 種化學成分的線性回歸方程及線性范圍，結果見表1。4 種化學成分在各自線性范圍內線性關系良好。

表1 4種化學成分的線性關系考察結果

2.4.3 精密度考察 精密吸取鉤藤葉部位的同一供試品溶液，連續進樣6 次，記錄峰面積。綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿4 種化合物峰面積的RSD 分別為2.77%、3.43%、4.84%、4.38%，保留時間的RSD 分別為0.05%、0.05%、0.03%、0.02%（n＝6）。4 種化合物峰面積和保留時間的RSD 均在5%以內，表明該方法精密度良好。

2.4.4 穩定性考察 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 時進樣分析，記錄峰面積。綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿及毛鉤藤堿4 種化合物峰面積的RSD 分別為1.59%、2.38%、2.34%、4.62%，保留時間的RSD分別為0.22%、0.24%、0.11%、0.06%（n＝6）。4 種化合物峰面積和保留時間的RSD 均在5%以內，表明供試品溶液在室溫下24 h 內穩定性良好。

2.4.5 重復性考察 取同一批藥材，按“2.2”項下供試品制備方法同時制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析，計算綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿及毛鉤藤堿含量，并計算4 種化合物的RSD 分別為1.28%、1.89%、2.64%、0.95%，表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率考察 取鉤藤葉粉末6 份，每份12.5 mg，精密稱定，分別精密加入綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿、毛鉤藤堿的對照品適量，各成分對照品的加入量與樣品中各成分的含量相當；按“2.2”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進行測定，計算各化合物的加樣回收率及RSD。綠原酸，隱綠原酸，異去氫鉤藤堿，毛鉤藤堿的加樣回收率分別為97.0%、97.3%、102%、99.5%，RSD 分別為1.62%、2.50%、0.72%、1.29%。

2.5 樣品含量測定 取2 個產地鉤藤不同部位，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進行測定，計算綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿及毛鉤藤堿含量，結果見表2。2 個產地鉤藤不同部位4 種化合物含量存在差異：綠原酸、隱綠原酸在葉中含量較高，毛鉤藤堿在根部含量較高；此外，異去氫鉤藤堿在根部的含量相比于在帶鉤莖枝和葉2 個部位，含量相對較低。

表2 2 個產地鉤藤不同部位4 種化學成分的含量 mg/g

3 討 論

本團隊通過對福建省武夷山市7 個鄉鎮野生鉤藤藥材資源的調查發現：五夫鎮和上梅鄉2 個地區的野生鉤藤較為豐富。目前，關于該地區野生鉤藤資源的研究尚未報道，因此，采用穩定可靠的分析方法，深入研究該產區野生鉤藤質量，對進一步促進野生鉤藤藥材資源開發具有重要意義。故本研究以上述兩地的鉤藤為研究對象，通過優化的供試品溶液制備方法，來明確兩地鉤藤不同部位的綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿含量情況。

3.1 供試品溶液制備方法優化 本實驗分別考察25%、50%、75%甲醇及純甲醇溶劑，提取時間及提取功率對鉤藤中綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿提取量的影響。以4 種化合物總提取量為評價指標，當提取溶劑為75%甲醇溶液（提取功率250 W，提取時間40 min），4 種化合物含量最高；提取時間60 min（提取溶劑為75%甲醇溶液，提取功率250 W），4 種化合物含量與70 min 相當，表明60 min 基本提取完全；提取功率350 W 時（提取溶劑為75%甲醇溶液，提取時間60 min），4 種化合物含量均高于其他提取功率。故供試品溶液制備方法最終確定為：以75%甲醇溶液為提取溶劑，超聲提取60 min，提取功率為350 W。

3.2 含量差異分析 本實驗建立了同時測定鉤藤中4 種化學成分含量的HPLC-VWD 分析方法，經方法學驗證，該方法穩定可靠。同時對比了4 種化學成分在鉤藤3 個不同部位（根、葉、帶鉤莖枝）的含量，結果表明：2 種有機酸（綠原酸和隱綠原酸）在葉中含量較多，毛鉤藤堿在根部含量較高，而異去氫鉤藤堿在根部含量較低，2 個產地鉤藤的實驗結果相一致。此外，對比2 個產地鉤藤4 種化學成分的含量：上梅鄉鉤藤葉部的綠原酸含量高于五夫鎮鉤藤，隱綠原酸含量則相反；五夫鎮鉤藤葉和根部的異去氫鉤藤堿含量均高于上梅鄉鉤藤，帶鉤莖枝部的則相反，且五夫鎮鉤藤根部的毛鉤藤堿含量高于上梅鄉鉤藤。

本實驗通過建立HPLC-VWD 含量測定方法，對鉤藤不同部位的4 種化學成分含量進行測定，方法學考察結果表明：本實驗建立的同時測定鉤藤中綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿含量的HPLC-VWD 分析方法精密度高、穩定性好，可用于鉤藤中化學成分含量測定。這為鉤藤藥材的質量標準完善提供了參考。