HPLC法測定楊梅樹不同藥用部位的楊梅苷含量

劉 娥，鄒福賢，范世明

（1.福建醫科大學附屬第二醫院，福建 泉州 362000；2.福建中醫藥大學范世明中醫藥傳承工作室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學附屬泉州市正骨醫院，福建 泉州 362000；4.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

楊梅（Morella rubra Lour.）的栽培歷史超過2 000 年，藥用歷史超過1 700 年，楊梅根、根皮、樹皮、枝、葉和果實均可入藥［1］?！侗静菥V目》記載楊梅果實去痰、止嘔噦、消食下酒，樹皮及根主治惡瘡疥癩、牙痛。此外《貴州草藥》《江西民間草藥驗方》《福建藥物志》也均有記載楊梅不同藥用部位的功效主治，主要為行氣活血、通關開竅、消腫解毒，主治跌打損傷、骨折、外傷出血等疾病［2-4］。楊梅主要含有豐富的黃酮類成分，如楊梅苷、楊梅素、楊梅醇、槲皮素、槲皮苷、蘆丁和山柰素等，其中楊梅苷含量遠高于其他成分［5-8］。現代藥理研究表明楊梅苷具有抗菌［9］、抗氧化［5，10］、抗病毒［11］、抗腫瘤［12］、降血糖［13］及鎮痛［14］作用，能夠抑制破骨細胞分化［15］，改善心肌收縮功能，抑制細胞凋亡［16］，說明楊梅苷為楊梅樹的活性成分之一。

然而，目前關于楊梅的研究多集中在其果實風味，關于其不同藥用部位活性成分的研究較少［17］。此外楊梅樹每年均需修枝剪葉，產生大量的楊梅樹藥材資源，若能充分利用起來將有利于中藥資源的可持續發展，避免極大的浪費，因此本研究擬對楊梅樹的不同藥用部位進行楊梅苷含量測定，為深入開發楊梅藥用資源奠定基礎。

1 材 料

1.1 儀器 KQ-500VDY 型醫用超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；PX225DZH 十萬分之一電子分析天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；FA1204B 萬分之一電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；Essentia LC-16 高效液相色譜儀（日本SHIMADZU 公司；SPD 紫外檢測器、Milli-Q 超純水儀均購自德國Merck 集團。

1.2 試劑與藥材 楊梅苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≥95.2%，批號：111806-201703）；色譜純乙腈（天津市康科德科技有限公司）；色譜純甲醇（國藥集團化學試劑有限公司）；超純水經Milli-Q 超純水儀處理；3 批楊梅樹樣品均采自福建省南安市，經范世明正高級實驗師鑒定其基源為楊梅科植物楊梅（Morella rubra Lour.）。楊梅果根據其顏色、硬度和大小分為5 個成熟階段：楊梅果Ⅰ期表面呈現淡粉色和青色，縫合線明顯，肉柱連接緊密，果實直徑＜1 cm；楊梅果Ⅱ期表面淡粉色，略有泛白，肉柱連接緊密，果實直徑與Ⅰ期變化不大；楊梅果Ⅲ期表面粉色，部分紅色，肉柱連接緊密，果實開始膨大；楊梅果Ⅳ期表面紅色，色澤均勻，肉柱軟硬適中，果實直徑超過1 cm；楊梅果Ⅴ期表面為暗紅色，色澤均勻，肉柱軟潤飽滿，果實直徑超過1 cm［18-20］。見圖1。

圖1 楊梅果的不同分期

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備 分別取3 批楊梅樹的不同藥用部位（根木質部、根韌皮部、樹韌皮部、枝韌皮部、枝木質部、葉、果）的干燥粗粉各3 份，每份0.5 g，精密稱定后置于錐形瓶中，加入甲醇30 mL；稱定整個錐形瓶及溶液質量，隨后置于超聲波清洗器中超聲（40 ℃，45 kHz）處理30 min；取出錐形瓶，冷卻至室溫，再稱定整個錐形瓶及溶液質量；用甲醇補足減失的質量，搖勻，將溶液過0.45 μm 微孔濾膜，取過濾的中段溶液作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取純度為95.2%的楊梅苷對照品10.22 mg 置于10 mL 量瓶中，加入甲醇溶解，定容，搖勻，制成0.972 9 mg/mL 溶液，作為對照品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱：Ultimate?XB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）等度洗脫10 min，設置流速為1 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為260 nm，進樣量為10 μL。分別取不同藥用部位的供試品溶液和對照品溶液，按上述色譜條件進樣，色譜圖見圖2。結果顯示：楊梅苷色譜峰對稱，與相鄰色譜峰分離度良好，基線平穩，理論板數均不低于20 000，表明該方法專屬性強。

圖2 楊梅不同藥用部位樣品色譜圖

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下配制的對照品溶液適量，加甲醇逐級稀釋，搖勻，分別配成3.891 8、11.675 0、19.459 0、48.647 0、97.294 0、194.590 0 μg/mL 對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，測定結果以楊梅苷濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，計算得到線性回歸方程為Y＝2.787 6×104X－2.461 0×104，r＝0.999 9，表明楊梅苷濃度在3.891 8～194.590 0 μg/mL內與峰面積呈良好線性關系。

2.5 精密度考察 精密吸取“2.4”項下配制的48.647 0 μg/mL 對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續測定6 次，記錄峰面積。結果顯示：楊梅苷的峰面積RSD 為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性考察 通過對楊梅根的韌皮部和木質部進行質量檢測，發現楊梅根中韌皮部與木質部的質量占比為15∶85，故將根韌皮部與根木質部粗粉按質量比15∶85 混合均勻作為混合樣品。取1 份混合樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。結果顯示：楊梅苷的峰面積RSD 為0.260 0%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內穩定性良好。

2.7 重復性考察 取“2.6”項下方法制作的混合樣品6 份，每份0.500 0 g，按“2.1”及“2.3”項下方法制備供試品溶液并進行含量測定，記錄峰面積，按線性回歸方程計算樣品中楊梅苷含量。結果顯示：6份樣品楊梅苷平均含量為0.240 0%，RSD 為1.590 0%，表明本方法重復性良好。

2.8 準確度考察 取“2.6”項下方法制作的混合樣品6 份，每份0.250 0 g，精密稱定，再分別向每份樣品中精密加入濃度為0.972 9 mg/mL 楊梅苷對照品溶液0.600 0 mL。按“2.7”項下楊梅苷平均含量占比結果計算樣品中楊梅苷原有含量，按“2.1”及“2.3”項下方法制備供試品溶液并檢測楊梅苷含量，同時計算回收率。結果顯示：楊梅苷的平均回收率為97.703 5%，RSD 為2.271 3%，表明本方法準確度良好。見表1。

表1 楊梅根部楊梅苷含量測定方法準確度考察

2.9 含量測定 分別取3 批楊梅的不同藥用部位樣品各3 份，按“2.1”及“2.3”項下方法制備供試品溶液并進行含量測定，記錄峰面積，按線性回歸方程計算樣品中楊梅苷含量，記錄3 批楊梅不同藥用部位樣品的平均值，見表2。結果顯示：楊梅不同藥用部位中楊梅苷含量在0.043 0%～13.917 0%，各個藥用部位楊梅苷含量差別較大，樹韌皮部＞根韌皮部＞枝韌皮部＞葉＞枝木質部≈根木質部＞果；楊梅果隨著成熟度的增加，楊梅苷含量在逐漸降低。

表2 楊梅樹不同藥用部位中楊梅苷含量測定結果

3 討 論

3.1 HPLC 方法優化 不同文獻中楊梅苷含量測定時所選擇的檢測波長并不相同，有260、358、360 nm［21-24］。因此，為確定楊梅根中楊梅苷的最佳檢測波長，本研究將供試品溶液和對照品溶液在200～400 nm 波長范圍內進行檢測，發現楊梅苷在225、260、350 nm 處有波峰，而225 nm 處于紫外檢測末端，容易產生干擾，260 nm 處吸收強度高于350 nm，且供試品溶液在260 nm 下楊梅苷色譜峰附近無其他色譜峰干擾，因此選擇260 nm 作為檢測波長，檢測結果更加靈敏。此外，本研究所確定的流動相洗脫程序為等度洗脫，相比于其他文獻中的梯度洗脫［20］，基線更為平穩，檢測結果更加準確。

3.2 楊梅不同藥用部位楊梅苷含量比較 有文獻報道楊梅葉中楊梅苷含量為1.430 0%［21］，果實中含量為0.041 3%［22］，與本研究所測得結果較為接近。通過對楊梅不同藥用部位的楊梅苷含量測定發現：楊梅苷主要集中在韌皮部，而又以樹韌皮部中含量最高，是根韌皮部或者枝韌皮部的3～5 倍；果實中含量最低，平均含量在0.066 9%，僅為樹韌皮部的1/200。因此，根據楊梅苷的藥理作用，若要發揮其抗菌、降血糖、鎮痛等方面的療效，應當選擇楊梅樹韌皮部入藥。

綜上所述，本研究建立了一種簡便快捷的HPLC 方法以便于測定楊梅樹中楊梅苷含量，該方法明確了楊梅樹不同藥用部位中楊梅苷含量的分布，其中以韌皮部和葉中含量最高，這為楊梅果樹修枝剪葉所產生的大量枝條再利用和深入開發提供了實驗基礎，有助于中藥資源的可持續發展。