乳酸脅迫對(duì)Pichia kudriavzevii 固態(tài)發(fā)酵特性的影響

潘婉舒，林曉芳，楊小平，徐 洋，侯 鑫

（1.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川宜賓 644000；2.四川省春源品悟酒業(yè)有限公司，四川成都 611530；3.玉蟬集團(tuán)有限公司，四川瀘州 646603）

發(fā)酵食品中，酵母與乳酸菌的相互作用一直是研究的熱點(diǎn)[1]，如：改善產(chǎn)品風(fēng)味、改善食品益生特性與質(zhì)構(gòu)、提高酒類發(fā)酵效率等。濃香型白酒糟醅乳酸含量高達(dá)20～100 g/kg，可作為研究乳酸環(huán)境酵母生長(zhǎng)代謝的范例。庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）是濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)酵母[2-5]，可產(chǎn)有機(jī)酸、酯類和酚類等多種濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)，改善酒體風(fēng)味[6-7]，對(duì)濃香型白酒產(chǎn)量及品質(zhì)有重要影響。

在濃香型白酒這一多微共酵發(fā)酵體系中，P.kudriavzevii的生長(zhǎng)代謝受到多種生化及環(huán)境因子的影響，特別是乳酸。乳酸是濃香型白酒發(fā)酵糟醅中含量最高的有機(jī)酸[8-10]，且其含量不僅與微生物產(chǎn)酸有關(guān)，還受蒸酒壓力、時(shí)間的影響，故不同窖池乳酸含量存在差異[11-14]。Deng 等[11]研究發(fā)現(xiàn)乳酸會(huì)抑制白酒中核心酵母生長(zhǎng)代謝，同時(shí)酵母可通過(guò)降解乳酸來(lái)適應(yīng)此種乳酸脅迫。張勤等[15]篩選到2 株可在含68 g/L 乳酸中生長(zhǎng)良好的耐酸酵母菌株，能夠降解環(huán)境中的酸，說(shuō)明酵母應(yīng)對(duì)乳酸脅迫的重要機(jī)制為降解乳酸。還有研究發(fā)現(xiàn)一些耐乳酸酵母菌株具有較強(qiáng)維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性和積累海藻糖及麥角固醇的能力，這也是其對(duì)抗乳酸的重要作用機(jī)理[16]。乳酸的生成會(huì)影響發(fā)酵環(huán)境pH，不同酵母的最適產(chǎn)酒、產(chǎn)酯pH 存在差異，進(jìn)而影響糟醅中酵母代謝產(chǎn)物[17]，這種差異對(duì)糟醅中酵母的生長(zhǎng)代謝有何影響，至今尚無(wú)定論。

本研究針對(duì)1 株分離自濃香型白酒糟醅、產(chǎn)香性能優(yōu)良的P.kudriavzevi菌株，分別在不同乳酸濃度的YNB 培養(yǎng)基及五糧粉培養(yǎng)基培養(yǎng)P.kudriavzevi菌株，檢測(cè)其在碳源和氮源利用率、耐高溫以及代謝產(chǎn)物等方面的差異，探究乳酸脅迫對(duì)P.kudriavzevii菌株發(fā)酵性能的影響，為其生產(chǎn)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Pichia kudriavzevii菌株P(guān)Y1 分離自濃香型白酒糟醅，現(xiàn)保存于固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；根霉粉 安琪酵母股份有限公司；發(fā)酵原料：五糧粉（高粱36%、大米22%、糯米18%、小麥16%、玉米8%）、糠殼 四川省春源品悟酒業(yè)有限公司；五糧固體培養(yǎng)基（100 g/18 mL）：五糧粉80 g、糠殼20 g，混勻蒸制備用，補(bǔ)加18 mL 無(wú)菌水；五糧液體培養(yǎng)基（100 g/200 mL）：五糧粉80 g、糠殼20 g，混勻蒸制備用，補(bǔ)加200 mL 無(wú)菌水；YNB-乳酸培養(yǎng)基：在YNB 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，使用前按比例添加過(guò)0.22 μm濾膜的乳酸；WL 培養(yǎng)基、YPD 培養(yǎng)基、YNB 培養(yǎng)基青島海博生物科技有限公司；乳酸、氯化鈉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、DNS 顯色劑、D-半乳糖、L-賴氨酸、L-組氨酸、L 亮氨酸等 分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；維生素B1、維生素B2、維生素B6純度≥98%，成都科龍?jiān)噭┯邢薰荆惶腔?夏盛酶生物技術(shù)有限公司。

SpectraMax M2 多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司）；A91plus 氣相色譜儀 常州磐諾儀器有限公司；Lynx6000 離心機(jī) 賽默飛世爾科技公司；MSDDR701 光學(xué)顯微鏡 邁時(shí)迪（東莞）科技有限公司；BSD-YX2200 搖床 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 將甘油保藏的PY1 酵母菌株無(wú)菌操作接種1 mL 至20 mL 的YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)2 d，采用平板劃線法接種至WL 固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2 d 分離，挑取適量純培養(yǎng)菌株至WL 培養(yǎng)基重復(fù)劃線接種，經(jīng)3 次劃線純化后，復(fù)接種于YPD 液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng)2 d 后獲得實(shí)驗(yàn)用菌液，放入4 ℃的冰箱中保藏備用。實(shí)驗(yàn)前挑取適量液體保存的PY1 酵母菌株至WL 培養(yǎng)基劃線接種，獲得PY1 酵母菌株單菌落。

1.2.2 乳酸對(duì)P.kudriavzevii菌株液、固態(tài)生長(zhǎng)的影響 液態(tài)培養(yǎng)：將PY1 酵母菌株單菌落接種到不含乳酸的YNB 培養(yǎng)基中，進(jìn)行不同乳酸濃度的連續(xù)培養(yǎng)（28 ℃ 2 d/階段），階段培養(yǎng)結(jié)束后按比例補(bǔ)加過(guò)0.22 μm 濾膜的乳酸，分別至乳酸濃度為20、40 g/L。階段培養(yǎng)結(jié)束后檢測(cè)酵母細(xì)胞存活率，再收集培養(yǎng)細(xì)胞，接種到不含乳酸（0 g/L）的YNB 培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)2 d，檢測(cè)酵母細(xì)胞存活率，探究不同濃度乳酸對(duì)酵母菌株存活率的影響，確定酵母菌株最大耐受乳酸添加量。

固態(tài)培養(yǎng)：將PY1 酵母菌株單菌落分別劃線接種于無(wú)乳酸和最大耐受（40 g/L）乳酸添加量的WL固體培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)2 d，觀察并記錄菌落形態(tài)變化。

存活率：液體和固體培養(yǎng)均采用無(wú)菌接種環(huán)挑取少許菌體于10 mL 無(wú)菌水中稀釋，混合均勻后吸取0.2 mL 稀釋液滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央，添加1 滴美藍(lán)染色劑，染色3 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體菌落、細(xì)胞形態(tài)并記錄死細(xì)胞數(shù)（染為藍(lán)色）和總細(xì)胞數(shù)目，按照公式計(jì)算存活率，計(jì)算公式如下[18]：

1.2.3 乳酸對(duì)P.kudriavzevii菌株高溫耐受性的影響 白酒糟醅發(fā)酵期間內(nèi)部醅溫可達(dá)到50 ℃，故出于實(shí)際應(yīng)用考慮，評(píng)估PY1 酵母菌株的生長(zhǎng)上限溫度。將PY1 酵母菌株單菌接種到Y(jié)NB 培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)溫度（44、46、48 ℃）培養(yǎng)2 d，以發(fā)酵結(jié)束后酵母菌數(shù)（OD560nm值）評(píng)估酵母菌株耐高溫特性。

1.2.4 乳酸對(duì)P.kudriavzevii菌株碳源利用的影響將PY1 酵母菌株單菌落依次劃線接種到添加20 g/L 乳酸和5 g/L 不同碳源（葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖、果糖、蔗糖）的YNB 培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)2 d，考查PY1 酵母菌株對(duì)不同碳源的利用情況。并設(shè)置不添加乳酸不同碳源YNB 培養(yǎng)基培養(yǎng)PY1酵母菌株作為對(duì)照組。發(fā)酵結(jié)束后，采用DNS 法[19]測(cè)定樣品中剩余糖含量，評(píng)估乳酸對(duì)PY1 酵母菌株不同碳源利用情況的影響。

1.2.5 乳酸對(duì)P.kudriavzevii菌株生長(zhǎng)因子作用效果的影響 五糧提取液制備：稱取2 kg 五糧粉與4 L 水煮至開(kāi)花，冷卻至40 ℃左右，加入2.8 g 糖化酶攪拌均勻，用紗布過(guò)濾。將濾液4000 r/min 離心5 min 備用。將PY1 酵母菌株單菌落分別接種到添加20 g/L 乳酸的五糧提取液和YNB 混合培養(yǎng)基（1:1，v/v）中，參照文獻(xiàn)[20]設(shè)置生長(zhǎng)因子。分別添加0.5 g/L 不同生長(zhǎng)因子（賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、磷酸氫二鈉、維生素B1、維生素B2、維生素B6），28 ℃下培養(yǎng)36 h，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中（0、12、24、36 h）酵母菌數(shù)（OD560nm值），并以酵母在560 nm 處的吸光度增加值（△OD增加值=OD測(cè)定值-OD0h），評(píng)估乳酸脅迫下PY1 酵母菌株對(duì)不同生長(zhǎng)因子的利用情況。并設(shè)置不添加乳酸不同生長(zhǎng)因子PY1 酵母菌株作為對(duì)照組。

1.2.6 乳酸添加量對(duì)P.kudriavzevii菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的影響 將PY1 酵母菌株單菌落分別接種到不同濃度乳酸（0、20、40 g/L、回0）的YNB-葡萄糖培養(yǎng)基（添加5 g/L 葡萄糖），28 ℃條件下培養(yǎng)36 h，采用氣相色譜[13,21]的方法測(cè)定發(fā)酵液揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。氣相色譜檢測(cè)采用Lzp 930 色譜柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣溫度220 ℃，檢測(cè)溫度250 ℃，進(jìn)樣量 0.4 μL，載氣為氮?dú)猓魉? mL/min，分流比10:1，升溫程序：55 ℃保持3 min，以3.5 ℃/min 升溫至150 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min 升溫至200 ℃，保持2 min，再以20 ℃/min 升溫至220 ℃，保持10 min。

1.2.7 乳酸脅迫下P.kudriavzevii菌株固液態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 固態(tài)發(fā)酵：參照文獻(xiàn)[20]研究方法，將2%（m/m）根霉粉和2%（v/m）酵母菌液（OD560nm為0.5）混合依次接種到不同乳酸（0、20 g/L）添加量的五糧固體培養(yǎng)基，28 ℃發(fā)酵7 d，為酵母菌固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組；設(shè)置不接菌和不添加乳酸的五糧固體培養(yǎng)基為對(duì)照組。

液態(tài)發(fā)酵：將2%（m/m）根霉粉和2%（v/m）酵母菌液（OD560nm為0.5）混合接種到不同乳酸（0、20 g/L）添加量的五糧液體培養(yǎng)基，28 ℃發(fā)酵7 d，為酵母菌固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組；設(shè)置不接菌和不添加乳酸的五糧液體培養(yǎng)基為對(duì)照組。

1.2.8 檢測(cè)方法 發(fā)酵結(jié)束后取10 mL 發(fā)酵液測(cè)定總酸含量[22]；發(fā)酵結(jié)束后取100 g 固體（液體）參照文獻(xiàn)[21]樣品前處理方法采用氣相色譜法[13]檢測(cè)固液態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物。葡萄糖采用DNS[13]法測(cè)定；總酸含量測(cè)定采用酸堿滴定法[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有處理組均設(shè)3 個(gè)重復(fù)，采用Excel 2019、SPSS 22.0、GraphPad Prism 9.1.2 處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸對(duì)P. kudriavzevii 菌株生長(zhǎng)的影響

圖1 展示P.kudriavzevii菌落及細(xì)胞形態(tài)。在添加40 g/L 乳酸的情況下，PY1 酵母菌株菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。

圖1 P. kudriavzevii 菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Morphology of P. kudriavzevii under lactic acid stress

圖2 展示不同濃度乳酸對(duì)P.kudriavzevii存活率的影響，可以看出，乳酸脅迫會(huì)降低P.kudriavzevii存活率，解除乳酸脅迫后酵母菌存活率恢復(fù)到原有水平（P＜0.05）。當(dāng)乳酸濃度為20 g/L 時(shí)，酵母菌的存活率開(kāi)始受到影響，當(dāng)乳酸濃度升高到40 g/L 時(shí)，酵母菌存活率顯著降低（P＜0.05），為66.36%。重新解除乳酸脅迫后（乳酸添加量0 g/L），酵母菌存活率恢復(fù)到原有水平（P＜0.05），為85.62%。表明這種抑制是可逆的，實(shí)際生產(chǎn)中也可通過(guò)降低糟醅過(guò)高的酸度一定程度恢復(fù)酵母的發(fā)酵活力。

圖2 乳酸濃度對(duì)P. kudriavzevii 菌株生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of lactic acid concentration on the growth of P.kudriavzevii

由圖3 可知，乳酸濃度為20 g/L YNB 液體培養(yǎng)基中酵母的生存率下降且不顯著，20 g/L 乳酸濃度對(duì)P.kudriavzevii菌株存活率影響較小；此外，濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中糟醅乳酸含量通常為10～20 g/kg[1]。因此，20 g/L 乳酸濃度可作為P.kudriavzevii菌株乳酸脅迫液體培養(yǎng)的適宜濃度。該濃度下固液態(tài)培養(yǎng)對(duì)酵母乳酸耐受性的響應(yīng)差異。可以看出，添加20 g/L 乳酸的固態(tài)和液態(tài)培養(yǎng)基中，P.kudriavzevii菌株P(guān)Y1 的存活率均有所下降，分別下降了11.80%和6.63%，但僅固態(tài)培養(yǎng)條件下的存活率下降達(dá)到顯著水平，表明固態(tài)發(fā)酵條件下，P.kudriavzevii酵母對(duì)乳酸脅迫的響應(yīng)更強(qiáng)，20 g/L 的乳酸已可顯著抑制P.kudriavzevii生長(zhǎng)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，液態(tài)培養(yǎng)酵母菌菌落總數(shù)為107CFU/mL，固態(tài)培養(yǎng)為106CFU/g。

圖3 乳酸脅迫下培養(yǎng)方式對(duì)P. kudriavzevii 酵母菌株生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of culture methods on the growth of P.kudriavzevii under lactic acid stress

2.2 乳酸與溫度對(duì)P. kudriavzevii 生長(zhǎng)的影響

白酒糟醅發(fā)酵期間窖內(nèi)發(fā)酵最高溫度可達(dá)50 ℃，能夠耐受較高溫度的酵母菌株更能適應(yīng)濃香型白酒窖池內(nèi)部環(huán)境[23]。圖4 可以看出，在20 g/L乳酸、44 ℃高溫共同作用下，P.kudriavzevii菌株仍能很好地生長(zhǎng)（OD 值＞0.5），表明該酵母能適應(yīng)糟醅的高溫高酸環(huán)境，但相較于對(duì)照組，20 g/L 的乳酸脅迫可顯著抑制PY1 酵母菌株的生長(zhǎng)（P＜0.05）；當(dāng)溫度升高至46 ℃以上，PY1 酵母菌株的生長(zhǎng)受到明顯抑制（OD 值＜0.5），且這種抑制與是否存在20 g/kg 的乳酸脅迫無(wú)關(guān)，表明環(huán)境溫度44 ℃以下，P.kudriavzevii的生長(zhǎng)受乳酸和溫度共同影響，且相同溫度下乳酸脅迫可顯著抑制酵母生長(zhǎng)（P＜0.05）；溫度超過(guò)一定范圍時(shí)，P.kudriavzevii的生長(zhǎng)主要受高溫抑制，乳酸脅迫對(duì)其生長(zhǎng)影響不顯著。因此，濃香型白酒發(fā)酵應(yīng)盡量控制糟醅溫度低于44 ℃，乳酸濃度低于20 g/L。

圖4 乳酸脅迫下高溫對(duì)P. kudriavzevii 菌株生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of high temperature on the growth of P.kudriavzevii under lactic acid stress

2.3 乳酸對(duì)P. kudriavzevii 菌株利用碳源的影響

由表1 可知，相同碳源乳酸脅迫下碳源利用率和對(duì)照組差異不顯著；但乳酸脅迫下不同碳源利用率存在差異，其中D-半乳糖含量最低（3.27 g/L）、碳源利用率最高為34.60%。在添加20 g/L 乳酸脅迫條件下，P.kudriavzevii菌株對(duì)碳源的利用量均有不同程度的提升，其中葡萄糖利用率提高了1.2%、D-半乳糖提高了4.2%、麥芽糖提高了14.6%、果糖提高了6.2%、蔗糖提高了1.6%，可見(jiàn)乳酸脅迫對(duì)PY1 酵母菌株利用麥芽糖的影響最大，麥芽糖的利用率從9%上升到23.6%，表明乳酸脅迫可促進(jìn)P.kudriavzevii菌株對(duì)碳源的利用，特別是對(duì)淀粉水解產(chǎn)物麥芽糖的利用，這有助于提升濃香型白酒糟醅的淀粉利用率，特別是在白酒發(fā)酵中后期隨著乳酸菌的大量增殖，乳酸濃度逐漸上升[24]，能夠在乳酸環(huán)境下進(jìn)一步利用各種碳源的P.kudriavzevii仍可持續(xù)發(fā)酵，榨干糟醅中的可發(fā)酵糖，這對(duì)提高濃香型白酒原料利用率有重要意義。

表1 乳酸脅迫對(duì)P. kudriavzevii 利用碳源的影響Table 1 Effect of lactic acid stress on carbon source utilization by P. kudriavzevii

2.4 乳酸脅迫下主要生長(zhǎng)因子對(duì)P. kudriavzevii 菌株的促進(jìn)作用

表2 為固態(tài)發(fā)酵條件下，不同生長(zhǎng)因子對(duì)P.kudriavzevii菌株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用（以酵母在560 nm處的吸光度增加值計(jì)）。結(jié)果顯示7 種生長(zhǎng)因子在有無(wú)乳酸脅迫的情況下均可促進(jìn)P.kudriavzevii菌株生長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)因子可在一定程度上削弱乳酸對(duì)P.kudriavzevii菌株生長(zhǎng)的抑制作用，其中維生素B1對(duì)乳酸脅迫的糾正效果最明顯（ΔOD560nm=0.342），表明添加維生素B1可能有助于改善發(fā)酵中后期優(yōu)勢(shì)酵母P.kudriavzeviiPY1 的生長(zhǎng)情況，延長(zhǎng)其發(fā)酵過(guò)程。

表2 生長(zhǎng)因子對(duì)P. kudriavzevii 菌株生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of growth factors on the growth of Pichia kudriavzevii

2.5 乳酸對(duì)P. kudriavzevii 菌株液態(tài)發(fā)酵主要揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的影響

酵母菌在YNB 液體培養(yǎng)基中主要揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的GC 分析結(jié)果如表3 所示。酵母菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物與其利用的碳源有關(guān)，YNB 液體培養(yǎng)基不同于傳統(tǒng)釀造環(huán)境可以用于酵母菌發(fā)酵前體物質(zhì)較少，酵母菌在YNB 液體培養(yǎng)基中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類較少，僅有甲醇、乙醛、乙醇、乙酸乙酯、異丁醇等幾種，其中，乙酸乙酯含量隨乳酸濃度的升高而降低，說(shuō)明乳酸脅迫導(dǎo)致酵母菌的數(shù)量下降，已有研究發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯的生成與酵母菌關(guān)系密切[25-27]，推測(cè)其為初級(jí)代謝產(chǎn)物，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，可以看出，當(dāng)乳酸添加量增加到40 g/L 時(shí)，乙酸乙酯含量最低（0.16 mg/L），乙酸乙酯的減量與酵母數(shù)量的減少有關(guān)，故該酵母菌株代謝產(chǎn)酯能力減弱。但在賦予P.kudriavzevii更豐富的發(fā)酵前體物質(zhì)（五糧粉）后，P.kudriavzevii產(chǎn)酯能力明顯提升，在同等條件下乙酸乙酯含量增加到1561.75 mg/L（表4）。隨著乳酸脅迫作用的增強(qiáng)，異丁醇含量從0.34 mg/L 顯著減少到0.13 mg/L（P＜0.05），解除乳酸脅迫后異丁醇的含量減少，這也與表3 酵母菌株模擬生產(chǎn)應(yīng)用結(jié)果相符，說(shuō)明乳酸脅迫的作用可有效降低PY1 酵母的高級(jí)醇產(chǎn)量，有助于提升白酒的品質(zhì)[28-29]。

表3 乳酸對(duì)P. kudriavzevii 菌株YNB 培養(yǎng)基液態(tài)發(fā)酵主要揮發(fā)性代謝產(chǎn)物影響Table 3 Effects of lactic acid on volatile metabolites produced by YNB medium liquid fermentation of P. kudriavzevii

表4 P. kudriavzevii 菌株固液態(tài)發(fā)酵主要產(chǎn)物及含量Table 4 Main products and contents of solid and liquid fermentation of P. kudriavzevii

2.6 乳酸對(duì)P. kudriavzevii 菌株固態(tài)發(fā)酵主要揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的影響

由表4 可知，添加乳酸的固、液態(tài)發(fā)酵結(jié)束時(shí)酸含量（以去除初始乳酸添加量計(jì)）分別為15.52 g/L和23.30 g/L，均低于不添加乳酸的對(duì)照組。說(shuō)明20 g/L 乳酸脅迫的環(huán)境下，抑制了酸的產(chǎn)生，同時(shí)酵母菌株也將一部分代謝產(chǎn)生的酸類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酯類物質(zhì)。主要產(chǎn)物氣相色譜檢測(cè)結(jié)果同見(jiàn)表4。

在乳酸脅迫情況下，固態(tài)發(fā)酵酵母菌株在乳酸脅迫的調(diào)控下，乙醛含量下降，有助于減少產(chǎn)品的刺激性氣味且促進(jìn)乙醇生成[29]；P.kudriavzevii菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)乙醇3.740 g/L，較不添加乳酸的對(duì)照組增加了11%，產(chǎn)乙酸乙酯、丁酸乙酯分別為1561.75、181.70 mg/L，說(shuō)明乳酸脅迫可提高P.kudriavzevii菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)乙醇及主要酯類香氣成分的量，這也與其在YNB 培養(yǎng)基中的液態(tài)發(fā)酵結(jié)果一致。微生物多樣性受到微生物數(shù)量和均勻度的影響，當(dāng)某一微生物豐度較高時(shí)會(huì)影響其他種類微生物的生長(zhǎng)，固態(tài)發(fā)酵低于其液態(tài)發(fā)酵乙醇含量，但固態(tài)發(fā)酵菌密度（106CFU/g）低于液態(tài)發(fā)酵（107CFU/mL），更有利于實(shí)現(xiàn)P.kudriavzevii菌株與其它微生物協(xié)同發(fā)酵。P.kudriavzevii菌株固態(tài)發(fā)酵均未檢測(cè)出甲醇含量，兼具較高的安全性[30-31]。同時(shí)，該酵母菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)正丙醇、異丁醇、異戊醇的情況各有不同，對(duì)正丙醇，乳酸脅迫可顯著增大固液態(tài)發(fā)酵糟醅中的正丙醇生成量差異，使固態(tài)發(fā)酵的正丙醇含量顯著低于液態(tài)發(fā)酵；對(duì)異丁醇，該酵母固態(tài)發(fā)酵時(shí)的異丁醇生成量高于液態(tài)發(fā)酵，且乳酸可降低固液態(tài)發(fā)酵糟醅中的異丁醇生成量；而異戊醇的生成量則主要受發(fā)酵方式的影響，與是否存在乳酸脅迫無(wú)關(guān)。總體來(lái)看，乳酸脅迫對(duì)P.kudriavzevii產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的影響因其發(fā)酵方式而不同，在液態(tài)發(fā)酵條件下，乳酸脅迫可顯著降低P.kudriavzevii的乙酸乙酯產(chǎn)量，增加其甲醇產(chǎn)量；固態(tài)發(fā)酵條件下，乳酸脅迫對(duì)P.kudriavzevii產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的影響相對(duì)較小，表明固態(tài)發(fā)酵方式可為乳酸脅迫提供更好的緩沖。

3 結(jié)論

本研究先通過(guò)P.kudriavzeviiPY-1 菌株存活率確定最適乳酸脅迫濃度20 g/L，且該濃度對(duì)酵母菌菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響，但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定抑制，在44 ℃溫度以下，乳酸對(duì)溫度均可抑制菌株生長(zhǎng)，但在44 ℃以上，乳酸的影響不起主導(dǎo)作用。乳酸脅迫P.kudriavzevii菌株發(fā)酵特性影響結(jié)果如下：乳酸對(duì)P.kudriavzevii的可逆抑制作用可被一些生長(zhǎng)因子削弱；乳酸脅迫也可提高酵母對(duì)葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖、果糖和蔗糖的利用率；菌株代謝產(chǎn)乙醇升高、異丁醇含量降低；應(yīng)用此菌株模擬乳酸脅迫下白酒生產(chǎn)（固態(tài)發(fā)酵），酯類物質(zhì)含量增高、高級(jí)醇含量降低，且均未檢測(cè)出甲醇含量。P.kudriavzevii菌株兼具較高安全性和改善酒體品質(zhì)的發(fā)酵潛能，有望成為一種極具商業(yè)潛力的白酒生產(chǎn)酵母。