蝦青素通過調控Nrf2/Gpx4 信號通路抑制鐵死亡減輕糖尿病小鼠視網膜損傷

張景正，葉子昊，祝可欣，陳 靈，鮑真真，鐘 嫄，劉 嘉

（江蘇衛生健康職業學院，江蘇南京 210000）

據報道，到2035 年，全球患有糖尿病的人數將突破5.92 億[1]，而糖尿病引發的視網膜病變患者人數也會明顯增加，因而尋找有效的治療糖尿病視網膜病變的藥物迫在眉睫。糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常見的并發癥之一，主要以視網膜血管失調為特征，如不進行及時治療，極易引起視網膜損傷，甚至失明，嚴重降低了患者的生活質量。

大量研究顯示，氧化應激是導致糖尿病視網膜損傷的主要因素[2-3]。當機體長期處于高糖狀態下，體內的氧自由基增加，造成脂質過氧化，體內的抗氧化系統發生紊亂，最終導致細胞DNA 損傷。近年來，越來越多的科研人員發現眼科疾病的發生發展與鐵死亡有著密切的聯系，為探究眼科疾病的發病機制及治療手段提供了新的途徑[4-5]。鐵死亡是一種以細胞內亞鐵離子過度堆積導致脂質過氧化為特征的程序性細胞死亡方式，其細胞死亡特征與凋亡細胞明顯不同，多呈現線粒體皺縮，膜密度增大等特點[6-7]。有研究發現，當細胞內鐵代謝紊亂時，谷胱甘肽（GSH）循環出現明顯異常，導致細胞能量代謝紊亂，進一步加劇鐵死亡，形成惡行循環。近年來，研究發現核轉錄因子（Nrf2）蛋白的上調，可以明顯提升細胞的抗氧化能力，在介導細胞鐵死亡過程中發揮著關鍵作用[8]。介于氧化應激與鐵死亡之間的密切聯系，抗氧化劑作為一種潛在的治療視網膜損傷的藥物成為研究的熱點。如有研究發現矢車菊素-3-葡萄糖苷、槲皮素、姜黃素等都可以通過抗氧化作用改善多種原因引起的視網膜損傷[9-10]。蝦青素廣泛存在于自然界當中，結構中富含多個不飽和鍵和酚羥基，具有優越的抗氧化能力，而且蝦青素具有優秀的脂溶性，可順利的通過血腦屏障[11-14]。已有研究發現，蝦青素不僅可通過有效清除細胞內氧自由基，改善心血管疾病及糖尿病的癥狀[15]，還可通過上調Nrf2 通路，調控氧化應激，控制炎癥從而發揮其保護作用[16]。有文獻報道，蝦青素對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠具有較好的降糖作用，而且近期研究發現蝦青素對于高糖誘導的晶狀體上皮細胞損傷具有較好的改善作用[17-18]，其是否可以通過調控鐵死亡信號通路改善糖尿病導致的小鼠視網膜損傷，尚未有文獻報道。

因此，本研究以注射鏈脲佐菌素聯合使用高脂飼料，構建2 型糖尿病小鼠視網膜損傷模型，并基于Nrf2 介導的鐵死亡信號通路，探究蝦青素改善糖尿病視網膜損傷的作用，研究結果為蝦青素的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠 4 周齡，40 只，體重18～22 g，江蘇集萃藥康生物科技有限公司，實驗動物使用許可證SYXK（蘇）2020-0001；普通飼料、高脂飼料（88%普通飼料，2%的膽固醇，10%的豬油）江蘇協同醫藥生物公司；鏈脲佐菌素 金克隆生物技術有限公司；蝦青素（CAS：472-61-7，含量≥98%）陜西康盛生物技術有限公司；橄欖油 化學純，CAS：8001-25-0 上海國藥集團；MDA 測定試劑盒（批號20210804）、GSH-PX 測定試劑盒（批號20210826）、SOD 測定試劑盒（批號20210613）南京建成生物工程研究所；Fe2+比色法測定試劑盒（批號E-BC-K772-M）Elabscience 公司；兔抗小鼠GPX-4（批號DF6701）、兔抗小鼠NRF-2（批號AF0639）、兔抗小鼠FTH1（批號DF6278）美國Affinity 公司；兔抗小鼠TR1 抗體（批號17435-1-AP）Proteintech 中國公司。

HT-300 型小型垂直蛋白電泳系統 美國Bio-Rad 公司；CM3050S 冰凍切片機 德國Leica 公司；CV5030-ST5020 染色封片工作站 德國Leica 公司；BX53 型生物顯微鏡 日本Olympus 公司；Rt-6100 酶標儀 美國Rayto 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及分組處理 本實驗的開展通過了江蘇衛生健康職業學院動物福利倫理審查（批號：JHVC-IACUC-2022-B004），將小鼠隨機分為正常組、模型組、蝦青素低劑量組和蝦青素高劑量組，除正常組之外，其余各組均以高脂飼料進行喂養，每組10 只，模型組和給藥組小鼠按照體重（60 mg/kg）劑量腹腔注射鏈脲佐菌素，連續注射5 d，第7 d 時，剪尾取血檢測血糖，血糖值≥11.1 mol/L 時，表示模型構建成功。正常組注射相同體積的檸檬酸緩沖液，連續注射5 d。模型構建成功后，蝦青素低、高劑量組每日灌胃給藥劑量分別為100、200 mg/kg[19]，正常組和模型組給予相同體積的溶媒對照，連續灌胃14 周。

1.2.2 小鼠日常狀態及空腹血糖檢測 在實驗過程中，每周分別觀察并記錄小鼠運動狀態、攝食量、毛發變化，墊料潮濕程度，每周進行一次體重稱量，每兩周進行一次空腹血糖測定，血糖測定時，用消毒后的剪刀剪去小鼠的部分尾巴，擠出部分血液，采用血糖儀和血糖試紙檢測空腹血糖尾濃度并記錄，觀察各組小鼠體重及血糖變化。

1.2.3 各組小鼠胰島素抵抗情況檢測 胰島素抵抗實驗開始前，所有小鼠進行禁食12 h，中途不禁水，禁食完成后腹腔注射1 U/kg 的胰島素，并在注射胰島素后的0、0.5、1.0、1.5、2.0 h 對小鼠進行剪尾取血，使用血糖儀和血糖試紙進行血糖測定。

1.2.4 分光光度法檢測小鼠血清中氧化應激相關指標及Fe2+含量 給藥結束后，采用彎鑷摘除眼球，收集血液，靜止1.5 h，在4 ℃和3500 r/min 的條件下離心10 min 分離血清，每組取10 只。根據試劑盒測定說明書分別測定小鼠視網膜中MDA 和Fe2+含量以及GSH-PX 和SOD 的活性。

1.2.5 HE 染色觀察各組小鼠視網膜病理學變化 給藥結束后，每組取3 只小鼠，取出眼球后放入40 g·L-1多聚甲醛中固定，固定后進行石蠟包埋，切片。石蠟切片后采用HE 染色觀察小鼠視網膜病理學變化，步驟如下，二甲苯脫蠟20 min×2 次；依次采用100%、95%、80%、75%的乙醇進行水化，其中100%和95%的乙醇水化2 次，80%和75%的乙醇水化1 次，每次10 min；蘇木素染色10 min；采用5%的乙酸分化1 min，流水沖洗，用吸管滴加乙酸，布滿玻片上的組織即可，分化后顏色變淺，成為藍色；返藍；伊紅染色1 min；采用70%、80%、90%、100%乙醇各10 s，二甲苯1 min 進行脫水，自然晾干，采用中性樹脂封片，倒置顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 Western blot 檢測 稱量視網膜組織重量，按照裂解液（RIPA）：蛋白酶抑制劑（PMSF）：磷酸酯酶抑制劑：氟化鈉體積比為100:1:1:2 配制勻漿液，按照勻漿液（mL）體積：組織重量（g）為7.5:1 進行混合，操作過程在冰浴中進行，制備好的勻漿液于4 ℃和12000 r/min 的條件下離心10 min，移液槍吸取上清，采用BCA 試劑盒確定蛋白濃度。

采用8%的梯度分離膠進行上樣，用梯度膠配套的電泳液進行電泳，條件為恒壓160 V，45 min；轉膜：采用濕轉法轉膜，轉膜過程中使用冰盒和碎冰降溫，恒流轉膜350 mA，40 min，抗體稀釋均按照抗體體積：一抗稀釋液進行配制，比例如下[Nrf2（1:1000）、GPX4（1:1000）、FTH1（1:1000）、TFR1（1:1000）]，轉膜后封閉，一抗過夜孵育、二抗孵育、顯色，掃描，分析目的條帶灰度值。

1.3 數據處理

采用SPSS 18.0 軟件分析數據。根據數據特征采用不同的數據分析方法，方差齊采用最小顯著差數（least significant difference，LSD）法，方差不齊采用新復極差法檢驗（Duncan’s new multiple range test，Dunnett T3）法。檢驗水準：α=0.05。

2 結果與分析

2.1 蝦青素對小鼠一般狀態的影響

實驗過程中，觀察并記錄小鼠一般狀態變化，結果如表1 所示。與對照組相比，模型組小鼠攝食量增加、毛發不順滑、狀態不活躍，墊料極潮濕，表現出典型的糖尿病特征。與模型組相比，蝦青素低高劑量組小鼠攝食量減少、毛發較順滑、狀態相對活躍，墊料潮濕程度較小，說明蝦青素具有一定的改善糖尿病的效果。

表1 蝦青素對小鼠一般狀態的影響（n=10）Table 1 Effect of astaxanthin on general state of mice (n=10)

2.2 蝦青素對小鼠體重和血糖濃度的影響

如圖1a 所示，實驗開始時，各組小鼠體重無差異，實驗結束時，與正常組相比，模型組小鼠體重極顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，蝦青素低劑量組小鼠顯著體重升高（P＜0.05），高劑量組小鼠體重極顯著升高（P＜0.01）。實驗開始時，各組小鼠空腹血糖無明顯差異（圖1b），實驗結束時，與正常組相比，模型組小鼠空腹血糖極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，蝦青素低高劑量組小鼠空腹血糖均極顯著降低（P＜0.01）。

圖1 蝦青素對小鼠體重和血糖濃度的影響（n=10）Fig.1 Effects of astaxanthin on body weight and blood glucose concentration in mice (n=10)

2.3 蝦青素對糖尿病小鼠視網膜氧化應激能力及Fe2+含量的影響

各組小鼠視網膜組織中氧化應激能力變化如表2 所示，與正常組相比，模型組小鼠視網膜中MDA水平極顯著升高（P＜0.01），GSH-PX 活性，SOD 活性極顯著降低（P＜0.01），Fe2+含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，蝦青素低高劑量組小鼠視網膜中GSH-PX 活性和SOD 活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA 水平和Fe2+含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 蝦青素對小鼠視網膜中GSH-PX 活性、SOD 活性及MDA、Fe2+含量的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of astaxanthin on GSH-PX activity,SOD activity,MDA,Fe2+content in mouse retina (±s,n=6)

表2 蝦青素對小鼠視網膜中GSH-PX 活性、SOD 活性及MDA、Fe2+含量的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of astaxanthin on GSH-PX activity,SOD activity,MDA,Fe2+content in mouse retina (±s,n=6)

注：與正常組相比，##表示數據差異極顯著，P＜0.01；與模型組相比，*表示數據差異顯著P＜0.05，**表示數據差異極顯著，P＜0.01。

2.4 蝦青素對小鼠胰島素抵抗情況的影響

各組小鼠胰島素抵抗情況如圖2 所示，與正常組相比，模型組小鼠出現明顯的胰島素抵抗現象（P＜0.01）；與模型組相比，蝦青素低劑量組胰島素抵抗現象沒有明顯改善，蝦青素高劑量組胰島素抵抗現象得到顯著改善（P＜0.01）。

圖2 蝦青素對小鼠胰島素抵抗情況的影響（n=10）Fig.2 Effect of astaxanthin on insulin resistance in mice (n=10)

2.5 蝦青素對糖尿病小鼠視網膜病理學變化的影響

各組小鼠視網膜病理學變化如圖3 所示，正常組小鼠神經節細胞層，內外核層細胞排列緊密、整齊、規則；模型組小鼠神經節細胞層出現了較大面積的缺失，外核層細胞數量明顯減少，排列松散；與模型組相比，蝦青素低劑量組小鼠視網膜神經節細胞層有所改善，缺失面積明顯減少，細胞排列良好，內外核層輕度紊亂；高劑量組，小鼠視網膜組織結構進一步得到改善。

圖3 各組小鼠視網膜組織HE 染色結果（200×）Fig.3 HE staining results of retinal tissue in each group of mice (200×)

2.6 蝦青素對糖尿病小鼠視網膜中Nrf2 和GPX4 蛋白及鐵死亡相關蛋白的影響

如圖4 所示，與正常組相比，模型組小鼠視網膜組織中Nrf2、GPX4、FTH1 蛋白表達極顯著降低（P＜0.01），TFR1 蛋白表達極顯著升高（P＜0.01）；給予蝦青素進行干預后，與模型組相比，蝦青素低高劑量組小鼠視網膜組織中Nrf2、GPX4、FTH1 蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），蝦青素低高劑量組小鼠視網膜組織中TFR1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 蝦青素對小鼠視網膜中Nrf2、GPX4 蛋白及鐵死亡相關蛋白表達的影響Fig.4 Effects of astaxanthin on the expression of Nrf2,GPX4 protein and iron death related protein in mouse retina

3 討論與結論

本研究通過注射鏈脲佐菌素聯合使用高脂飼料，構建2 型糖尿病小鼠視網膜損傷模型，并采用蝦青素對糖尿病引起的視網膜損傷進行有效的干預，結果發現蝦青素可以通過調控Nrf2/Gpx4 信號通路抑制鐵死亡減輕糖尿病小鼠視網膜損傷。

結果顯示，長期高糖狀態可以明顯降低小鼠視網膜中SOD 和GSH-PX 活性，升高MDA 含量，造成小鼠視網膜組織中氧化應激失衡，而蝦青素可以有效提升視網膜中抗氧化酶的活性，增加脂質過氧化產物的清除率，發揮改善作用，與楊倩等[19]的研究結果一致。另外，本實驗研究還發現，糖尿病小鼠視網膜中的亞鐵離子含量明顯高于正常組小鼠，并且近年來有研究顯示，鐵死亡的重要特征之一也是脂質過氧化堆積和氧化系統失衡，進一步印證了糖尿病導致的視網膜損傷與細胞內鐵代謝紊亂密切相關[20]。此外，胰島素抵抗是糖尿病代謝紊亂的重要原因，而過量的鐵離子可以催化脂質氧化，增加糖異生，進一步促進胰島素抵抗的發生。

Nrf2 是調控氧化應激系統參與免疫應答的重要轉錄因子，在鐵死亡發生過程中，扮演著重要的角色，可靶向調控一系列氧化還原相關基因，對鐵死亡起到調控作用。GPX4 是清除脂質過氧化物的關鍵酶，并且有研究發現，GPX4 是Nrf2 調控的重要靶標[21]，Nrf2 的抑制均可降低GPX4 的表達[22-23]。TFR1 作為一種跨膜運輸蛋白，可以與Fe3+結合，增加細胞內鐵的攝取[24]。當細胞內出現鐵超載時，大量的Fe2+堆積，引發芬頓反應，活性氧和脂質過氧化物被大量釋放，最終導致細胞死亡[25]。多項研究表明，鐵死亡參與的多種疾病模型中均出現TFR1 表達升高的結果，因此其過量表達被認為是鐵死亡的重要標志之一[26-30]。鐵蛋白是機體最主要的鐵儲存倉庫，主要由2 種多肽鏈（FTL 和FTH）組成，其作用主要是通過儲存細胞內游離的鐵離子，從而維持細胞鐵穩態。本研究結果發現，長期高糖狀態可以明顯降低鐵死亡標志物GPX4 和FTH 蛋白的表達，升高TFR1 的表達，說明糖尿病導致的視網膜損傷確實與Nrf2 介導的鐵死亡密切相關。給予蝦青素干預后，與模型組相比，小鼠視網膜組織中鐵死亡標志物GPX4 和FTH蛋白的表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），TFR1 的表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），而在蝦青素干預過程中Nrf2 蛋白的表達明顯升高，并且已有文獻報道，蝦青素可以通過上調Nrf2 蛋白的表達，抑制氧化應激反應，改善糖尿病引發的腎損傷[31-32]。因此，本實驗結果說明，蝦青素可以通過上調Nrf2/GPX4 信號通路抑制鐵死亡發揮改善糖尿病視網膜損傷的作用。

綜上所述，蝦青素可以通過激活Nrf2/GPX4 信號通路，抑制鐵死亡改善糖尿病導致的視網膜損傷，但是調控鐵死亡的信號通路多種多樣，蝦青素是否還通過其它信號通路發揮改善作用，需要進行進一步的研究。