蛋白質ADP核糖基化對秦川牛肉品質的影響

伏棋畫，李亞蕾，羅瑞明，王雪蓉，馬旭華

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

畜禽宰后肉品質的改變通常是幾種不同的翻譯后修飾共同作用[1]。D’Alessandro等[2]認為肌球蛋白輕鏈2的磷酸化通過負向調節肌動球蛋白解離、肌動球蛋白ATP酶活性，從而使肉嫩度下降。ADP核糖基化是翻譯后修飾的一種，可調節基因穩定和細胞凋亡[3]，該反應主要是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶家族（poly(ADP-ribose)polymerase，PARPs）催化進行，基本由聚ADP核糖酶1（poly(ADP-ribose) polymerase 1，PARP1）擔任，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸被分解為ADP核糖和煙酰胺，ADP核糖則用來修飾目的蛋白。研究證實，活性氧（reactive oxygen species，ROS）致使DNA鏈損傷嚴重，進而引起PARP1過度激活，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）和ATP作為線粒體電子呼吸傳遞鏈上代謝過程的關鍵底物[4]，被PARP1過度消耗[5]，此反應影響到線粒體氧化呼吸和ATP合成等細胞生物學功能，加重線粒體功能障礙，細胞因能量供應不足而凋亡或壞死。Xu Jingjing等[6]經過研究得出線粒體損傷誘導凋亡發生，活化ADP核糖轉移酶，進而促進還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的耗竭，降低ATP含量，造成細胞凋亡。

牛肉宰后成熟的本質是線粒體凋亡過程，線粒體是連接肌纖維和細胞凋亡的橋梁，肌纖維構成骨骼肌則與肉品質密切相關[7]。目前國內外對宰后肉凋亡途徑的研究主要集中于Ca2+、AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶（protein kinase，AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、Caspase-3及其級聯反應、蛋白質乙酰化、泛素化等通路與糖酵解、氧化磷酸化、三羧酸循環的相互調節作用。王宇等[8]綜述了AMPK調節糖代謝、蛋白代謝進而影響肉品質的機制，姜珊珊等[9]等實驗表明，通過向豬肉中注射氯化鈣可降低高鐵肌紅蛋白還原酶、乳酸脫氫酶的活性，使肉品褪色嚴重，嫩化加速。Fuentes-Prior等[10]發現半胱天冬蛋白酶介導的細胞凋亡積極影響宰后骨骼肌的蛋白水解，與肉品質密切相關。

聚ADP核糖基化與線粒體損傷的關系已被研究多年，鮮有將其引入肉品領域，是否可以從ADP核糖基化調控線粒體損傷進而改善肉的嫩度仍有待研究證明。Rucaparib是第一個進入臨床階段的PARP-1抑制劑[11]。本研究采用PARP1抑制劑Rucaparib對宰后秦川牛背最長肌進行處理，研究秦川牛宰后成熟過程中ADP核糖基化水平與肉品質指標的變化，同時，分析ADP核糖基化與肉品質指標的相關性，以期為秦川牛宰后成熟過程中ADP核糖基化反應對食用品質的影響提供理論依據，從而豐富秦川牛肉成熟機理，進一步改善其品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秦川公牛 寧夏尚農生物科技公司；線粒體膜電位檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；Caspase-3檢測試劑盒、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）檢測試劑盒、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）北京索萊寶科技有限公司；蔗糖、Tris-HCl、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、EDTA-2Na、NaN3、K3PO4美國Sigma公司；PARP1兔克隆抗體 武漢愛博泰克生物科技有限公司；GAPDH兔克隆抗體、RIPA裂解液 武漢賽維爾生物科技有限公司；生物素化山羊抗兔IgG(H+L)江蘇親科生物研究中心有限公司；聚偏二氯乙烯膜美國Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

JXFSTPRP-CL全自動樣品冷凍研磨儀 上海凈信有限公司；EnSpire酶標儀 美國 PerkinElmer股份有限公司；NAI-CS150超聲波細胞破碎機 上海那艾精密儀器有限公司；ScanSpeed MiniVac Alpha冷凍離心機美國Scan Speed公司；Thermo Scientific Forma 994-80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo公司；UV-1200紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；JY200C電泳儀北京君意東方電泳設備有限公司；5200化學發光凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；DW-86L386超低溫冰箱海爾集團；H2050R高速低溫離心機 湘儀集團；TA-XT plus質構儀 北京微訊超技儀器技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與處理

選取25 月齡秦川公牛，屠宰放血后45 min內取背最長肌（5 頭牛胴體），剔除表面脂肪、結蹄組織，切割為160 g（厚3 cm）的肉塊，將肉樣分成對照組和實驗組，分別按照肉液比10∶1（g/mL）均勻注射0.9%生理鹽水和20 μmol/L Rucaparib溶液，置于4 ℃冰箱貯藏，0 h、6 h、12 h、2 d、4 d、8 d作為分析取樣點，快速測定pH值等品質指標，不便立即測定的免疫印跡等指標，在設計時間點采集足夠肉樣，用錫紙、保鮮膜、塑封袋密封，置于-80 ℃凍藏待測。

1.3.2 線粒體的提取

參考陳騁[12]的方法提取線粒體蛋白。取2 g背最長肌樣，用經冷藏過的生理鹽水洗去表面殘血，表面水分使用濾紙吸干，剪碎，置入10 倍體積的線粒體分離液中（200 mmo/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 7.4）勻漿處理，勻漿液于4 ℃、1000×g離心10 min，分離上清液，再于4 ℃、8000×g離心10 min，最后在4 ℃、10000×g離心20 min，得到線粒體。以上實驗均在4 ℃條件下進行，雙縮脲法測定蛋白的濃度。

1.3.3 ROS含量的測定

參照張佳瑩[4]的方法略作修改。因離心機規格不同，肉樣質量改取200 mg，使用ROS含量檢測試劑盒測定。

1.3.4 線粒體膜電位的測定

線粒體膜電位參照Tian Zhu等[13]的方法稍作修改。因離心機規格不同，肉樣質量改取200 mg，使用線粒體膜電位檢測試劑盒操作。

1.3.5 Caspase-3活力的檢測

參考Tian Zhu等[13]的方法略作修改。因勻漿機及離心機規格不同，肉樣質量改取250 mg使用Caspase-3活性檢測試劑盒操作后測定A405nm，通過標準曲線計算凋亡酶活力。

1.3.6 SDH活力的測定

使用SDH試劑盒測定參照師希雄等[14]的方法。進行線粒體提取之后，超聲波細胞破碎儀破碎處理細胞，以破壞線粒體細胞膜使SDH釋放在提取液中測定吸光度。

1.3.7 肌原纖維小片化指數（myofibril fragmentation index，MFI）的測定

參照馬旭華等[15]的方法，并稍作修改。將肌肉樣品（2 g）加入含有35 mL冰冷緩沖液（0.1 mol/L KCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2、25 mmol/L K3PO4和1 mmol/L NaN3，pH 7.0）的50 mL試管中，并在4 ℃、10000×g勻漿30 s。在4 ℃、2000×g離心均質化樣品10 min，將混懸液過濾至50 mL燒杯中，并使用1 mm2孔的篩網過濾器去除結締組織。將肌原纖維沉淀重懸于25 mL緩沖液中并再次離心。重復該過程，將沉淀物重懸于20 mL冷緩沖液中。調節蛋白質量濃度至0.5 mg/mL，并立即使用紫外分光光度計在540 nm波長處測定吸光度，將蛋白質量濃度的吸光度乘200計算MFI。

1.3.8 剪切力測定

沿樣品肌纖維方向用直徑1.27 cm采樣器平行取3 個肉柱，然后用TA-XT plus質構儀垂直于肌纖維方向測定其剪切力，測定3 次取其平均值。

1.3.9 pH值的測定

參考陳騁等[16]的方法，使用pH計校正后測定pH值，待數值信號穩定后記錄，每個樣品測定5 個平行數值，讀數精確到0.01，取平均值。

1.3.10 PARP1、Desmin表達水平測定

采用Western Blot法測定PARP1表達水平。提取蛋白質[17]，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度，采用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）調節蛋白質量濃度至5 mg/mL，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白（5%下層分離膠、10%上層濃縮膠），點樣，采用100 V、15 min，當溴酚藍染料到分離膠以后將電壓調至180 V繼續電泳，到達凝膠底部時停止電泳。按照由下到上的順序放置海綿、濾紙（3 張）、膜、凝膠、濾紙（3 張）、海綿，將凝膠面與負極相連，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜與正極相連，接通電源，200 mA轉膜1～2 h，轉印好后PVDF膜置于封閉液中（使用TBST緩沖液配制5%脫脂奶粉，等滲緩沖鹽溶液有利于洗去膜上非特異性結合的抗體等試劑）搖床上室溫條件下封閉3 h，TBST緩沖乳液清洗5 次，每次8 min。加入配制的兔抗PARP1多克隆抗體（抗體與一抗稀釋液體積比為1∶1000）、GAPDH抗體（抗體與一抗稀釋液體積比為1∶1000），4 ℃冰箱孵育過夜，TBST溶液清洗5 次后，置于相應二抗（辣根過氧化物酶標記山羊IgG(H+L)）中，搖床上輕搖，室溫孵育2～3 h，TBST將PVDF膜清洗3 次，每次10 min，將ECL均勻滴加到膜上反應1 min。采用GIS機箱控制軟件V2.0進行條帶曝光掃描，用目的蛋白表達量表示實驗結果。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 ROS含量的變化

宰后骨骼肌細胞內高濃度ROS可造成細胞內DNA鏈斷裂，磷脂酰絲氨酸外翻，激活細胞凋亡途徑[18]。宰后成熟期間ROS含量變化如圖1所示，宰后0～12 h，對照組ROS含量顯著降低（P＜0.05），宰后12 h～4 d，ROS含量顯著增加（P＜0.05），宰后4～8 d無顯著變化（P＞0.05），這與師希雄等[19]的研究結果一致。在Rucaparib作用下，ROS含量于宰后0～2 d下降，2～8 d顯著上升（P＜0.05）。0 h～8 d期間（12 h除外）對照組ROS含量高于抑制劑組，第2天抑制劑組ROS含量顯著低于對照組（P＜0.05），這與張繪艷等[20]進行抑制PARP-1蛋白的活性后，ROS含量由12.8%降至5.29%的研究結果相符。可能是由于抑制PARP1表達會減少ATP消耗和呼吸代謝[21]，自由基鏈式反應被阻礙，進而也會影響Caspase-3的活性[22]，因此線粒體產生ROS水平一定程度降低。

圖1 宰后成熟過程中秦川牛背最長肌ROS含量變化Fig.1 Changes of ROS content in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during postmortem aging

2.2 線粒體膜電位的變化

線粒體膜電位的升高或降低可以反映線粒體損傷情況[4]。由圖2可知，抑制劑組線粒體膜電位于宰后2～8 d顯著降低（P＜0.05），8 d比12 h下降49.7%，12 h抑制劑組線粒體膜電位比對照組高10.1%，對照組線粒體膜電位在宰后6 h～4 d顯著降低（P＜0.05），4～8 d無顯著變化，這與之前的研究結果[23]相似。宰后6 h之后，線粒體膜發生通透并伴隨著膜電位的下降，抑制劑處理組膜電位總體高于對照組，并且抑制劑組膜電位降低延遲。說明抑制線粒體ADP核糖基化反應可保留線粒體膜電位[24]，減輕了氧化應激后的大規模線粒體功能障礙[25]。

圖2 宰后成熟過程中秦川牛背最長肌線粒體膜電位的變化Fig.2 Changes of mitochondrial membrane potential in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during postmortem aging

2.3 Caspase-3表達水平的變化

Caspase-3通過線粒體內源性途徑參與肉類的成熟嫩化[26]。從圖3可以看出，抑制劑處理組在0 h～2 d期間Caspase-3活性上升（P＜0.05），2～4 d內活性逐漸下降，活性最大值出現在2 d。對照組Caspase-3表達量在0～12 h呈顯著上升趨勢（P＜0.05），12 h～4 d活性顯著下降（P＜0.05）。宰后初期（0～12 h），兩組的Caspase-3表達均逐漸增加，這表明Caspase-3在牛肉宰后初期被激活[27]，0～12 h期間，抑制劑處理組的Caspase-3表達量始終低于對照組。本研究結果表明，抑制PARP1的過量表達可一定程度減緩Caspase-3表達，可以抑制凋亡信號的逐級釋放。這可能是由于本該由Caspase-3切割的靶蛋白PARP1表達降低，Caspase-3無法在線粒體凋亡通路中發揮作用[28]。

圖3 宰后成熟過程中秦川牛背最長肌中Caspase-3表達量的變化Fig.3 Changes of caspase-3 expression in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during postmortem aging

2.4 SDH活性變化

SDH是唯一整合于線粒體內膜上的多亞基酶，在線粒體電子傳遞鏈中連接三羧酸循環、氧化磷酸化等[29]重要代謝途徑。從圖4可知，在對照組和Rucaparib處理組中SDH活性在0～8 d逐步降低。在貯藏第8天，抑制劑組SDH活力高于對照組42.7%（P＜0.05）。從圖4可以看出，抑制劑組SDH活性下降較對照組慢，說明宰后肌細胞呼吸功能被維持[30]，線粒體電子傳遞鏈復合物II中的SDH在三羧酸循環中產生的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸是電子傳遞鏈介導高鐵肌紅蛋白還原不可缺少的電子傳遞體[31]。PARP1的抑制可減少能量代謝底物的消耗，保持SDH活性，進而支撐三羧酸循環和線粒體電子傳遞鏈中的電子傳遞[32]，延遲了牛肉嫩化以及顏色變化。

圖4 宰后成熟過程中秦川牛背最長肌中SDH活力Fig.4 Activity of SDH in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during postmortem aging

2.5 MFI的變化

MFI代表肌原纖維蛋白小片化程度，反映細胞骨架蛋白完整情況，用于間接表征肉品的嫩度[33]。由圖5可知，秦川牛宰后成熟期間背最長肌MFI的變化趨勢為顯著上升趨勢（P＜0.05），對照組在第8天達到整個貯藏過程的最高點94.00，第8天是0 h的4.16 倍。這可能是由于宰后成熟期間內源酶降解了肌纖維結構，使其斷裂為大量多肽類小片段[1]。抑制劑組在12 h～2 d顯著升高至53.00（P＜0.05），且在0 h～8 d 各個時間段均低于對照組。表明PARP1抑制劑能夠通過內源性途徑抑制肌原纖維的降解，這與張攀高等[34]對宰后藏羊肉中MFI隨宰后成熟時間延長的研究結果符合。

圖5 宰后成熟過程中秦川牛背最長肌MFI的變化Fig.5 Changes of MFI in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during postmortem aging

2.6 剪切力的變化

剪切力反映肉的嫩度，剪切力越大則嫩度越差，一般用肌肉纖維對抗剪切的作用力大小表示[35]。從圖6可以看出，兩組剪切力均呈現先升后降的趨勢，第4天達到最大值，后期的降低可能是因為宰后肌肉經歷僵直后肌纖維開始被內源酶破壞，肌肉嫩度隨之增大，王琳琳等[27]對牦牛肉的剪切力測定結果為第3天達到最大值，與本研究存在差異，這可能是品種不同造成的。Rucaparib處理組牛肉剪切力始終高于對照組，在0～6 h上升程度大于對照組，4～8 d下降程度大致相同，抑制劑組剪切力較對照組略大一些。表明Rucaparib處理減緩了秦川牛宰后成熟過程中的嫩化速率。

圖6 宰后成熟過程中秦川牛背最長肌剪切力的變化Fig.6 Changes of shear force in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during postmortem aging

2.7 pH值的變化

pH值降低引起肌漿網功能受損，引起細胞凋亡蛋白酶活化，進而分解肌原纖維蛋白[36]。由圖7可知，宰后0 h測得對照組和Rucaparib處理組秦川牛背最長肌pH值，分別為6.34、6.36。隨著成熟時間延長，對照組與Rucaparib處理組pH值呈現先降后增的趨勢，抑制劑組0～12 h的降低速率低于2～4 d，對照組和Rucaparib處理組的極限pH值分別為5.52、5.64。且對照組的pH值在0 h～8 d內低于Rucaparib處理組，Rucaparib處理組第8天較對照組高3.3%。本研究與田甲春[37]實驗得出的宰后牛肉的pH值變化趨勢結果一致。以上實驗結果可能是由于抑制PARP1表達能夠減緩肌原纖維中能量代謝與蛋白分解速度。說明酸性環境有利于細胞凋亡的啟動，抑制PARP1表達減緩了pH值的下降。

圖7 宰后成熟過程中秦川牛背最長肌pH值變化Fig.7 Changes of pH in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during postmortem aging

2.8 PARP1表達水平的變化

孟曉燕[38]提出，Caspase-3表達水平的增高，以及由此導致的底物PARP切割，是誘發細胞凋亡的關鍵環節。如圖8所示，由Western Blot結果的條帶顏色可以看出，兩組樣品中PARP1蛋白表達在0 h差距較小，對照組PARP1蛋白表達水平在0 h～8 d持續上漲，8 d表達量是0 h的6.5 倍（P＜0.05），對照組PARP1蛋白表達水平在6 h～8 d分別是Rucaparib處理組的1.52、5.98、4.02、2.88、12.15 倍（P＜0.05）。Rucaparib處理組第1天表達量為0.94，第8天幾乎不表達。結果表明Rucaparib抑制了PARP1激活，Caspase-3無切割底物，并且儲存了NAD+和ATP，維持以ATP、NAD+為介質的生理學活動[20]，減弱牛肉宰后氧化應激反應，從而使肉質嫩化延緩。

圖8 宰后成熟過程中秦川牛背最長肌中PARP1表達水平變化Fig.8 Changes of PARP1 expression in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during postmortem aging

2.9 肌間線蛋白表達水平的變化

肌間線蛋白橫向連接線粒體膜、肌纖維，是重要的骨架蛋白，其降解對肉品嫩度形成具有直接作用[39]。結合圖9 中的免疫印跡條帶和表達量分析得出，6 h～8 d Rucaparib處理組肌間線蛋白降解程度小于對照組（P＜0.05），說明Rucaparib處理組肌間線蛋白降解在宰后受到抑制。對照組免疫印跡條帶在宰后成熟期間明顯變淺，表明肌間線蛋白降解程度增大，與張爽[40]用氯化鈣與茶多酚處理宰后奶山羊骨骼肌的研究結果一致。由此得出，在宰后成熟期間，抑制ADP核糖基化反應，可減緩肌間線蛋白的降解速度。

圖9 宰后成熟過程中秦川牛背最長肌中Desmin表達水平變化Fig.9 Changes of desmin expression in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during postmortem aging

3 結論

本實驗結果表明，0 h～8 d（12 h除外）抑制劑組ROS含量整體上顯著低于對照組（P＜0.05），宰后12 h抑制劑組Caspase-3活性、MFI顯著低于對照組（P＜0.05）；在2～4 d抑制劑組線粒體膜電位較對照組高，4～8 d抑制劑處理組SDH活性顯著高于對照組（P＜0.05）。通過抑制PARP1的活性發現肌細胞中ROS含量顯著減少，Caspase-3活性減弱，SDH活性升高，線粒體膜電位也升高，進而在肉品質方面表現為MFI降低，pH值下降速率變慢，剪切力變大，負責連接單個肌原纖維的肌間線蛋白降解變慢，因此得出，可通過抑制ADP核糖基化反應調控線粒體內源性途徑，使牛肉嫩化減緩。