自由基法多酚共價結合對大豆蛋白基乳液凝膠特性的影響

孟甘露，楚玉南，吳 儀，王菊兵，金 花，許 晶,

（1.東北農業大學文理學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省林業科學院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157000）

乳液凝膠具有復合網絡結構，一般為類固體狀態，可由蛋白質分子與油脂形成乳液脂滴后填充入凝膠基質制備，或由乳液脂滴在凝膠誘導條件下絮凝成形[1-2]。經研究，改性后的蛋白質具有更加優良的乳化性[3]、凝膠性[4]，常作為乳化劑和凝膠基質用于乳液凝膠的制備。乳液凝膠提高了乳液的熱力學穩定性，具有凝膠機械性能，目前在食品領域已廣泛應用于乳制品甜點、低脂肉制品、奶酪等。Cui Bing等[5]以大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）和可得然膠為原料，通過熱誘導法制備乳液凝膠，并與豬肉背膘比較，制備出植物性低脂肉制品類似物。同時，乳液凝膠近年來在親水性和親油性生物活性物質的包埋、給藥和釋放方面也受到了廣泛關注。Lin Duanquan等[6]分別以乳清分離蛋白、SPI為乳化劑和改性劑，制備海藻酸鈉基乳液凝膠珠，延緩了包埋物番茄紅素從乳液凝膠珠中的釋放。

SPI是常見的大豆蛋白產品，主要從脫脂豆粕中提取，具有豐富的營養價值以及乳化性、凝膠性、溶解性等多種功能特性，而改性處理又能使其功能特性得到進一步提升。例如，Lian Ziteng等[7]研究了琥珀酰化對SPI乳化性的影響，研究表明，琥珀酰化后的大豆蛋白分子的柔性增加，乳化性改善，所制備乳液的平均粒徑減小，界面蛋白吸附量增加，乳液穩定性提升。穆碩等[8]將SPI與果膠制得的復合物用于乳液凝膠的制備，研究表明，乳液體系中果膠質量分數越高，乳液凝膠形成的速率越快、時間越短，一定含量的果膠能夠顯著改善乳液凝膠的彈性。

多酚是廣泛存在于植物中含有一個或多個羥基取代基的芳香環次生代謝物，已報道的主要益處包括抗氧化、抗炎、抗菌、治療癌癥等[9]。蛋白質與多酚可以通過共價或非共價相互作用結合。Zhou Siduo等[10]發現SPI與(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯的共價結合物更易形成穩定的網絡結構，與非共價結合物相比，其熱穩定性和抗氧化性更好，且抗消化能力更強。多酚與蛋白質共價結合的方法有堿法、自由基法、酶催化法。其中，通過自由基法共價結合多酚可以提升蛋白質的凝膠性[11]、增強蛋白質的抗氧化性等。其可能的作用原理是，自由基氧化系統產生的羥自由基，將蛋白質側鏈上的氨基酸氧化還原形成活躍的自由基，再與多酚通過共價作用結合，生成C—N鍵及C—S鍵[12]。而引入的酚羥基和芳香基團能夠提高凝膠形成過程中的氫鍵作用和疏水作用力，從而提高蛋白的凝膠性[13]。此外，還有研究表明，多酚結合會改善蛋白的乳化性，降低乳液平均粒徑[14]。這有利于制備均勻致密的乳液凝膠，提高乳液凝膠體系的穩定性。但目前，通過自由基法多酚共價結合制備性質優良的蛋白質乳液凝膠還鮮見報道。

因此，本實驗研究了FA自由基共價結合法對SPI結構、乳液性質（平均粒徑、Zeta電位、界面蛋白含量、表觀黏度）和乳液凝膠性質（流變學分析、質構特性、持水性、水化性質、微觀結構）的影響，探討改性SPI在乳化劑和乳液凝膠應用方面的潛力，以期為開發高性能大豆蛋白乳液凝膠體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕 山東招遠食品有限公司；阿魏酸（ferulic acid，FA）、葡萄糖酸內脂（gluconolactone，GDL）、硅油 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；大豆油九三糧油工業集團有限公司；過氧化氫（H2O2）山東百特生物藥業有限公司；三氯化鐵 天津東麗區天大化學試劑廠；抗壞血酸、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）美國Sigma公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

L S 55 型熒光分光光度計 英國Perkin Elmer Llantrisant公司；ALPHA-T型傅里葉變換紅外光譜儀美國Bruker公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；FT200-SH型數顯高速均質分散機 上海標本模型廠；Malvern Nano-S90型納米激光粒度儀、Zetasizer Nano型Zeta電位分析儀 英國Malvern公司；TA-XT plus型質構儀 英國Stable Micro Systems公司；TCS SP8型激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）德國萊卡公司；低場核磁共振分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；JY92-2D型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Haake Mars 40型旋轉流變儀美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的提取

參考Jin Hua等[15]的方法，SPI從脫脂豆粕粉中提取。將豆粕粉與超純水料液比1∶10（g/mL）于pH 8.5條件下攪拌2 h，4000 r/min離心15 min，取離心后的上清液調pH值為4.5后靜置2 h，再于4000 r/min離心15 min，取沉淀物用超純水溶解并調pH值為7，凍干制得SPI粉末。蛋白質量分數由凱氏定氮法測定為（90.31±0.59）%。

1.3.2 自由基法制備大豆分離蛋白-阿魏酸（soy protein isolate-ferulic acid，SFA）

參考Yang Chen等[16]的方法，并稍加修改。將SPI室溫溶解于0.02 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，得質量濃度為20 mg/mL的SPI溶液，并于4 ℃條件下水化。水化后溶液與0.1%的自由基引發體系混合攪拌2 h，以10、50、150、250、500 μmol/g相對于SPI的量加入FA，所得混合液標記為SFA-10～SFA-500，將不同混合液于室溫下攪拌24 h后加入Trolox（1 mmol/L），終止氧化反應。在4 ℃條件下，PBS中透析（截留分子質量8～14 kDa）24 h，所得溶液凍干制得SFA凍干粉。

1.3.3 SPI乳液及乳液凝膠的制備

參考Feng Haiying等[17]的方法，采用超聲波法制備乳液。將SPI、SFA作為乳化劑，分別取質量濃度10 g/100 mL的SPI、SFA溶液10 mL與1.76 mL大豆油混合攪拌10 min制得粗乳液，將粗乳液置于10000 r/min條件下高速均質2.5 min。均質后在400 W條件下超聲處理15 min，制得水包油（O/W）型乳液。

根據Cui Bing等[5]方法并稍加修改，制備GDL誘導乳液凝膠。將制備好的SPI、SFA乳液在1000 r/min離心1 min，以去除氣泡。處理好的乳液在攪拌條件下加入GDL粉末，控制GDL用量使乳液pH值逐步下降并穩定在4.5。將混合物于40 ℃反應2 h，再于4 ℃冷藏12 h，制得SPI、SFA乳液凝膠。

1.3.4 自由基法多酚共價結合多酚添加量的確定

1.3.4.1 乳液凝膠的分子間作用力測定

不同多酚添加量下，乳液凝膠的分子間作用力由濁度反映[18]。配制4 種體系（SA～SD）：SA為超純水，SB為三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸（pH 8），SC為SB中加入十二烷基硫酸鈉和尿素，SD為SC中加入β-巰基乙醇。在20 mL上述體系中分別加入20 mg不同多酚添加量下的乳液凝膠，高速均質機10000 r/min均質1 min，常溫條件下攪拌1 h，再于10000 r/min、4 ℃離心15 min，500 nm波長處測定下層液體吸光度（A），乳液凝膠在不同體系中的濁度（T）計算公式如下：

式中：乳液凝膠溶于4 種體系中的濁度分別為TA、TB、TC、TD，靜電相互作用為TB-TA，非共價相互作用為TC-TB，二硫鍵為TD-TC；I為光程（0.01 m）。

1.3.4.2 乳液凝膠的質構特性測定

根據Zhao Haibo等[4]報道的方法，使用質構儀測量乳液凝膠硬度、咀嚼性、彈性等。直徑1 cm×厚度1 cm的乳液凝膠經壓縮后為原始厚度的30%，兩次壓縮間隔5 s。分析前，將4 ℃、12 h貯藏后的乳液凝膠在室溫下平衡6 h。使用P/36探頭測試，測試前速率1 mm/s，測試速率5 mm/s，測試后速率5 mm/s，觸發力5.0 g。

1.3.4.3 乳液凝膠持水性測定

持水能力根據Cui Bing等[5]的方法測定。在聚乙烯（polyethylene，PE）管中加入5 mL乳液凝膠，于4 ℃、10000 r/min離心15 min，離心后去除水分，持水性計算公式如下：

式中：mt為離心前乳液凝膠與PE管的總質量/g；mr為離心后去除水分的乳液凝膠與PE管的總質量/g；m0為PE管的質量/g。

1.3.5 SPI結構的測定

1.3.5.1 傅里葉變換紅外光譜測定

參考Li Dan等[19]的方法，用傅里葉變換紅外光譜儀測定FA結合后SPI的結構變化。將凍干樣品與KBr混合研磨，壓片檢測。掃描范圍：4000～400 cm-1，分辨率：4 cm-1，掃描次數：64 次，剪切酰胺I帶（1600～1700 cm-1）光譜，用PeakFit V4軟件擬合，計算分析樣品二級結構相對含量變化。

1.3.5.2 內源熒光光譜測定

根據Wang Bo等[20]方法并稍加修改，用熒光分光光度計測定SPI、最佳多酚添加量下的SFA的熒光光譜。用pH 7.0、0.01 mol/L的PBS稀釋樣品至0.2 mg/mL，以激發波長290 nm，發射波長300～450 nm，發射狹縫和激發狹縫均為5 nm為條件掃描熒光光譜。

1.3.6 乳液性質的測定

1.3.6.1 粒徑及Zeta電位測定

用納米激光粒度儀、Zeta電位分析儀分別測定SPI乳液的粒徑及Zeta電位。乳液經pH 7.0、0.01 mol/L的PBS稀釋100 倍后測量。

1.3.6.2 界面蛋白含量測定

參考Chen Maoshen等[21]的方法測定，并稍加修改。將乳液在10000 r/min離心45 min，取底層溶液經濾膜（0.45 μm）過濾，界面蛋白含量計算公式如下：

式中：ρ0為初始蛋白溶液的蛋白質量濃度/（g/L）；ρS為初始蛋白溶液離心后的上清液蛋白質量濃度/（g/L）；ρf為乳液離心后的底層溶液蛋白質量濃度/（g/L）。

1.3.6.3 表觀黏度測定

用旋轉流變儀測定乳液的表觀黏度。在半徑40 mm、間距1 mm的兩平行板間放置新制備的乳液，用30 s時間平衡。其他條件為溫度25 ℃、剪切速率0.01～100 s-1。表觀黏度（η）與剪切速率（γ）可以通過Ostwald-de Waele經驗公式[22]分析：

式中：K為稠度系數；γ為剪切系數；n為流動特性指數。

1.3.7 乳液凝膠性質及結構的測定

1.3.7.1 低場核磁共振測定

使用低場核磁共振分析儀測定乳液凝膠樣品的水合特性[23]。將乳液凝膠置于色譜瓶中，40 ℃孵育2 h后放入4 ℃冰箱12 h，測試前在室溫下穩定30 min。在測量溫度32 ℃，質子共振頻率22 MHz的條件下重復掃描8 次，采樣間隔100 μs，重復間隔6500 ms，回波個數12000。

1.3.7.2 流變性能測定

旋轉流變儀對乳液凝膠樣品進行的測定參考Roullet等[24]的方法，并稍加修改。對乳液凝膠進行的掃描包括：時間掃描、應變掃描和頻率掃描。在頻率掃描中，存儲模量G’與頻率ω的關系通過式（5）進行擬合：

式中：K’為冪次定律常數；n’為頻率指數。

1.3.7.3 微觀結構測定

參考Pei Zhisheng等[25]的方法，掃描電子顯微鏡觀察乳液凝膠樣品微觀結構。將3 mm×3 mm×1 mm的乳液凝膠塊固定，無水乙醇洗脫后用戊二醛、乙醇混合液（1∶1，V/V）置換，15 min后置于純戊二醛中-20 ℃冷凍12 h，取出后噴金觀察。

參考Xi Zewen等[22]的方法，CLSM觀察乳液凝膠樣品微觀結構。染色新制備的乳液（尼羅紅（0.1%）和尼羅藍（1%）），然后向混合液中加入GDL（最終pH 4.5）攪拌30 s，立刻取1 μL于載玻片上并蓋片除氣泡。在40 ℃、避光條件下反應2 h，然后將樣品置于CLSM下觀察，激發波長：633 nm和488 nm。

1.4 數據分析

所有實驗進行3 次平行重復。數據用SPSS Statistics 25軟件進行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Oringe 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SPI乳液凝膠FA添加量的確定

2.1.1 乳液凝膠的分子間作用力

濁度測定和分析是反映蛋白質與多酚相互作用較為直觀的方法，在多酚的結合下，蛋白質復雜聚集結構的數量和大小會產生變化，從而導致濁度的變化。如圖1A所示，SPI乳液凝膠及5 個不同FA添加量下的SFA乳液凝膠均呈現不易流動的半固體狀態。靜電相互作用、非共價相互作用和二硫鍵為主要參與SPI乳液凝膠形成的分子間作用力，其中以非共價相互作用（氫鍵、疏水相互作用）為主。如圖1B所示，SPI與多酚以自由基法共價結合后，靜電相互作用的含量基本保持不變（P＞0.05）；非共價相互作用的含量上升較為顯著（P＜0.05），在FA添加量增加至150 μmol/g及更高時，含量變化趨于穩定（P＞0.05）；二硫鍵含量則呈現下降趨勢（P＜0.05），直至添加量為250 μmol/g及以上時，二硫鍵含量變化趨于穩定。非共價相互作用的含量較高，主要歸因于氫鍵及疏水相互作用。據報道，酚類物質的基團具有供氫作用，其羥基基團可與蛋白質的羥基和氨基等相互作用形成氫鍵[26-27]。SFA乳液凝膠在形成過程中，多酚共價結合會帶來蛋白質結構變化[9]，蛋白質的疏水基團暴露，產生的疏水氨基酸殘基與多酚的非極性芳環之間產生疏水相互作用。當FA添加量不低于150 μmol/g時，非共價相互作用含量維持穩定，可能是由于SPI與FA的結合已飽和，多酚對蛋白質結構的影響達到頂峰，導致非共價相互作用的變化不再顯著[28]。二硫鍵的含量變化是由于蛋白質的側鏈氨基酸經氧化還原形成活躍自由基，產生較多游離巰基和游離氨基，而多酚與蛋白質的共價結合消耗了游離巰基，使得SPI乳液凝膠中的二硫鍵含量降低[29]。因此，以乳液凝膠中最主要的非共價相互作用為指標，由于250、500 μmol/g的FA添加量對非共價相互作用的影響已經不大，所以選取150 μmol/g為制備SFA乳液凝膠的最佳FA添加量。

圖1 SFA乳液凝膠的分子間作用力Fig.1 Intermolecular interactions in SFA stabilized emulsion gels

2.1.2 乳液凝膠的質構特性

由表1得出，多酚自由基法共價結合后，SPI乳液凝膠的硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性都得到顯著提高（P＜0.05），其中咀嚼性能提高的幅度最大。硬度、彈性、黏聚性和咀嚼性隨FA添加量的上升均顯著提高（P＜0.05），直至FA添加量為150 μmol/g及更高時，4 個質構特性不再發生顯著變化（P＞0.05）。多酚的結合使得蛋白質聚集體的數量和尺寸產生變化，從而導致質構參數的改善[4]。多酚與SPI結合過程中，由圖1可知，添加多酚后，乳液凝膠中的非共價相互作用逐漸增強，這有利于凝膠網絡的形成，因此SPI乳液凝膠的質構特性也隨之提高。Cao Yungang等[30]探究豬肌原纖維蛋白凝膠在不同綠原酸添加量下的變化，也得出了相似的結果。FA添加量150 μmol/g及以上時，SPI乳液凝膠質構性能穩定，可能是因為SPI和FA已結合至飽和狀態，FA對SPI乳液凝膠質構特性的影響不再顯著。因此，綜合考慮SPI乳液凝膠4 種質構特性的變化，選取150 μmol/g為制備SFA乳液凝膠的最佳FA添加量。

表1 不同FA添加量下SFA乳液凝膠的質構特性Table 1 Textural properties of SFA stabilized emulsion gels with different FA concentrations

2.1.3 乳液凝膠的持水性

如圖2所示，自由基法多酚的共價結合使SPI乳液凝膠的持水性顯著提高（P＜0.05），直至FA添加量為150 μmol/g及更高時，持水性的變化趨于平緩（P＞0.05）。SPI乳液凝膠持水性的顯著提高可能有兩方面原因：一方面，持水性的提高可能是由于乳液凝膠的分子間作用力增強（圖1），促進蛋白質間的交聯，形成的乳液凝膠結構更加均勻致密；另一方面，多酚本身的水分子束縛力也有利于乳液凝膠的持水能力提高。此外，Fan Yuting等[31]發現自由基法多酚共價結合可以增強蛋白質的乳化性，使乳液的平均粒徑減小。乳液中的液滴粒徑減小后，再經誘導交聯的乳液凝膠結構更加均勻致密，乳液凝膠的持水性增強[32]。

圖2 SFA乳液凝膠的持水性Fig.2 Water-holding capacity of SFA stabilized emulsion gels

由不同添加量的多酚自由基法共價結合后，SFA乳液凝膠持水性及分子間作用力、質構特性的整體變化情況，最終選取150 μmol/g為制備SFA乳液凝膠的最佳FA添加量。

2.2 自由基法多酚結合對SPI結構的影響

2.2.1 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜中的1600～1700 cm-1是酰胺I帶光譜，常對此光譜擬合獲得積分面積，以面積比反映蛋白質α-螺旋（1650～1660 cm-1）、β-折疊（1600～1640 cm-1）、β-轉角（1660～1700 cm-1）和無規卷曲（1640～1650 cm-1）的含量變化。如表2所示，SPI與最佳添加量的FA結合后，β-折疊含量顯著下降（P＜0.05），α-螺旋含量、β-轉角含量和無規卷曲含量均顯著上升（P＜0.05），說明了蛋白質與多酚發生交聯，構象產生大規模重排，蛋白質分子變得高度無序。在多酚結合下，蛋白質展開，β-折疊含量減少；α-螺旋主要由氫鍵維持，多酚結合引入氫鍵，α-螺旋含量相應升高。這與Jian Lianzhou等[33]對花色苷與大豆蛋白共價復合物紅外光譜的分析結果相似。

表2 多酚共價結合對SPI二級結構相對含量的影響Table 2 Effect of covalent binding to FA on the relative contents of secondary structures in SPI %

2.2.2 熒光光譜分析

蛋白質分子中含有發色基團（色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）），發色基團附近的微環境發生改變會影響發色基團的表達，導致蛋白質的熒光峰位和熒光強度變化。SPI與多酚結合后的熒光光譜如圖3所示，SFA與SPI相比，熒光強度下降，熒光峰位由336.0 nm紅移至340.2 nm。據報道，蛋白質中的Trp和Tyr基團會參與多酚與蛋白質的共價結合，導致其含量下降[34]。因此，熒光強度的下降可能是由于Trp、Try基團參與了SPI與FA的相互作用。蛋白質與多酚的共價結合對SPI的結構會產生不可逆影響，蛋白質側鏈上的Trp和Tyr基團暴露在親水環境里，導致了熒光峰位的紅移[35]。

圖3 SPI和SFA的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of SPI and SFA

2.3 自由基法多酚結合對SPI乳液性質的影響

2.3.1 乳液基本性質

經FA 共價結合后的SPI乳液基本性質如表3 所示。在多酚的結合下，SFA乳液的平均粒徑顯著減小（P＜0.05），Zeta電位絕對值顯著增大（P＜0.05），界面蛋白含量顯著增大（P＜0.05）。SFA乳液平均粒徑的減小表明，經FA結合的SPI作為乳化劑，能夠更好地在油-水界面吸附以穩定乳液。這與Fan Yuting等[31]的研究結果一致。Zeta電位絕對值的增大表明，蛋白質液滴表面電荷量增加，液滴不易聚集，有利于乳液平均粒徑減小，乳液穩定性提高。Zeta電位增大的可能原因是，酚酸的酚羥基去質子化產生大量負電荷，蛋白質與酚酸的結合引入負電荷基團，使蛋白質乳液的Zeta電位絕對值增大[36]。SFA乳液界面蛋白含量的增加，可能是由于多酚平衡了蛋白質的雙親性，蛋白質在油-水界面的吸附更快更強，促使生成更厚的油-水界面膜[37]。乳液的Zeta電位和界面蛋白含量變化都與液滴平均粒徑的減小保持一致，而平均粒徑越小，越有利于形成具有緊密多孔結構的乳液凝膠。因此，多酚共價結合帶來的乳液性質變化，有利于SPI乳液凝膠性質的提升。

表3 多酚共價結合對SPI乳液的平均粒徑、Zeta電位和界面蛋白含量的影響Table 3 Effect of covalent binding to FA on average particle size,zeta potential and interfacial protein content of SPI stabilized emulsions

2.3.2 乳液表觀黏度

多酚共價結合后，SPI乳液表觀黏度的變化如表4所示，稠度系數K顯著下降（P＜0.05），流動特性指數n顯著上升（P＜0.05）。K值的下降表明，SFA乳液表觀黏度低于SPI乳液，這可能是由于SFA乳液的平均粒徑較小、Zeta電位絕對值較大（表3），乳液流動阻力小，乳液的液滴不易聚集，導致黏度降低。SPI經多酚共價結合后，SFA乳液的n值增大，更加趨近于1，由圖4可以看出乳液的表觀黏度進一步降低，表明多酚共價結合后乳液黏度對剪切速率的依賴性變小[22]。李春翼等[38]將蘆丁-麥醇溶蛋白復合物穩定的乳液進行流變學測定，結果表明，蘆丁能夠影響麥醇溶蛋白乳液的流變特性，使蘆丁-麥醇溶蛋白復合物穩定的乳液表觀黏度降低。

表4 多酚共價結合對SPI乳液表觀黏度影響Table 4 Effect of covalent binding to FA on apparent viscosity of SPI emulsions

圖4 多酚共價結合對SPI乳液表觀黏度-剪切速率流動曲線的影響Fig.4 Effect of covalent binding to FA on apparent viscosity-shear rate curve of SPI stabilized emulsions

2.4 自由基法多酚結合對SPI乳液凝膠性質及微觀結構的影響

2.4.1 時間及頻率掃描測試

乳液凝膠的黏彈性可以由小幅振蕩流變學測定出的G’和損耗模量（G”）反映，SPI乳液凝膠和SFA乳液凝膠的黏彈性情況如圖5所示。兩種乳液凝膠的G’和G”均呈現隨時間延長而上升，最后穩定的趨勢。SPI、SFA乳液凝膠的G’和G”隨時間延長逐漸上升的原因是乳液凝膠制備過程中GDL的加入，增強了體系中蛋白質分子之間的交聯，復合網絡結構逐步形成。最后趨于穩定可能是參與交聯的游離蛋白質分子減少，以及凝膠結構的基本形成。SPI、SFA乳液凝膠的G”在起始時大于G’，隨時間的延長，G’的數值大于G”，這表明乳液體系中的彈性特征逐漸占據主導，乳液凝膠形成類固體狀態。SFA乳液凝膠的最終G’大于SPI乳液凝膠，可以歸因于多酚的共價結合促進了乳液凝膠的非共價相互作用（圖1），降低了乳液平均粒徑（表3），導致單位體積內能夠形成更多交聯位點，因此，相較于SPI乳液凝膠，SFA乳液凝膠的彈性更強。G’在0～500 s之間的波動可能是由于凝膠在此時間內形成較快，儀器無法準確捕捉[13]。Tang Changbo等[39]研究了多酚類物質迷迭香酸對豬肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，G’測定結果表明，0.05～0.25 mmol/L迷迭香酸的加入均提高了豬肌原纖維蛋白凝膠的G’。

圖5 多酚共價結合SPI乳液凝膠的G’和G”Fig.5 Storage and loss modulus vs.time curves of SPI or SFA stabilized emulsion gels

頻率掃描可以表征乳液凝膠的G’和G”對角頻率（ω）的依賴性。如圖6所示，角頻率與G’、G”呈正相關。表5中，n’值可以作為乳液凝膠黏彈性的重要指標，n’＝0表現為純彈性凝膠，當n’逐漸增大時，凝膠結構中的黏性性質逐漸增強[21]。因此，多酚共價結合后n’值顯著降低（P＜0.05）、K’值顯著增加（P＜0.05），表明SFA乳液凝膠的凝膠性能得到提高，彈性更強。Guo Yang等[40]的研究結果與本實驗相似。

表5 多酚共價結合SPI乳液凝膠的頻率相關性參數Table 5 Frequency dependence parameters of Power law models for SPI or SFA stabilized emulsion gels

圖6 多酚共價結合SPI乳液凝膠的頻率掃描Fig.6 Storage and loss modulus vs.frequency curves of SPI or SFA stabilized emulsion gels

2.4.2 水合特性

乳液凝膠的不易流動態和自由流動態水分子中含有H1質子，H1質子的相互交換遷移規律可以由低場核磁共振技術檢測得到，由此表征乳液凝膠水合特性，得出的結果見表6。多酚共價結合后，SPI乳液凝膠的弛豫時間T22、T23下降顯著（P＜0.05），峰比例分布中，P22呈現上升趨勢（P＜0.05），P23呈現下降趨勢（P＜0.05）。弛豫時間和峰比例的變化表明乳液凝膠中不易流動水的含量升高，自由流動水的含量降低，即SFA乳液凝膠具有更強的水分子結合能力。這可以歸因于兩個方面，一是FA的結合使得乳液凝膠網絡結構更加均勻和致密，凝膠特性增強[13]；二是多酚物質自身具有的水分子束縛力。這與持水性的分析結果一致（圖2）。

表6 多酚共價結合SPI乳液凝膠的弛豫時間及峰比例分布Table 6 Relaxation time and peak ratio distribution of SPI or SFA stabilized emulsion gels

2.4.3 微觀結構表征

由圖7A、B可以看出，SPI乳液凝膠的孔洞較大；經過自由基法多酚共價結合后的SFA乳液凝膠孔洞相對較小，微觀結構更加均勻致密。Xu Jing等[13]也研究發現多酚共價結合后的大豆蛋白乳液凝膠具有更致密、均勻的多孔結構，油滴能更好地嵌入到凝膠的網絡結構中。

圖7 多酚共價結合對SPI乳液凝膠微觀結構的影響Fig.7 Effect of covalent binding to FA on microstructure of SPI stabilized emulsion gels

SPI乳液凝膠和SFA乳液凝膠的CLSM觀察照片如圖7C、D所示，其中C、D兩圖的背景顏色差異來源于不同樣品的熒光信號強弱不同。HuoWenbo等[41]用CLSM掃描改性豌豆分離蛋白為原料制備的乳液凝膠，也存在背景顏色不一致的現象。由圖7可知，SPI乳液凝膠的三維網絡結構中，不均勻地分布著大小不一的乳液液滴；經過多酚共價結合后，SFA乳液凝膠的結構更加致密，乳液凝膠孔洞變小，可以直觀地比較出，作為凝膠結構支撐的乳液液滴粒徑更小，更均勻。這與SEM的結果相符。SPI乳液凝膠微觀結構受多酚共價結合的影響與質構特性、持水性、流變性及水合特性的分析結果一致，即多酚共價結合后乳液凝膠的多孔網絡結構更加均勻致密。

3 結論

本實驗利用自由基法，以FA共價結合改性SPI，在FA添加量150 μmol/g的最佳條件下制備SFA復合物，并以改性后的SPI為乳化劑、凝膠基質制備乳液凝膠。通過對FTIR光譜和熒光光譜的結果分析發現，SPI在經FA共價結合后α-螺旋、β-轉角和無規卷曲含量均顯著上升，β-折疊含量顯著下降，熒光強度下降、熒光峰位紅移。相較于SPI乳液，經FA共價結合SPI形成的SFA乳液平均粒徑顯著減小、Zeta電位絕對值顯著增大、界面蛋白含量顯著增大、表觀黏度下降。SFA乳液凝膠與SPI乳液凝膠相比，終G’升高，體系中的不易流動水含量升高，自由流動水含量降低，表明SFA乳液凝膠材料的彈性性質更強，并具有更好的水合特性。此外，SEM和CLSM圖片顯示，FA的共價結合使SPI乳液凝膠的多孔網絡結構更加均勻致密。以上結果表明，自由基法多酚共價結合是提高SPI乳液凝膠性質的可行方法，為乳液凝膠在食品領域的廣泛應用提供理論支撐。