綠豆蛋白α-淀粉酶抑制肽的制備與鑒定

李永富，王雅茹，黃金榮，史 鋒

（1.江南大學食品學院，糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122）

隨著生活水平的提高，我國糖尿病發病率在1980—2017年增加了15 倍以上[1]，其中2型糖尿病占90%以上[2]。目前2型糖尿病的治療方式包括服用降糖藥物和注射胰島素。部分口服藥物可作為α-淀粉酶抑制劑，抑制酶活性，阻斷淀粉水解，調控血糖水平[3]。然而藥物治療具有副作用大[4]、價格昂貴[5]、患者依從性差[6]等缺點，因而尋找來自天然產物、安全有效的α-淀粉酶抑制劑很有必要。

近年來，食源性降糖肽顯示出良好的研究前景，多種植物已被證明能夠產生α-淀粉酶抑制肽，調控血糖水平，如玉米[7]、蕎麥[8]、大麥[9]、竹筍[10]等。在眾多植物中，綠豆蛋白具有含量高、提取方式簡單等優勢。已有研究證明，食用綠豆蛋白可以有效改善糖脂代謝[11]。么楊[12]發現綠豆及綠豆芽可以顯著降低糖尿病小鼠血糖水平和葡萄糖耐受性；王琦等[13]使用凝膠層析從綠豆中提取并純化出了蛋白質量分數為84.7%的α-淀粉酶抑制劑，證實了綠豆蛋白作為α-淀粉酶抑制劑應用于糖尿病相關治療中的可能性。

目前，模擬胃腸道消化制備的綠豆蛋白及其分級蛋白肽對α-淀粉酶活性抑制效果的研究較少，因此本研究首先采用胃-胰蛋白酶水解綠豆蛋白及其分級蛋白（清蛋白、球蛋白、谷蛋白），以α-淀粉酶活性抑制率為主要指標，篩選蛋白水解組分進行深入研究，然后采用凝膠過濾柱層析（gel filtration column chromatography，GFC）和反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）對其進行分離純化，最后采用納米液相色譜-串聯質譜（Nano liquid chromatography-tandem mass spectrometry，Nano LC-MS/MS）鑒定出具有α-淀粉酶抑制效果的綠豆蛋白肽序列，以期為綠豆的降血糖活性提供更多依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆 無錫市朝陽糧油交易市場。

乙腈、三氯乙酸（均為色譜純）國藥集團藥業股份有限公司；葡萄糖試劑盒 北京利德曼生化股份有限公司；胃蛋白酶（2500 U/mg）、胰蛋白酶（1500 U/mg）、α-淀粉酶（14 U/mg）Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；糖化酶（10000 U/mL）山東隆科特酶制劑有限公司；所有分析用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2100 分光光度計 美國UNICO 公司；AKTA Avant 25蛋白純化儀 美國通用電氣醫療集團；半制備HPLC儀 沃特世科技（上海）有限公司；Q-Exactive質譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆蛋白及分級蛋白的分離提取

綠豆蛋白的提取參考侯佩琳[14]的方法，略作修改。以脫脂綠豆粉為原料，料水比1∶15（g/mL）、pH 9.0、40 ℃條件下提取20 min，然后5000 r/min離心10 min；取上清液調節pH 4.0，沉淀30 min，5000 r/min離心10 min，保留底層沉淀，透析、凍干，即為綠豆蛋白。

綠豆分級蛋白的提取參考喬寧[15]的方法，略作修改。以脫脂綠豆粉為原料，料水比1∶10（g/mL），以去離子水浸提4 h，離心，調節上清液pH值至等電點并沉淀1 h，離心、透析、凍干獲得綠豆清蛋白；向提取清蛋白后的殘渣中以料液比1∶10（g/mL）加入1 mol/L NaCl溶液浸提4 h，離心、透析、凍干獲得球蛋白；向提取球蛋白后的殘渣中以料液比1∶10（g/mL）加入70%乙醇溶液浸提4 h，離心、透析、凍干獲得醇溶蛋白；向提取醇溶蛋白后的殘渣中以料液比1∶10（g/mL）加入0.5 mol/L NaOH溶液浸提4 h，使用三氯乙酸沉淀得到谷蛋白。蛋白純度的測定采用凱氏定氮法。

1.3.2 胃-胰蛋白酶水解制備肽

綠豆蛋白及其分級蛋白肽通過胃-胰蛋白酶水解進行制備，參考Minekus等[16]的方法，略作修改。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）配制分散液，調節pH 2.0，加入適量胃蛋白酶，使體系中胃蛋白酶濃度達到2000 U/mL，37 ℃水解2 h；然后調節pH 7.0，加入適量胰蛋白酶，使體系中胰蛋白酶濃度達到325 U/mL，37 ℃水解6 h，沸水浴30 min以滅酶，冷卻后8000 r/min離心10 min，上清液-20 ℃保存。

1.3.3 綠豆蛋白肽對α-淀粉酶活性抑制效果的測定

參考Karimi等[7]的方法，略作修改。樣品組取0.5 mL水解液和0.5 mLα-淀粉酶溶液（10 U/mL），37 ℃溫育35 min，加入2%的可溶性淀粉溶液1 mL，37 ℃反應10 min。取100 μL反應液于900 μL無水乙醇中滅酶，10000 r/min離心5 min，取200 μL上清液與1.5 mL葡萄糖氧化酶溶液混合，37 ℃反應10 min，于520 nm波長處測定吸光度A。對照組用PBS代替樣品；空白組用PBS代替淀粉。以阿卡波糖作陽性對照。α-淀粉酶活性抑制率按下式計算：

1.3.4 水解度的測定

水解度的測定采用甲醛滴定法，參照張小娟[17]的方法略作修改，并按下式計算。5 mL水解液與60 mL去離子水混合均勻，用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定至pH 8.2，加入pH 8.2的甲醛溶液20 mL，用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定至pH 9.2，記錄下第2次滴定消耗的0.1 mol/L NaOH溶液體積，將樣品換成去離子水后用同樣的方法滴定作空白，計算水解液中的游離氨基氮。采用凱氏定氮法測定樣品中的總氮濃度。

式中：c為樣品中的游離氨基氮濃度/（mol/L）；ctot為樣品中的總氮濃度/（mol/L）；V0為滴定去離子水消耗的0.1 mol/L NaOH標準溶液體積/mL；V1為滴定樣品消耗的0.1 mol/L NaOH標準溶液體積/mL；V為樣品總體積/mL；N為0.1 mol/L NaOH標準溶液的準確濃度/（mol/L）。

1.3.5 蛋白組成分析

參考劉瀟等[18]的方法，略作修改。樣品與上樣緩沖液以1∶1（V/V）配制，沸水浴3～5 min，10000 r/min離心1 min，取上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳結束后，以考馬斯亮藍R-250染色30～40 min后，以去離子水脫色，用凝膠成像儀拍照分析。

1.3.6 氨基酸組成測定

根據GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》進行。

1.3.7 肽分子質量的測定

采用HPLC分析水解液中的肽分子質量。色譜柱：TSK Gel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動相：乙腈、水、三氟乙酸；流速：0.5 mL/min；檢測波長220 nm。

1.3.8 綠豆蛋白活性肽的純化與鑒定

選擇對α-淀粉酶活性抑制效果最強的綠豆蛋白肽，采用GFC和RP-HPLC進一步純化，最終以Nano LC-MS/MS鑒定肽序列。

1.3.8.1 GFC

采用GFC純化綠豆蛋白肽。凝膠柱：Superdux Peptide 10/300GL（24 mL）；洗脫條件：蒸餾水為洗脫液，洗脫體積1.5 CV，洗脫速率0.3 mL/min；檢測波長220 nm。收集各個組分，測定各組分的α-淀粉酶活性抑制率及肽分子質量，篩選出抑制率最高的組分進一步純化。

1.3.8.2 RP-HPLC

采用RP-HPLC進一步純化。色譜柱：Waters Xbridge Prep C18柱；流動相A：90%超純水+10%乙腈（包含0.1%三氟乙酸）；流動相B：90%乙腈+10%超純水（包含0.1%三氟乙酸）；梯度洗脫程序：0～5 min，90% A、10% B；5～30 min，90%～40% A、10%～60% B；30～35 min，40% A、60% B；35～55 min，40%～10% A、60%～90% B；流速2 mL/min；進樣量1 mL；檢測波長220 nm。收集各個組分，測定各組分的α-淀粉酶活性抑制率，篩選抑制率最高的組分鑒定肽序列。

1.3.8.3 Nano LC-MS/MS鑒定肽序列

系統：串聯EASY-Nano LC 1200的Q-Exactive質譜儀；分析柱：Acclaim Pep Map C18（75 μm×25 cm）；流動相A：80%乙腈+0.1%甲酸，流動相B：超純水（含0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～46 min，0%～60% A、100%～40% B；46～50 min，60%～100% A、40%～0%B；50～60 min，100% A、0% B。流速400 nL/min；柱溫40 ℃；進樣量1 μL；電噴霧電壓2 kV。

質譜儀在數據依賴采集模式下運行，自動在MS和MS/MS采集間切換。MS：掃描范圍m/z200～1800；分辨率70000；自動增益控制目標值3×106；最大注入時間60 ms。高能碰撞解離-串聯質譜：分辨率17500；自動增益控制目標值5×104；最大注入時間80 ms；碰撞能量27 eV；動態排除時間20 s。

選取可信度在0.5以上的肽序列通過PeptideRanker預測生物活性，評分大于0.8的肽序列進行疏水性篩選，截取數值大于0.5的肽序列，通過BIOPEP等數據庫進行查重。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 綠豆蛋白及其分級蛋白的提取

表1顯示：綠豆蛋白的純度最高，為94.24%，其次分別是綠豆清蛋白（84.71%）、綠豆谷蛋白（81.89%）、綠豆球蛋白（75.71%）和綠豆醇溶蛋白（3.11%）。結果同李永武[19]的研究相符，在分級蛋白中含量最高的是清蛋白。因為綠豆蛋白中所含的醇溶蛋白較少，且乙醇提取物中會摻雜其他極性成分[20]，因此醇溶蛋白不作為本實驗研究對象。

表1 綠豆蛋白及其分級蛋白純度Table 1 Purity of mung bean protein and its protein fractions

2.2 綠豆蛋白及其分級蛋白肽對α-淀粉酶抑制效果

采用胃-胰蛋白酶連續水解綠豆蛋白及其分級蛋白（綠豆清蛋白、球蛋白、谷蛋白），并測定其肽對α-淀粉酶活性的抑制率，結果如圖1A所示，相同質量濃度下（4 mg/mL），綠豆蛋白及其分級蛋白肽均對酶有抑制效果，但與阿卡波糖相比抑制率低（圖1B）。其中綠豆蛋白肽對酶的抑制率最高，為16.51%。有研究表明，不同蛋白或肽之間可以通過協同效應來增強作用效果[21]，這可能是綠豆蛋白肽比其分級蛋白肽具有更高的α-淀粉酶抑制活性的原因。3 個分級蛋白中，清蛋白肽和谷蛋白肽的抑制率較高，分別為12.59%和13.33%（P＞0.05），球蛋白肽抑制率最低，為8.78%；這與Ninomiya[22]和Bozkurt[23]等的研究結果相符，他們發現蕎麥清蛋白肽和小麥谷蛋白肽具有良好的降血糖活性。

圖1 綠豆蛋白及其分級蛋白肽對α-淀粉酶活性的抑制效果Fig.1 α-Amylase inhibitory effects of peptides from mung bean protein and from its protein fractions

2.3 綠豆蛋白及其分級蛋白的水解程度分析

為了對比綠豆蛋白及其分級蛋白的水解程度，探究它們在α-淀粉酶活性抑制方面產生差異的原因，本研究測定4 種蛋白的水解度及其水解前后的分子質量，結果如圖2所示。圖2A顯示，4 個蛋白水解度按照降序排列依次是綠豆蛋白（6.28%）、綠豆清蛋白（6.02%）、綠豆球蛋白（5.31%）和綠豆谷蛋白（5.20%）。這表明，蛋白的水解度與其肽對α-淀粉酶的抑制率呈正相關，水解程度越高，分子質量越小，對α-淀粉酶活性的抑制率也越高，這一結果同Vilcacundo等[24]的研究結果相近。但谷蛋白可能由于溶解度低而致使水解度較低[25]。

蛋白水解前后分子質量分布采用SDS-PAGE測定。由圖2B可知，綠豆蛋白的電泳條帶出現在60、50、28、23 kDa，此結果與曾志紅等[26]對綠豆蛋白分子質量的測定結果基本相符。經過水解后，綠豆蛋白肽在20 kDa以下出現均勻連續且顏色清晰的條帶，表明綠豆蛋白中的大分子蛋白被水解為小分子蛋白和肽，與之相對應的是綠豆蛋白的水解度和其肽對α-淀粉酶活性的抑制率最高。綠豆清蛋白和球蛋白的電泳條帶分別出現在56、37～50、26、24、20 kDa和50、20～25、15 kDa。水解后，綠豆清蛋白和球蛋白的肽在10～50 kDa之間出現連續條帶，表明與綠豆蛋白相比，它們水解不完全，仍有少部分大分子蛋白未被水解，與之對應的是兩種蛋白的水解度以及它們的肽對α-淀粉酶活性抑制率較低。綠豆谷蛋白僅在50 kDa處出現一條電泳條帶，可能是其溶解度低[25]，導致其含量低[27]。水解后，綠豆谷蛋白肽的分子質量沒有明顯變化，同樣在50 kDa處出現一條條帶，但是相比于水解前，條帶細且色淺，表明有部分大分子蛋白被水解，所以其水解度最低。綜上所述，僅有綠豆蛋白被全部水解成分子質量小于20 kDa的肽段，與其高水解度以及其肽對α-淀粉酶活性的高抑制率結果相對應，該結果支持了小分子肽對α-淀粉酶具有高抑制率的理論[28]。

2.4 綠豆蛋白及其分級蛋白中的氨基酸組成

蛋白質及肽的活性與其所含的氨基酸種類及含量密切相關[29]，為進一步探索綠豆蛋白及其分級蛋白α-淀粉酶活性抑制差異的原因，本研究測定了蛋白的氨基酸組成及質量分數，結果如表2所示。4 個蛋白的氨基酸組成及質量分數具有明顯差異，其中精氨酸含量按照降序排列依次是綠豆蛋白（7.23%）、清蛋白（6.48%）、谷蛋白（4.07%）、球蛋白（3.91%），芳香族氨基酸含量按照降序排列依次是綠豆蛋白（8.73%）、清蛋白（7.92%）、谷蛋白（5.95%）、球蛋白（5.68%），疏水氨基酸含量按照降序排列依次是綠豆蛋白（32.68%）、清蛋白（29.32%）、球蛋白（23.02%）、谷蛋白（20.77%）。有研究表明，精氨酸、芳香族氨基酸、疏水氨基酸的高含量與強生物活性功能相關，包括高抗氧化、脂肪酶抑制、α-淀粉酶抑制活性[30]。因此綠豆蛋白中的高精氨酸、芳香族氨基酸和疏水氨基酸含量，可能是其肽具有高α-淀粉酶抑制活性的原因之一。此外，同3 個分級蛋白相比，綠豆蛋白中含有更多的苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸和精氨酸殘基等胃-胰蛋白酶的切割位點，因此綠豆蛋白的水解程度最高，這有助于提升其肽對α-淀粉酶活性的抑制效果。

表2 綠豆蛋白及其分級蛋白氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of mung bean protein and its protein fractions %

2.5 綠豆蛋白肽的純化與鑒定

2.5.1 GFC測定結果

選擇α-淀粉酶抑制活性最強的綠豆蛋白肽進行進一步純化，結果如圖3A所示，經過純化，綠豆蛋白肽被分為3 個組分（F1、F2、F3）。在相同質量濃度下（0.18 mg/mL），3 個組分對α-淀粉酶活性的抑制率均顯著高于水解液（P＜0.05）（圖3B）。其中抑制率最高的組分是F3，為16.80%，顯著高于其他組分（P＜0.05）。測定3 個組分中肽的分子質量，結果如圖3C～E所示，分子質量范圍為F1（3～7 kDa）＞F2（1～3 kDa）＞F3（小于1 kDa）。這一結果與Vilcacundo等[24]的結果一致，即分子質量是影響肽生理活性，包括α-淀粉酶抑制活性的重要因素之一，小分子質量的肽更易抑制α-淀粉酶活性。因此，選擇F3組分進一步純化。

圖3 綠豆蛋白水解物的GFC圖及3 個組分的α-淀粉酶抑制活性和分子質量分布Fig.3 GFC chromatogram of mung bean protein hydrolysate and α-amylase inhibitory activity and molecular mass distribution of its three fractions

2.5.2 RP-HPLC測定結果

采用Waters Xbridge Prep C18柱F3組分進一步純化，根據時間收集得到如圖4A所示的3 個組分（F3-1、F3-2、F3-3），測定對α-淀粉酶活性的抑制效果。結果如圖4B所示，相同質量濃度下（0.18 mg/mL），3 個組分對α-淀粉酶活性的抑制效果具有顯著差異（P＜0.05）。F3-1不僅不能抑制α-淀粉酶活性，反而促進了α-淀粉酶對淀粉的水解，推測原因可能有兩點，一方面是先出峰的物質疏水性差，分子質量大，難以與α-淀粉酶的活性中心結合，從而無法對其產生抑制作用；另一方面是先出峰的物質極性強，表面電荷分布不均勻，其中與α-淀粉酶帶同種電荷的肽段與酶形成一定距離時可能對其產生了微弱的斥力，使其能更好地發揮催化活性，從而促進了酶對淀粉的消化[31-32]。而F3-2和F3-3組分均對α-淀粉酶活性產生了抑制作用，抑制率分別為11.40%和23.37%。其中F3-3組分對α-淀粉酶活性的抑制作用最強。這表明疏水性是影響肽對α-淀粉酶抑制效果的重要因素之一，疏水性越強，肽對α-淀粉酶的抑制率可能也就越強。因此，選擇F3-3組分鑒定肽序列。

圖4 F3組分RP-HPLC的純化及它們的α-淀粉酶抑制活性Fig.4 RP-HPLC chromatogram of fraction F3 and α-amylaseinhibitory activity of its three subfractions

2.5.3 Nano LC-MS/MS測定結果

通過GFC和RP-HPLC將綠豆蛋白水解物分離純化，得到了對α-淀粉酶活性有最高抑制作用的F3-3組分，通過Nano HPLC-MS/MS對其肽序列進行鑒定。經過置信度（＞50%）、生物活性評分（＞0.8）、疏水性數值（＞0.5）后及BIOPEP數據庫查重后，得到32 條肽序列，其中17 條為本研究首次發現。如表3所示，F3-3中檢測得到的肽序列的分子質量基本分布在0.3～1.0 kDa。劉歡[33]分離純化得到的茶籽粕α-淀粉酶抑制肽的分子質量范圍同樣主要分布在0.3～1 kDa。這一結果表明肽的分子質量與肽的生物活性密切相關，小分子肽能夠與α-淀粉酶活性中心殘基形成穩定的氫鍵結合，抑制活性更好。同時，疏水性也在肽對α-淀粉酶活性的抑制中發揮了重要作用，相關研究表明，含有更多疏水氨基酸，如苯丙氨酸（F）[34]、亮氨酸（L）[35]殘基的肽序列，具有抑制α-淀粉酶活性的潛能，F3-3組分的強抑制活性可能與此相關。此外，Ngoh等[34]對豆類中的α-淀粉酶抑制肽的研究結果表明，存在特定二肽（PP、LL、YY）組合的α-淀粉酶抑制劑具有更高的潛力，與本研究中的肽序列（ILLLLCCF、LLLLLLILFLPMLL、LLAF、ILLLIFPF）一致。

表3 F3-3組分中α-淀粉酶抑制肽的序列Table 3 Sequence analysis of α-amylase inhibitory peptides in subfraction F3-3

生物活性肽的另一個重要特性是氨基酸殘基在肽序列中的位置。相關研究表明，C/N末端存在亮氨酸（L）[36]或苯丙氨酸（F）[24,34]殘基的肽序列具有更高的α-淀粉酶活性抑制潛力，這可能與肽和α-淀粉酶殘基之間的芳香族-芳香族殘基相互作用形成的氫鍵、靜電力和范德華力與肽對α-淀粉酶活性的抑制作用密切相關[37]，本研究中的肽序列（LILLLLF、LIF、LAFL等）也符合這一規律。因此，結合過往諸多研究，本研究所發現的綠豆蛋白肽具有良好的α-淀粉酶活性抑制效果，有助于為綠豆蛋白在防治糖尿病方面提供新的依據。

3 結論

在本研究中，通過胃-胰蛋白酶水解綠豆蛋白及其分級蛋白（清蛋白、球蛋白、谷蛋白），發現綠豆蛋白肽對α-淀粉酶活性抑制率最高（16.51%）。這可能與綠豆蛋白的水解度和疏水氨基酸含量較高有關，進一步對綠豆蛋白肽進行分離純化與肽序列鑒定，發現了32 條具有α-淀粉酶活性抑制潛力的肽，其中17 條是首次發現，這為綠豆的降血糖活性提供了科學依據。