基于超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法的黑蒜加工過程中特征成分變化規律

吳 鵬，劉平香，王玉濤，高 瑞，江育熒，畢京秀，王正榮,3,

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056107；2.山東省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，山東省食品質量安全檢測技術重點實驗室，山東 濟南 250100；3.邯鄲市天然產物與功能食品開發重點實驗室，河北 邯鄲 056107）

黑蒜是用新鮮大蒜帶皮放在高溫高濕環境自然老化一段時間制成的產品?，F代黑蒜加工技術最早始于21世紀初的日本青森縣[1]，2004年韓國Scott Kim進一步改良了黑蒜加工工藝，使其成為風靡產品[2-3]。黑蒜在加工過程中，自身組織被破壞，內含物發生了一系列的酶促反應和非酶褐變反應，包括美拉德反應、焦糖化反應等[4]。黑蒜質地軟糯，辛辣味和臭味基本消失，帶有甜味、口感好，可直接食用，應用前景廣闊[5]。同時，黑蒜具有更豐富的營養成分和更強的生理活性。研究表明，相較于鮮蒜，黑蒜中多酚類物質含量高出5 倍以上[6]，超氧化物歧化酶活性高出10 倍以上[7]，糖、總酸和對身體有益的Mn、Cu、Zn、Se元素含量升高，有害Pb元素含量下降[8]。此外，黑蒜的抗氧化能力、羥自由基清除率分別是大蒜的10 倍和3 倍[9]。含硫化合物是大蒜中最重要的一類功能性成分，主要包括蒜氨酸等風味前體物質以及大蒜細胞破碎后蒜氨酸與蒜氨酸酶反應生成的大蒜素等硫代亞磺酸酯類物質。黑蒜加工過程中，含硫化合物在酶和高溫高濕作用下發生了一系列的轉化，使其功效進一步增強，如大蒜中的S-烯丙基半胱氨酸和蒜氨酸等含硫氨基酸在加熱后生成的阿霍烯具有抗癌、預防糖尿病、降低膽固醇等作用，大蒜素與VB1生成的蒜硫胺素具有抗疲勞、強肝護精的作用，且更易被腸道吸收[10]。因此，黑蒜的研發備受世界各地的關注與青睞。

目前，對于黑蒜品質形成機理的研究還處于初級階段，尤其是針對黑蒜加工過程中營養成分轉化的研究主要集中在糖類、總酚、揮發性成分等方面，而針對大蒜中重要的含硫化合物等特征性成分變化規律的研究鮮見報道。Bae等[11]基于高效液相色譜-紫外檢測器（high performance liquid chromatography-ultraviolet detector，HPLC-UV）建立了黑蒜中S-烯丙基-L-半胱氨酸（S-allyl-L-cysteine，SAC）的測定方法。史潤東東[12]利用HPLCUV建立了同時定量蒜氨酸和SAC的方法，并應用于黑蒜產品的分析。Arnault等[13]通過應用HPLC-UV將庚烷磺酸作為離子對試劑，最終實現了SAC、蒜氨酸等3 種成分的同時定量。許珂珂等[14]基于HPLC-二極管陣列檢測器實現了對蒜氨酸的快速檢測。盧連登等[15]通過建立HPLC的方法實現了黑蒜中蒜氨酸、脫氧蒜氨酸及γ-谷氨酰半胱氨酸的同時測定。但以上報道對于黑蒜中成分變化規律的研究較少，且大部分報道只針對一種或幾種成分進行研究，缺乏多個因素綜合考慮的相關研究。

目前，對黑蒜中風味前體物質傳統的檢測方法主要為HPLC-UV法，該方法操作簡單、儀器設備成本相對較低，但蒜氨酸等風味前體物質極性較大，使其很難達到所需的分離效果，導致基質干擾嚴重，且該類化合物紫外吸收能力相對較弱，很難實現多種化合物的同時分析。超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜（ultrahigh performance liquid chromatography-triple quadrupoletandem mass spectrometry，UPLC-QQQ-MS/MS）的多重反應監測（multi-reaction monitoring，MRM）模式能極大地避免基質對目標物的干擾，不需進行衍生化等繁瑣的前處理過程[16]，分析時間短、溶劑消耗小，且具備更高的分離能力和高靈敏度[17]，是化學成分定量分析的強大工具，適合于多種成分及低含量成分的準確定量分析[18]。目前，該技術已成功應用于柑橘、豆類、葡萄酒、茶葉樣本中特征成分的分析[19-22]。然而，目前基于該技術對黑蒜品質變化規律的研究鮮見報道。

因此，本研究旨在建立一種能夠同時準確測定黑蒜中31 種特征成分的UPLC-QQQ-MS/MS定量分析方法，在此基礎上對不同發酵階段黑蒜中的特征性成分含量水平進行分析，并進一步對其轉化規律進行探究。該研究一方面可為后期黑蒜功能性成分的挖掘和開發奠定堅實基礎；另一方面，可進一步豐富黑蒜生物化學理論，對提升黑蒜品質、增加附加值、促進我國大蒜產業經濟發展具有極大幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑蒜為本實驗室自加工樣品，原料為金鄉紫皮蒜，在溫度75 ℃、相對濕度85%條件下發酵8 d，每天取樣一次，每個樣品3 個重復。取樣剝皮冷卻至室溫后于液氮中速凍，隨后置于冷凍干燥機中冷凍干燥72 h，采用冷凍研磨儀粉碎后置于-80 ℃冰箱中保存待測。

甲酸（質譜級）賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙腈（質譜級）天津市康科德科技有限公司；甲醇（色譜級）默克股份兩合公司；本工作共采用的32 個化學標準品由上海吉至生化科技有限公司、美國USP、阿爾塔科技有限公司、日本Nacalai和北京思源勇拓科技有限公司提供；實驗用水采用Milli-Q純化系統純化（18.2 MΩ）。

1.2 儀器與設備

1290 Infinity II液相色譜-G6465B Ultivo三重四極桿質譜儀 美國安捷倫科技公司；GT200振動球磨儀北京格璃德曼儀器設備有限公司；高低溫（交變）濕熱實驗箱 上海藍豹試驗設備有限公司；3K15高速冷凍離心機 曦瑪離心機（揚州）有限公司；FA/JA系列電子天平 上海上平儀器有限公司；TU-1810PC紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；FreeZone臺式冷凍干燥機 美國Labconco公司；KQ-250超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋 天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠；SCDEALL VX-III多管渦旋振蕩儀 北京踏錦科技有限公司；100～1000 μL手動移液槍 德國艾本德股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合標準溶液的制備

根據化合物極性等性質的不同，分別采用不同比例的甲醇和水混合溶液對標準品進行溶解和配制。準確稱取一定量的標準品（準確到0.01 mg）于10 mL容量瓶中，將其溶解并稀釋至刻度，配制成標準儲備溶液，于-20 ℃條件下保存；吸取適當體積的各標準品儲備液，用甲醇-水（50∶50，V/V）稀釋，配制成質量濃度為10 mg/L的混合標準中間溶液，于-20 ℃冰箱貯藏備用；用0.1%甲酸溶液稀釋混合標準中間溶液，配制成質量濃度為1～1000 μg/L的混合標準工作溶液，現用現配[23]。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取200 mg黑蒜粉于50 mL離心管中，加入20 mL的0.1%（體積分數，下同）甲酸溶液，渦旋2 min后于常溫條件下超聲10 min。將混合溶液于8000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜于進樣小瓶中，分別將提取液稀釋20、400 倍，保存于4 ℃冰箱。根據需求選擇合適的稀釋濃度進樣用于分析。

1.3.3 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱：Waters Xbridge C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：0.1%甲酸溶液（A相）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B相）；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫：0～2 min，98%～2% A、2%～98% B；2～14 min，2% A、98% B；14～15 min，2%～98% A、98%～2% B；15～15.1 min，98% A、2% B；15.1～18 min，98% A、2% B；進樣量：5 μL。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源；檢測方式：MRM；離子源溫度：300 ℃；錐孔氣流量：8 L/min；霧化氣壓力：30 psi；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流量：1 L/min。

1.3.4 方法學考察

分別對方法的線性、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）、準確度和精密度等進行考察。以目標物實際質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，通過回歸擬合獲得各成分的標準曲線。標準曲線的繪制至少設置7 個系列質量濃度；LOD和LOQ分別為3 倍和10 倍的信噪比；方法的準確度用回收率評價[24]。設置低、中、高3 個添加水平，分別約為黑蒜中化合物原始含量的50%、100%、200%。同時，采用外源性物質L-色氨酸-D5（tryptophan-D5，Trp-D5）對回收率進行進一步的驗證。由于本研究中很難找到含硫化合物和氨基酸的基質空白樣品，因此，采用斜率法對基質效應進行評估，斜率計算公式為：斜率＝基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率。斜率為0.8～1.2時，說明基質效應較弱，可采用溶劑標樣定量；當斜率低于0.8或高于1.2時，則說明存在基質抑制或基質增強效應，應采用基質標定量[24-25]。

1.4 數據處理

質譜采集原始數據經MRM離子對提取、峰面積計算和標準曲線擬合等步驟后，最終獲得各目標物的質量濃度。根據稀釋倍數、提取溶液體積和樣品質量，將質量濃度轉化為黑蒜中目標物的含量，以干質量計算（mg/kg）。

主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）等多元數據統計分析采用SIMCA-P 14.1軟件（瑞典Umetrics公司）進行分析，聚類熱圖通過Mev軟件進行制作；采用Origin 96進行折線圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 分析方法建立

在前期課題組建立的大蒜中28 種特征成分方法的基礎上[26]，對方法的液相色譜及質譜條件進行了進一步優化，其中31 種化合物和Trp-D5的監測離子對信息、碎裂電壓和碰撞電壓等質譜參數如表1所示。其中，環蒜氨酸、蒜氨酸和異蒜氨酸為同分異構體，三者相對分子質量均為177.221，分子式均為C6H11NO3S。因此，本研究同時進行色譜條件優化，對梯度洗脫程序進行調整，使同分異構體能夠實現基線分離，儀器測定按照1.3.3節條件進行。在優化的程序下，經標樣確證，環蒜氨酸、蒜氨酸和異蒜氨酸的出峰時間分別為3.912、4.750 min和5.288 min。通過優化其MRM離子對發現，m/z178.1→88.2（圖1A）和m/z178.1→42.1（圖1C）為3 個化合物的共性離子對。從圖1B可以看出，m/z178.1→74.1僅在4.75 min處有較強的信號，因此可以作為蒜氨酸的特異離子對，用作蒜氨酸的定量離子對；同樣的，m/z178.1→91.1（圖1D）僅在3.912 min處有較強信號，可用作環蒜氨酸的定量離子對。

表1 31 種黑蒜特征成分和Trp-D5的名稱、保留時間、MRM離子對及質譜檢測參數Table 1 Retention times,MRM ion pairs and mass spectrometric parameters of 31 characteristic components in black garlic and Trp-D5

2.2 方法學考察結果

31 種化合物的標準曲線、LOD和LOQ如表2所示，回收率和基質效應如表3所示。結果表明，31 種化合物在各自的線性范圍內均呈現出良好的線性關系（R2＞0.9943）。除GABA（LOD和LOQ分別為2000 μg/kg和4000 μg/kg）外，其他化合物的LOD和LOQ均不高于500 μg/kg和1000 μg/kg，可滿足檢測需求。樣品基質在3 個加標水平下的回收率在60.55%～136.23%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）低于20%。因缺少這31 種化合物的黑蒜空白基質樣品，可能會導致在回收率評價過程中會存在一定的偏差，因此，本研究進一步采用Trp的同位素（Trp-D5）對方法的準確度進行驗證，從表3可以看出，Trp-D5在低、中、高三個添加水平下，回收率在90%～102%之間，進一步驗證了方法的準確性。此外，如表3所示，31 種化合物的基質效應在0.8～1.2之間，基質效應相對較小，可采用溶劑標樣進行定量。該法綠色環保、簡便快速、準確可靠，因此，本實驗建立的UPLC-QQQ-MS/MS定量分析方法具有良好的準確性和精密度，可用于黑蒜中31 種特征成分的檢測。

表2 31 種特征成分和Trp-D5的標準曲線、LOD和LOQTable 2 Standard curves,limit of detection and limit of quantification of 31 characteristic components and Trp-D5

表3 31 種特征成分和Trp-D5在低、中、高3 個加標水平下的回收率、相對標準偏差和基質效應Table 3 Recoveries,relative standard deviations and matrix effect of 31 characteristic components and Trp-D5 at three spiked concentration levels

2.3 黑蒜加工過程中特征成分變化規律

首先，采用多元數據統計分析方法對未發酵大蒜與發酵不同天數黑蒜進行PCA，結果如圖2A所示。不同加工階段的黑蒜整體可以根據31 種特征成分的含量水平分為3 組，即0、1～3 d和4～8 d，尤其是0 d（鮮蒜）大蒜樣品與其他樣品差異較大，說明黑蒜在加工初期內含物就發生了劇烈的改變。究其原因，可能是鮮蒜受熱的過程中加快了各種生物酶的反應，隨后鮮蒜在高溫條件下細胞由于熱脹而破裂，導致大蒜中的酶與底物接觸，發生蒜氨酸酶解等酶促反應。研究表明，蒜氨酸的最適溫度為30 ℃，溫度達到65 ℃時，酶活性基本喪失[27]。而本研究中黑蒜的加工溫度為75 ℃，因此，蒜氨酸酶會很快失活。除酶促反應外，在高溫條件下，美拉德反應以及熱分解等反應也會使大蒜中的成分發生顯著改變。因此，在黑蒜加工初期階段內含成分變化最為劇烈，后期反應強度逐漸下降。

圖2 不同發酵階段黑蒜樣品PCA得分圖（A）和31 種化合物熱圖（B）Fig.2 PCA score plot of black garlic samples (A) and heatmap of 31 compounds (B) during different fermentation stages

為了直觀地展現黑蒜中內含成分的變化規律，將不同發酵階段的黑蒜中的31 種特征成分進行熱圖的繪制，結果如圖2B所示。隨著發酵時間的延長，31 種化合物的含量均發生了一定的變化。其中，Ala、SMC、環蒜氨酸、GABA、SAC和SPC的含量在發酵過程中先升高后下降，但最終含量均高于初始含量；Gly、Phe和Thr的含量在發酵過程中發生一系列變化后，最終含量略低于初始值；Asp在發酵過程中先下降后升高，最終含量與初始含量接近；Cys在發酵過程中其含量呈現“降-升-降”的趨勢，最終其含量水平低于未發酵樣品；其他化合物含量在黑蒜發酵過程中均有所下降。此結果表明黑蒜加工過程中大蒜中的特征性含硫化合物和氨基酸均發生了劇烈的變化，是黑蒜加工過程中品質變化的重要指示性指標。在含量升高的幾種化合物中，除Ala外均為含硫化合物。21 種游離氨基酸除Ala外含量都有所下降，推測其原因可能是黑蒜加工過程中，蛋白質的酶水解會增加氨基酸的含量，而美拉德反應則會消耗掉大量的氨基酸，氨基酸參與美拉德反應從而生成類黑精等呈香、呈色的營養物質，這可能是黑蒜加工中大多數氨基酸含量降低的主要原因。Ala是一種甜味氨基酸，其在黑蒜加工過程中升高，可能會進一步增加大蒜的甜味，其轉化機理有待進一步研究。

為進一步研究黑蒜加工過程中特征成分的變化規律，根據PCA初步分析結果，分別對未發酵大蒜與發酵1～3 d黑蒜、發酵1～3 d黑蒜與發酵4～8 d黑蒜進行OPLS-DA分析，得分圖如圖3A所示。采用R2和Q2對OPLS-DA模型的擬合能力和預測能力進行評估，結果顯示，在所有預測模型中R2≥0.819，Q2≥0.788，表明模型的模擬能力和預測能力較好。同時，對模型進行了N＝200的置換檢驗，結果表明此次OPLS-DA模型沒有出現過擬合現象。從圖3A可以看出，未發酵大蒜與發酵1～3 d黑蒜、發酵1～3 d黑蒜與發酵4～8 d黑蒜之間均存在顯著差異。為了更進一步分析黑蒜加工過程中特征成分的變化規律，采用P＜0.05、變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）＞1.5為標準對黑蒜加工過程中的差異性成分進行了篩選，VIP值如圖3B所示。最終，篩選出GABA、SAC、異蒜氨酸、Gln、甲基蒜氨酸、蒜氨酸、Trp和GSAC共8 種差異性成分，它們在黑蒜發酵過程中的含量變化折線圖如圖4所示。

圖3 第0天和1～3 d黑蒜樣品、1～3 d和4～8 d黑蒜樣品的OPLS-DA得分圖（A）和31 種化合物的VIP值圖（B）Fig.3 OPLS-DA score plots of black garlic samples with different fermentation periods (A) and VIP scores of 31 compounds in black garlic (B)

圖4 GABA（A）、SAC（B）、異蒜氨酸（C）、Gln（D）、甲基蒜氨酸（E）、蒜氨酸（F）、Trp（G）和GSAC（H）在黑蒜發酵過程中的變化趨勢Fig.4 Changes in contents of γ-aminobutyric acid (A),SAC (B),isoalliin (C),Gln (D),methiin (E),alliin (F),Trp (G),and γ-L-glutamyl-S-allyl-Lcysteine (H) in black garlic during fermentation

從圖4可以看出，8 種差異代謝物中，除Gln、Trp和GABA外，其余5 種化合物均為含硫化合物，說明黑蒜加工條件對含硫化合物的影響較大。其中異蒜氨酸、Gln、Trp和GSAC含量在發酵過程中逐步降低；蒜氨酸的含量在發酵第1天內有輕微的上升趨勢，隨后急劇下降；甲基蒜氨酸含量在發酵的第1天內急劇下降，在1～2 d內上升，之后持續下降；而GABA和SAC的含量在發酵過程中先增加后減少。

在黑蒜加工過程中，高溫會破壞大蒜細胞及其液泡結構，使蒜氨酸酶與S-烷(烯)基-L-半胱氨酸亞砜類化合物接觸，生成以二烯丙基硫代亞磺酸酯為主的揮發性硫化物，硫代亞磺酸酯類化合物極不穩定，在高溫條件下可短時間內轉化為其他含硫衍生物，并導致辛辣味降低[28]。因此，大蒜中的異蒜氨酸、蒜氨酸和甲基蒜氨酸均發生了明顯的下降，尤其是異蒜氨酸，在開始加工的第1天便由1834 mg/kg迅速下降并穩定在0 mg/kg。Lawsonld等[29]研究證明異蒜氨酸在一定的高溫等條件下可以轉化為環蒜氨酸，這可能是黑蒜加工過程中異蒜氨酸急劇下降的原因。此外，蒜氨酸、異蒜氨酸、甲基蒜氨酸的熱穩定性差，持續的高溫易使其發生熱降解從而含量降低[30]。值得注意的是，蒜氨酸和甲基蒜氨酸分別在加工的第1天和第2天后才開始急劇下降，這可能是大蒜細胞結構在加工一定時間后才被破壞或者在高溫條件下酶被鈍化導致，但其具體原因有待進一步研究。

GSAC在黑蒜加工過程中呈現下降趨勢，在加工的前4 d內由6600 mg/kg迅速下降至1426 mg/kg，隨后逐漸下降至616 mg/kg。Molina-Calle等[31]研究發現，黑蒜在加工過程中GSAC含量水平下降了約90%，與本研究結果較為一致。GSAC是大蒜中最主要的含硫物質之一，也是SAC的前體物質[32]，Sasaki等[33]研究發現，鮮蒜經過加工成黑蒜后，GSAC部分轉化成了SAC，可能是由于γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GTP）催化GSAC發生了水解反應；此外，GSAC還可能會發生熱分解反應[34]，但轉化機理有待進一步研究。

本研究還發現，隨發酵時間延長，SAC呈現先上升后下降的趨勢，但SAC的最終含量為541 mg/kg，大于鮮蒜中的103 mg/kg，在加工第3天時，其含量達到最高，為1917 mg/kg。目前，大部分研究發現黑蒜加工工過程中SAC含量增加[35]，也有少部分研究發現SAC含量降低[36]，其原因有待進一步研究。其中，升高的SAC可能是由于大蒜中的蒜氨酸在加熱過程中降解生成，也可能是GSAC在γ-GTP的催化下形成，該研究結果與Liu Chunfeng等[35]研究結果一致；SAC在高溫下也存在一定程度的熱降解，但由于其穩定性高于蒜氨酸，降解速率相對較慢[11]，因此，后期SAC的降低可能是由于SAC的熱降解導致。

此外，在篩選到的3 種氨基酸中，Gln和Trp在黑蒜加工過程中分別由7973 mg/kg和402 mg/kg下降至11 mg/kg和17 mg/kg。Gln和Trp減少的原因可能與美拉德反應有關，美拉德反應發生在胺（通常是氨基酸）和羰基化合物（通常是還原糖）之間[37]。黑蒜加工過程中，蛋白質的酶水解會增加氨基酸的含量，而美拉德反應則會消耗掉大量的氨基酸[38]。不同的是，Gln在黑蒜加工的第1天內迅速由7973 mg/kg下降至625 mg/kg，隨后下降速度減慢，從第3天到發酵結束，Gln的變化趨勢較為平緩。而Trp呈現逐漸下降的趨勢，其原因還有待進一步分析。GABA是一種非蛋白質氨基酸，對人體具有抗糖尿病、抗高血壓、促進睡眠等功能[39]，GABA含量在發酵后期不斷降低可能是由于后期氨基酸的破壞和參與非酶褐變反應[40]，Lamberts等[41]研究認為GABA能夠在美拉德反應中與各種糖溶液（木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖）反應產生中間色素，導致糖和氨基酸的損失。但發酵前期GABA劇烈上升的原因還有待進一步研究。

3 結論

本實驗建立了一種UPLC-QQQ-MS/MS同時測定黑蒜中31 種特征成分的分析方法。該方法靈敏度高、準確性好、綠色環保，適用于黑蒜中風味前體物質及游離氨基酸的檢測。將上述方法應用于溫度75 ℃、相對濕度85%發酵8 d的黑蒜研究中，通過分析黑蒜加工過程中31 種特征成分的變化規律發現，發現黑蒜的品質在加工過程中發生了明顯變化，大部分化合物的含量下降，如蒜氨酸等S-烷(烯)基-L-半胱氨酸亞砜類化合物，但該類化合物的降低并不代表黑蒜功能活性的減弱，在黑蒜加工過程中風味前體物質會轉化為二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物和阿霍烯等生理活性更強的物質。同樣地，氨基酸在黑蒜加工過程中會與糖類化合物反應生成Heyns化合物等美拉德反應中間產物[42]。本研究不僅掌握了黑蒜加工過程中31 種特征成分的變化規律，還發現了一些目前鮮見報道并值得進一步研究的問題，如黑蒜加工過程中Gln和Trp均發生下降，但下降模式存在極大差異，又如Ala在黑蒜加工過程中發生上升的原因尚不明確，其具體的轉化機理還有待進一步研究。綜上所述，該研究不僅為黑蒜品質的分析及研究提供了方法基礎，并在解析關鍵特征成分變化規律的基礎上為后期黑蒜品質的調控和功能性成分的挖掘和開發奠定了堅實基礎。