基于SBSE-GC-O-MS技術的3 個代表性烏龍茶品種關鍵香氣成分分析

黃慧清，鄭玉成，胡清財，吳晴陽，楊 云，歐曉西，趙夢瑩，孫 云

（福建農林大學園藝學院，茶學福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002）

烏龍茶因其獨特的花果香氣，深受消費者青睞[1]。閩南烏龍茶是烏龍茶的重要類型，主要包括鐵觀音、黃旦、金觀音、佛手等幾大品種[2]。最具代表性的黃旦與鐵觀音以香高而聞名[3]，作為烏龍茶類茶樹育種的核心種質，雜交產生了許多早生優質品種，包括金觀音、黃觀音、金牡丹、瑞香等[4]。其中金觀音不僅繼承了親本黃旦與鐵觀音的優良品質特點，同時也形成了獨特的風味特征，成為福建省推廣面積最大的烏龍茶新品種[5]。

香氣作為評定烏龍茶品質的重要因子，由關鍵香氣成分決定[6]。攪拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）技術是一種采用浸沒方式與樣品直接接觸吸附揮發性成分的萃取技術[7]，由于SBSE攪拌棒上涂層吸附量是固相微萃取的50～250 倍，因此，其富集倍數較固相微萃取高。此外，相較于溶劑輔助風味蒸發法的低回收率、同時蒸餾萃取的化合物降解、超臨界二氧化碳萃取的高應用成本、減壓蒸餾萃取法的低回收率及高試樣量，SBSE方法還具有靈敏度較高、檢測限低、重現性好等技術優勢，且不使用有機溶劑，有利于環境保護[8]。目前氣味研究多使用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術，但GC-MS僅能測定食品香氣成分的組成和含量，無法確定產生香氣的關鍵化合物，而氣相色譜-嗅覺（gas chromatography-olfactometry，GC-O）測定技術對鑒別特征香氣化合物及其香氣強度和作用大小均非常有效[9]。GC-O技術在精密儀器分析的基礎下融入了人類敏銳的感官評價，與GC-MS技術相結合能更精準、更系統地確定揮發性成分對食品整體風味的貢獻，已應用于食品、煙草、香精香料以及環境監測等多個領域，近年來，也逐漸應用于茶葉香氣物質的檢測[10-12]。

Wang Mengqi等[13]采用SBSE-GC-O-MS技術、香氣活性值（odor activity value，OAV）法及初步香氣重組實驗對龍井茶的關鍵特征香氣進行探究，鑒定出14 種關鍵香氣成分，包括2-甲基丁醛、庚醛、苯甲醛、1-辛烯-3-醇等揮發性成分。Huang Wenjing等[14]采用GC-MS聯用技術、感官組學技術分析了祁門紅茶自然萎凋、日光萎凋和熱風萎凋的香氣成分。結果顯示，共有11 種香氣活性化合物OAV＞1（香葉醇、(Z)-4-庚烯醛、1-辛烯-3-醇、(E)-β-紫羅蘭酮等物質），芳樟醇和香葉醇在使用日光萎凋時產生較高的花香和果香，而3-甲硫基丙醛在使用暖風萎凋時產生強烈的烤香。Wang Bei等[15]采用溶劑輔助風味蒸發法提取普洱熟茶中的揮發性成分，并采用GC-MS和GC-O進行分析，鑒定了普洱熟茶的58 種主要揮發性成分和24 種香氣活性物質，甲氧基苯基化合物對普洱熟茶的獨特風味起著至關重要的作用。Ershad等[16]通過比較同時蒸餾萃取和固相微萃取在GC-MS和GC-O分離金萱烏龍茶風味物質的效果。結果顯示：使用GC-MS鑒定的揮發物的數量在固相微萃取中低于同時蒸餾萃取。固相微萃取共鑒定出59 種揮發物和41 種香氣活性化合物。2 種方法分離的揮發物組成差異較大，但提供了互補信息。Wang Jiatong等[17]采用SBSE-GC-O-MS技術對‘柑橘白茶’和‘福鼎大白’的特征香氣進行測定，共鑒定出99 種關鍵香氣物質，其中有22 種化合物的OAV大于1，被認為是關鍵香氣的重要貢獻者，其中檸檬烯和反式β-紫羅蘭酮尤為突出。目前，利用GC-O-MS技術探究茶葉香氣特征的研究愈來愈多，但將GC-O-MS技術應用于不同代表性烏龍茶品種關鍵特征香氣的研究仍然較少。

本研究通過SBSE-GC-O-MS技術對黃旦、鐵觀音、金觀音3 個品種烏龍茶關鍵香氣成分及特征進行測定，并采用OAV、香氣特征影響（aroma character impact，ACI）值，以及感官審評進行對比分析，旨在鑒定和比較黃旦、鐵觀音、金觀音3 個代表性品種烏龍茶的香氣特征，為烏龍茶品種選育、穩定茶葉品質提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃旦、鐵觀音、金觀音3 個烏龍茶樣品取自福建農林大學安溪茶學院，選取無病蟲害、大小均勻的春季鮮葉原料，以開面三四葉為采摘標準，通過圖1所示的閩南烏龍茶加工工藝加工成烏龍茶，每個季節樣品設置3 個重復樣。

圖1 3 個品種烏龍茶加工工藝Fig.1 Flow chart for the processing of three varieties of oolong tea

C6～C33正構烷烴（色譜純）美國Supelco公司；2-壬醇 美國Sigma公司；氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A/5975C GC-MS聯用儀 美國安捷倫科技公司；MPS Robotic Pro多功能自動進樣系統、CIS4大體積冷阱進樣口和TDU2熱脫附、ODP4嗅聞儀、吸附攪拌子（聚二甲基硅氧烷，0.10 mm×10 mm）德國Gerstel公司。

1.3 方法

1.3.1 感官審評方法

依據GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[18]，由5 名接受過專業培訓并在茶學相關領域學習或工作兩年以上的感官審評員對3 個代表性品種烏龍茶樣品的品質進行審評，記錄評分和評語，最終得分為5 位審評員評分的平均分。

1.3.2 SBSE方法

參照Wu Qingyang等[19]的方法。分別取1.0 g烏龍茶，加入50 mL 100 ℃沸水沖泡。冷卻至室溫后，取15.0 mL茶湯于20 mL頂空瓶，加入4.5 g氯化鈉、40 μL 24 μg/mL 2-壬醇溶液（內標），放入磁力吸附攪拌子以1200 r/min的轉速在25 ℃萃取60 min。完成萃取后取出磁力吸附攪拌子，用超純水沖洗干凈，并用干凈的無塵紙巾擦拭干凈，放入TDU2熱脫附的小管，運行序列，進行熱脫附。

1.3.3 GC-O-MS條件

GC-O 條件：色譜柱：安捷倫HP-Innowax（60 m×0.25 mm，0.25 μm）惰性毛細管柱；升溫程序：40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持20 min；載氣（He，純度99.999%以上）流速1.8mL/min；進樣口類型：大體積冷進樣口，溫度-30～250 ℃，15 ℃/s；不分流。熱脫附溫度：25～250 ℃，100 ℃/min，不分流，傳輸線溫度：260 ℃；進樣分流比為1∶1；載氣為高純度氮氣。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃。掃描范圍m/z33～400。電磁容量1258 V。

嗅聞分析小組由5 位受過專業訓練的成員組成。氣味強度以“1～4”表示，“1”表示弱，“2”表示適中，“3”表示較強，“4”表示強，最終結果由至少2 位小組成員在同一時間階段嗅聞到相似的氣味感官描述及強度決定。

1.3.4 OAV及ACI的計算

OAV及ACI分別根據公式（1）及（2）計算：

式中：Cx為揮發性成分x的質量濃度/（μg/L）；OTx為揮發性成分x在水中的香氣閾值/（μg/L）[20]；Ox為揮發性成分x的OAV；∑nOn為所有關鍵揮發性成分的OAV之和。

1.4 數據分析

定性分析：采用NIST20譜庫進行檢索比對，結合保留指數（retention index，RI）進行定性，篩選匹配度大于80的化合物，同時將C6～C33正構烷烴混合物單獨進樣，升溫程序和GC-MS檢測條件一致，計算各揮發物的RI，并與文獻中的RI值進行比對。

定量分析：以2-壬醇為內標，根據內標物的濃度、樣品中各組分的峰面積與內標峰面積的比值，計算樣品中各組分含量。

單因素分析和顯著性分析利用 SPSS 26.0軟件；計算和圖表制作通過Excel、Graphpad Prism 7.0 軟件進行；并利用SIMCA 14.1軟件進行偏最小二乘判別分析。

2 結果與分析

2.1 3 個代表性品種烏龍茶感官審評分析

根據本研究目的對3 個代表性品種烏龍茶黃旦、鐵觀音、金觀音進行感官審評，最終審評結果如表1所示。黃旦烏龍茶綜合得分為93.17 分、鐵觀音為93.09 分、金觀音為91.50 分。3 個品種烏龍茶均表現出優質烏龍茶的特點，并各具特色，黃旦烏龍茶花香顯，略帶奶香，滋味清醇鮮爽；鐵觀音滋味醇厚鮮爽，花香濃郁；金觀音具甜果香，略帶木質香，滋味鮮醇回甘。

表1 3 個品種烏龍茶感官審評結果Table 1 Criteria for sensory evaluation of three varieties of oolong tea

2.2 3 個代表性品種烏龍茶主要揮發性成分分析

通過SBSE-GC-MS對每個茶樣中的揮發性成分進行提取和分析，從3 個品種烏龍茶中共鑒別出124 種已知化合物。通過偏最小二乘判別分析對不同品種茶樣進行兩兩判別分析，以變量重要性投影值大于1以及P＜0.05為篩選條件[21]，共篩選出57 種主要特征揮發性成分如表2所示。

表2 3 個品種烏龍茶主要特征揮發性成分Table 2 Major characteristic volatile components of three varieties of oolong tea

黃旦、鐵觀音、金觀音3 個品種烏龍茶揮發性成分基本一致，包括醇類13 種、醛類8 種、酮類15 種、酯類13 種、含氮化合物6 種、酚類2 種。結合圖2可知，酯類化合物的相對含量在3 個品種中占據首位，達到42.53%～46.55%，黃旦、鐵觀音顯著高于金觀音；其次是含氮化合物，黃旦的相對含量最高，達到37.00%，顯著高于鐵觀音（32.82%）與金觀音（33.06%）；而鐵觀音與金觀音的酮類物質相對含量為12.17%、13.30%，明顯高于黃旦（7.42%）；黃旦與金觀音的醇類化合物相對含量為7.86%、7.54%，顯著高于鐵觀音（6.56%）；3 個品種醛類物質相對含量無顯著差異，分別為1.41%、1.40%、1.41%；黃旦與鐵觀音的酚類物質相對含量分別為0.20%、0.51%，顯著低于金觀音（2.16%）。

圖2 3 個品種烏龍茶揮發性成分類型及含量Fig.2 Types and contents of major characteristic volatile components in three varieties of oolong tea

3 個品種烏龍茶中，芳樟醇、脫氫芳樟醇、香葉醇、苯乙醇、2-壬酮、順式茉莉酮、(5Z)-3,4-二甲基-5-戊亞基-2(5H)-呋喃酮、δ-癸內酯、茉莉內酯、茉莉酸甲酯、二氫獼猴桃內酯、苯乙腈、吲哚相對含量及質量濃度較高。其中黃旦烏龍茶的2-壬酮、(5Z)-3,4-二甲基-5-戊亞基-2(5H)-呋喃酮、茉莉酸甲酯、苯乙腈、吲哚的相對含量高于鐵觀音及金觀音，這些物質帶有花果香、甜香、奶香等香氣；鐵觀音烏龍茶中的芳樟醇、脫氫芳樟醇、順式茉莉酮、茉莉內酯相對含量高于黃旦與金觀音，這些均屬花果香型化合物；金觀音烏龍茶中的香葉醇、δ-癸內酯、二氫獼猴桃內酯的相對含量較其他兩個品種烏龍茶相對含量高，這些物質呈現出花香、果香、木質香的香型特點。

2.3 3 個代表性品種烏龍茶香氣成分OAV對比分析

OAV是結合香氣成分的含量和氣味閾值，對各香氣成分在樣品的香氣貢獻進行綜合評價的方法，而其香氣貢獻程度可通過ACI值比較[22]。通常認為OAV＞1的香氣成分對茶葉香氣形成有貢獻，OAV＞10，則對茶葉香氣形成有顯著影響[23-24]。查閱相關文獻中香氣成分在水中的閾值計算出各香氣成分的OAV，并記錄所描述香氣成分的香氣特征。3 個品種共鑒定出14 種OAV＞1的香氣成分，結果如表3所示，黃旦、鐵觀音、金觀音烏龍茶中OAV＞1的香氣成分分別有14、11、12 種。

表3 3 個品種烏龍茶關鍵香氣成分OAV ＞1的化合物及其ACI值Table 3 ACI values and odor characteristics of key aroma components with OAV ＞ 1 in three varieties of oolong tea

在黃旦烏龍茶中茉莉酸甲酯（OAV＝100.86，ACI＝33.38%）對黃旦整體香氣貢獻最大，其次為芳樟醇（OAV＝72.52，ACI＝24.00%）、植醇（OAV＝33.19，ACI＝10.99%）、吲哚（OAV＝33.12，ACI＝10.96%），這些物質均具有花香特征，而3,5-辛二烯-2-酮（OAV＝20.86）、順式茉莉酮（OAV＝12.08）、香葉醇（OAV＝12.00）是黃旦具有奶香特性的主要來源。在鐵觀音烏龍茶中，芳樟醇（OAV＝117.77，ACI＝51.33%）、3,5-辛二烯-2-酮（OAV＝23.22，ACI＝10.12%）、順式茉莉酮（OAV＝28.51，ACI＝12.42%）、茉莉酸甲酯（OAV＝12.88，ACI＝5.61%）及吲哚（OAV＝21.11，ACI＝9.20%）對鐵觀音整體香氣貢獻最大，這些物質具花香、果香。金觀音烏龍茶中芳樟醇、植醇、順式茉莉酮、茉莉酸甲酯、吲哚的OAV分別為95.18、26.62、21.24、27.02、36.73，是金觀音呈香的主要貢獻者。

3 個品種烏龍茶有較多共有的關鍵香氣化合物，如芳樟醇、香葉醇、藏花醛、3,5-辛二烯-2-酮、順式茉莉酮、茉莉酸甲酯、吲哚等，但由于各關鍵香氣成分的OAV及ACI值不同，使得黃旦、鐵觀音、金觀音的香氣表現出不同的特征。黃旦中的茉莉酸甲酯、香葉醇、植醇、反式-橙花叔醇的OAV較鐵觀音與金觀音高，使黃旦不僅花香顯，同時具有獨特的奶香；鐵觀音中芳樟醇、3,5-辛二烯-2-酮、順式茉莉酮具較高的OAV及ACI值，表現出花香濃郁的特征，這與苗愛清[25]、榮波[26]等的研究中鐵觀音的芳樟醇、順式茉莉酮等物質含量高于其他烏龍茶的結果一致。金觀音中藏花醛、香葉基丙酮、異丁子香酚的OAV及ACI值均高于黃旦與鐵觀音，使得金觀音有獨特的木質香及甜果香。3 個品種表現出的香氣特征與感官審評一致。

2.4 3 個代表性品種烏龍茶香氣成分GC-O-MS對比分析

茶葉中香氣成分眾多，但在感官貢獻中起到主要作用的僅占極少部分，因此，在感官中具有呈香性質的揮發性化合物被稱為關鍵香氣成分或活性香氣成分[34]。揮發性化合物含量的高低并不能說明其對香氣貢獻度的大小，關鍵香氣成分還需要結合GC-O-MS結果進一步分析[35]。通過GC-O-MS檢測分析3 個不同品種烏龍茶關鍵香氣化合物，所嗅聞到香氣成分的氣味特征及強度如圖3和表4所示。

表4 3 個品種烏龍茶GC-O-MS分析結果Table 4 Results of GC-O-MS analysis of three varieties of oolong tea

圖3 3 個品種烏龍茶嗅聞香氣旭日圖Fig.3 Sunburst charts of the aroma characteristics of three varieties of oolong tea

如圖3所示，3 個品種嗅聞到的香型分為花香、果香、甜香、青香等，香氣種類眾多。黃旦的嗅聞香型以花香、果香、甜香為主；鐵觀音以花香、果香為主；金觀音則以花香、果香、木質香較為顯著。黃旦的關鍵香氣成分以醇類、酯類、含氮化合物為主，主要包括2-壬酮、1-辛烯-3-醇、藏花醛、香葉醇、苯乙醇、苯乙腈、反式-橙花叔醇、茉莉內酯、茉莉酸甲酯、吲哚、植醇，貢獻了花香、果香及奶香。鐵觀音的關鍵香氣成分主要為醇類、酮類、酯類等，包括1-辛烯-3-醇、3,5-辛二烯-2-酮、芳樟醇、藏花醛、順式茉莉酮、茉莉內酯、吲哚，以花香、果香為主。金觀音的關鍵香氣成分以醇類、醛類、酮類為主，包括1-辛烯-3-醇、藏花醛、香葉醇、香葉基丙酮、順式茉莉酮、吲哚，嗅聞特征表現為花香、果香、甜香、木質香。

香氣強度的比較中，黃旦中2-壬酮、香葉醇、苯乙醇、苯乙腈、植醇氣味強度均為4，高于鐵觀音與金觀音。鐵觀音中芳樟醇、氧化芳樟醇、3,5-辛二烯-2-酮、脫氫芳樟醇、α-松油醇等具有花果香的化合物的氣味強度較黃旦與金觀音高。金觀音中則以香葉基丙酮、5,6-環氧-β-紫羅蘭酮、δ-癸內酯氣味強度較高。

2.5 OAV與GC-O-MS對比分析

由OAV法及GC-O-MS分析的結果可以發現，兩種方法鑒定出的不同品種烏龍茶關鍵香氣成分組成具有一致性。OAV較高的化合物，嗅聞到的氣味強度也相應較高，3 個不同品種樣品中，由OAV法與GC-O-MS分析共同鑒定出的關鍵香氣成分如芳樟醇、香葉醇、反式-橙花叔醇、β-環檸檬醛、香葉基丙酮的OAV大小與其嗅聞強度相對應。兩個方法鑒定的黃旦烏龍茶共同的關鍵香氣成分有1-辛烯-3-醇、藏花醛、香葉醇、苯乙腈、反式-橙花叔醇、茉莉酸甲酯、吲哚、植醇，鐵觀音共有的關鍵香氣成分為1-辛烯-3-醇、3,5-辛二烯-2-酮、芳樟醇、藏花醛、順式茉莉酮、吲哚，金觀音的共有關鍵香氣成分有1-辛烯-3-醇、藏花醛、香葉醇、香葉基丙酮、順式茉莉酮、吲哚。

但兩種方法鑒定出的部分化合物貢獻度也存在差異，許多OAV＜1的物質也能被嗅聞到，且氣味強度較高，如2-壬酮、苯乙醇、γ-壬內酯等。其原因可能是OAV法未考慮茶湯中揮發性成分之間、揮發性成分與非揮發性成分之間的相互作用，且單個化合物在水中的閾值并不能準確反映其在茶湯體系中的閾值[36-37]，故其他香氣類型的物質可能間接促進3 個不同品種烏龍茶香氣差異的形成。

因此，在茶葉香氣分析中將GC-O-MS及OAV法進行判斷關鍵香氣成分很有必要，更符合實際感官評價。OAV法與GC-O-MS技術在鑒定烏龍茶關鍵香氣成分上具有一致性和互補性，利用這兩種方法相結合可以更準確、更系統全面地鑒定和區別烏龍茶關鍵香氣成分及香氣特征。

3 結論

本研究以3 個不同品種烏龍茶為試驗材料，研究表明黃旦、鐵觀音、金觀音在香氣成分的類型與含量等方面均存在差異。通過OAV法與GC-O-MS共同鑒定的黃旦的關鍵香氣成分為1-辛烯-3-醇、藏花醛、香葉醇、苯乙腈、反式-橙花叔醇、茉莉酸甲酯、吲哚、植醇，其中具有較高OAV的香葉醇、植醇、茉莉酸甲酯及嗅聞氣味強度較高的2-壬酮、苯乙醇、反式-橙花叔醇、茉莉內酯等物質賦予黃旦花香顯，具獨特奶香的香氣特征；鐵觀音共有的關鍵香氣成分為1-辛烯-3-醇、3,5-辛二烯-2-酮、芳樟醇、藏花醛、順式茉莉酮、吲哚，其中區別于黃旦與金觀音香氣特征的芳樟醇、3,5-辛二烯-2-酮、氧化芳樟醇、順式茉莉酮、脫氫芳樟醇、α-松油醇等物質使鐵觀音表現出濃郁、多樣性的花香；金觀音的共有關鍵香氣成分有1-辛烯-3-醇、藏花醛、香葉醇、香葉基丙酮、順式茉莉酮、吲哚，其較高OAV的藏花醛、香葉基丙酮、異丁子香酚及氣味強度較高的順式茉莉酮、5,6-環氧-β-紫羅蘭酮、δ-癸內酯等物質，使金觀音表現出甜果香與木質香。