毛健綠茶化學成分及促消化功能分析

高健健，周正陽，宋燕華，于 帥，鹿 偉,，林 智，戴偉東,

（1.農業農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.山西中醫藥大學第三臨床學院，山西 晉中 030619；3.浙江省疾病預防控制中心，浙江 杭州 310008）

毛建草又名巖青蘭（Dracocephalum rupestreHance），是一種多年生唇形科草本植物，廣泛分布在我國山西、內蒙古、河北、遼寧及甘肅等地，主要生長在海拔650～2400 m的高山草甸[1]，資源較為豐富。作為一種傳統草本植物，巖青蘭具有多種健康益處，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤和肝保護等功能[1-4]。目前對于毛建草的化學成分了解還并不深入，僅有少數研究報道其富含黃酮和三萜類化合物[5-7]，阻礙了毛建草進一步的深入開發和研究。在晉北當地，巖青蘭可制作成茶葉進行飲用，被稱為毛健茶，其傳統加工工藝為直接將新鮮的嫩莖葉在陽光下曬干后沸水沖泡飲用，但該方法制得的毛健茶具有強烈的草藥氣味，口感欠佳。為了提高毛健茶的風味品質，目前市面上銷售的毛健茶，大多為參考茶葉綠茶加工工藝（鮮葉→攤放→殺青→揉捻→干燥）制成的毛健綠茶，相比于傳統毛健茶，其在外型、湯色和感官品質等方面均得到了較大改善，深受消費者的喜愛[8]。

功能性消化不良是由消化功能紊亂所引起胃腸道不適應的消化道疾病，具有慢性和易復發性等特點，常伴有上腹痛、食欲不振、惡心、嘔吐等癥狀[9-11]，近年來發病率呈現逐年增長趨勢。據流行病學統計，目前功能性消化不良在門診中占消化內科疾病的1/3，嚴重影響患者的身體健康和生活質量[12]。現階段用于治療的藥物如甲氧氯普胺等雖然療效好但長期服用仍然存在較多副作用[13]，因此，從天然植物中探索具有促消化功能且副作用小的食品原材料具有較高的市場前景和社會價值。

在山西民間，毛健茶素有促消化功能的說法，但關于其促消化功能的研究目前鮮有報道。因此本研究以毛健綠茶水提物為研究對象，結合保健食品功效學研究，以功能性消化不良小鼠和大鼠為模型，予以低、中、高劑量毛健綠茶水提物干預，觀察其對小鼠小腸墨汁推進率，大鼠體質量、體質量增量、攝食量、食物利用率，大鼠胃蛋白酶活性和胃蛋白排出量的影響，并結合基于超高效液相色譜-四極桿-靜電軌道阱質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive/MS）的代謝組學方法對其內含成分進行系統解析，以期評價其促消化功能并探明其內含成分，從而為毛健綠茶的推廣和新產品的開發利用提供相應的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

毛健茶樣品由山西神達朝凱蘆芽山農業開發有限公司提供，并經綠茶加工工藝制成毛健綠茶：攤放（室溫，6 h）、殺青（270 ℃、3 min）、揉捻（45 min）、干燥（110 ℃、1.5 h）[8]。上述毛健綠茶與沸水以1∶20（g/mL）的比例煮沸30 min，過濾后取上清液，繼續加入等量的沸水煮沸30 min，過濾后取上清液，合并兩次上清液，冷凍干燥獲得毛健綠茶水提物粉末，密封后置于干燥處保存備用。

實驗用昆明種雄性小鼠50 只（SPF級），3～4 周齡，初始體質量為18～22 g，由浙江維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（浙）2021-0006；實驗用SD雄性大鼠（SPF級）40 只，4～5 周齡，初始體質量120～150 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005。實驗動物均飼養于浙江省疾病預防控制中心實驗動物房，使用許可證號為SYXK（浙）2018-0018，溫度20～24 ℃，相對濕度40%～70%，實驗前在動物房環境中適應性喂養4 d。

甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜級）德國Merck公司；諾哌丁胺、活性炭粉、阿拉伯樹膠、芹菜素、圣草酚、木犀草素、柚皮素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、異牡荊素、芹菜素-6,8-C-雙葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖基-8-C-阿拉伯糖苷、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、苯甲基櫻草糖苷、苯乙基櫻草糖苷、綠原酸、奎寧酸、哌啶酸、焦谷氨酸、腺苷、腺嘌呤核糖核苷酸、膽堿和(S)-5’-脫氧-5’-(甲基亞磺酰基)腺苷及其他色譜或質譜級化合物或試劑 美國Sigma公司；去離子水由Milli-Q超純水制備系統生產。

1.2 儀器與設備

UPLC-Q-Exactive/MS儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；粉碎研磨機 德國IKA公司；SQP電子天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DK-S11型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；5810R型高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 干預組毛健綠茶水提物劑量計算

按照成年人（平均體質量60 kg）每日平均飲茶量5 g計算，飲茶劑量為83.33 mg/（kg·d）[14-15]。按照上述茶葉提取物制備方法，提取率約為50%（兩次提取過濾冷凍干燥后獲得的茶葉提取物與茶葉質量的占比），則換算成毛健綠茶提取物粉末的劑量則為41.6 mg/（kg·d）。參考《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營養素補充劑（2020年版）（征求意見稿）》中的“有助于消化功能檢驗方法”，小鼠實驗劑量以相當于人推薦量的5、10 倍和20 倍分別設置為低、中、高3 個劑量組，即0.21、0.42、0.83g/（kg·d）；大鼠實驗劑量以相當于人推薦量的2.5、5 倍和10 倍分別設置為低、中、高3 個劑量組，即0.10、0.21、0.42 g/（kg·d）。每次臨用前用去離子水配制成各劑量，超聲助溶，充分混勻后供試。

1.3.2 小鼠小腸運動實驗

參考《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營養素補充劑（2020年版）（征求意見稿）》和彭章蒙等[16]的實驗方法并作適當修改，實驗設3 個毛健綠茶水提物劑量組（0.21、0.42、0.83 g/（kg·d））、一個陰性對照組（去離子水）和一個模型對照組（洛哌丁胺），每組10 只小鼠。毛健綠茶低、中、高3 個劑量組小鼠灌胃給予不同劑量的毛健綠茶水提物溶液，每天一次，連續31 d；灌胃容量均按10 mL/kg體質量計；不同劑量的毛健綠茶水提物溶液配制方法為分別稱取0.21、0.42、0.83 g毛健綠茶水提物粉末，加去離子水至10 mL，樣品每日臨用前新鮮配制。實驗結束前禁食不禁水24 h，于測定當天各實驗組給予一次受試樣品，陰性及模型對照組給予一次去離子水，30 min后各實驗組和模型對照組給予3.33 mg/kg洛哌丁胺，陰性對照組給予去離子水，30 min后各組再給予指示劑墨汁（含5%的活性炭粉和10%阿拉伯樹膠），25 min后斷頸椎脫臼處死小鼠，計算墨汁推進率。墨汁推進率按下式計算：

1.3.3 大鼠體質量、體質量增量、攝食量、食物利用率、胃蛋白酶活性及胃蛋白酶排出量測定

參考《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營養素補充劑（2020年版）（征求意見稿）》和葉美玉等[17]的實驗方法并作適當修改，共設3 個毛健綠茶水提物劑量組（0.10、0.21、0.42 g/（kg·d））和一個陰性對照組（去離子水），每組10 只大鼠。毛健綠茶低、中、高3 個劑量組大鼠灌胃給予不同劑量的毛健綠茶水提物溶液，每天1 次，連續29 d；灌胃容量均按10 mL/kg體質量計；不同劑量的毛健綠茶水提物溶液配制方法為分別稱取0.625、1.250 g和2.500 g毛健綠茶水提物粉末，加去離子水至60 mL。期間每周測2 次體質量和食物攝入量，并在實驗結束時計算大鼠體質量、體質量增量、總攝食量和食物利用率。食物利用率為動物每攝入100 g飼料所增長的體質量。

實驗結束前各組動物禁食不禁水24 h，麻醉后進行大鼠幽門結扎術收集5 h內排出的胃液，每組選取手術成功動物8 只，測定單位時間內胃液量。取胃液1 mL放入50 mL的三角燒瓶中，加入15 mL（0.05 mol/L）鹽酸溶液搖勻，放入新鮮制作的蛋白管兩根。塞好瓶口，在37 ℃恒溫箱中孵育24 h，取出蛋白管，用尺測量蛋白管兩端透明部分的長度（mm），以四端之值求其平均值。按下式計算大鼠胃蛋白酶活性和胃蛋白酶排出量：

1.3.4 代謝組學樣品前處理

參考課題組前期建立的方法并進行適當修改[18]，將10 mL 100 ℃的沸水加入到0.1 g毛健綠茶水提物粉末中，于70 ℃條件下水浴加熱10 min，取1.5 mL上清液于離心管中，8000×g離心10 min，得到的上清液通過0.45 μm濾膜進行過濾，用于后續代謝組學檢測分析；每個茶樣按照以上步驟平行處理3 份（n＝3）。

1.3.5 毛健綠茶水提物中主要成分檢測及定量

參考課題組前期建立的方法[19]，采用UPLC-QExactive/MS檢測毛健綠茶水提物中的主要化學成分，使用Xcalibur 4.2（ThermoFisher，美國）軟件，根據標準品的m/z和保留時間進行定性，根據峰面積進行定量。

液相色譜條件：色譜柱：HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；二元流動相：A為超純水（含0.1%甲酸），B為乙腈（含0.1%甲酸）；流速0.4 mL/min；進樣量3 μL；洗脫程序：0～0.5 min，92% A、2% B；0.5～10.0 min，98%～85% A、2%～15% B；10～18 min，85%～60% A、15%～40% B；18～20 min，60%～10% A、40%～90% B；20.0～20.9 min，10% A、90% B；20.9～21.0 min，10%～98% A、90%～2% B；21～25 min，98% A、2% B。

質譜條件：電噴霧電離源，正離子模式；掃描范圍m/z80～1200；噴霧電壓3.5 kV；鞘氣和輔助氣流速分別為45 L/min和10 L/min；輔助氣溫度350 ℃；離子傳輸管溫度300 ℃。采用外標法測定黃酮/黃烷酮苷元及7-O-葡萄糖苷的含量，芹菜素、圣草酚、木犀草素、柚皮素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷和木犀草素-7-O-葡萄糖苷以1、2、5、10、20、50、100、500、1000 μg/mL的標準品質量濃度建立標準曲線，柚皮素-7-O-葡萄糖苷使用芹菜素-7-O-葡萄糖苷的標準曲線計算含量。

1.4 數據處理

數據統計和顯著性分析使用SPSS 19.0軟件，所有計量數據均為±s，先對數據作方差齊性檢驗，方差齊，采用單因素方差分析進行比較，兩兩比較采用q檢驗；原始數據不能滿足方差齊性的，改用秩和檢驗；檢驗水準α均取0.05。UPLC-Q-Exactive/MS采集的數據使用Xcalibur 4.2（ThermoFisher，美國）軟件，根據標準品的質荷比和保留時間進行定性，根據峰面積進行定量。

2 結果與分析

2.1 毛健綠茶水提物促消化功能

2.1.1 毛健綠茶水提物對小鼠小腸運動功能的影響

消化不良主要與小腸的蠕動有關[20]，因此可通過測定小腸運動功能評價消化功能狀態。洛哌丁胺為臨床常用止瀉藥物，過量服用則可導致便秘[21]，相關文獻報道，洛哌丁胺能夠明顯減弱小鼠胃腸蠕動，可用于構建消化不良模型[22]。為探究毛健綠茶水提物對小鼠小腸運動功能的影響，本實驗對陰性對照、模型對照及低、中、高劑量毛健綠茶水提物組小鼠連續灌胃給藥31 d，通過測定墨汁推進率評價其促消化效果，結果如表1所示，與陰性對照組（（69.9±8.1）%）相比，模型對照組小鼠小腸墨汁推進率（（42.5±14.3）%）顯著降低（P＜0.05），表明消化不良模型構建成功，引起小鼠腸道便秘；當通過不同劑量毛健綠茶水提物干預飼養后，發現與模型對照組（（42.5±14.3）%）相比，高劑量毛健綠茶水提物組（（62.1±9.8）%）可以顯著提高小鼠墨汁推進率（P＜0.05），而低、中劑量組小鼠墨汁推進率也有所提高，但未達到顯著差異水平，表明高劑量毛健綠茶水提物（0.83 g/（kg?d））可以通過促進小鼠小腸推進運動、增加腸蠕動能力，從而對功能性消化不良引起的小腸推進緩慢起到明顯的改善作用。

表1 毛健綠茶水提物對小鼠墨汁推進率的影響（n＝10）Table 1 Effect of MJ-GTE on intestinal propulsion ratio of ink in mice (n=10)

2.1.2 毛健綠茶水提物對大鼠體質量、體質量增量、攝食量和食物利用率的影響

如表2所示，在大鼠飼養的29 d中，陰性對照及低、中、高劑量毛健綠茶水提物組大鼠的體質量均表現出逐步增長趨勢，但各組之間無顯著差異（P＞0.05）。各組之間的體質量增量、攝食量和食物利用率與陰性對照組相比，均無顯著差異（P＞0.05），表明0.10、0.21、0.42 g/（kg?d）劑量的毛健綠茶水提物給藥對大鼠體質量、體質量增量、攝食量和食物利用率無明顯影響。

表2 毛健綠茶水提物對大鼠體質量、體質量增量、攝食量和食物利用率的影響（n＝10）Table 2 Effect of MJ-GTE on body mass,body mass gain,food intake,and food utilization in rats (n=10)

2.1.3 毛健綠茶水提物對大鼠胃液量、胃蛋白酶活性和胃蛋白酶排出量的影響

食物在胃腸中進行消化主要是通過消化酶的消化和胃腸運動[23]，本研究通過測定胃蛋白酶活性和胃蛋白酶排出量研究毛健綠茶水提物的促消化效果。如表3所示，與陰性對照組的胃蛋白酶活性（（138.9±58.3）U/mL）相比，各劑量毛健綠茶水提物組均無顯著差異（P＞0.05），但中劑量組胃蛋白酶排出量（（527.6±231.4）U/h）相較于陰性對照組（（277.7±94.2）U/h）則顯著升高（P＜0.05）。參考《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營養素補充劑（2020年版）（征求意見稿）》中的“有助于消化功能檢驗方法”，按照“實驗組與陰性對照組比較，胃液量、胃蛋白酶活性、胃蛋白酶排出量3 項指標中任一指標增加，經統計處理差異有顯著性，可判定該實驗結果陽性”的標準，可判定0.21 g/（kg?d）劑量的毛健綠茶水提物可以通過促進胃蛋白酶排出量以改善功能性消化不良。

表3 毛健綠茶水提物對大鼠胃液量、胃蛋白酶活性和胃蛋白酶排出量的影響（n＝8）Table 3 Effect of MJ-GTE on gastric juice volume,pepsin activity,and pepsin excretion in rats (n=8)

2.2 基于UPLC-Q-Exactive/MS的毛健綠茶水提物化學成分分析

采用UPLC-Q-Exactive/MS對毛健綠茶水提物中的主要成分進行分析，通過與標準品、代謝組學數據庫（HMDB和Metlin）、保留時間、精確分子質量、二級質譜等相關信息比對并結合課題組前期的實驗結果[24-26]共鑒定出98 個化合物，包括4 個黃酮/黃烷酮類化合物（芹菜素、圣草酚、木犀草素和柚皮素），17 個黃酮/黃酮醇/黃烷酮-O-糖苷類化合物（芹菜素-7-O-葡萄糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、圣草酚-7-O-雙葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷等），4 個黃酮-C-糖苷類化合物，1 個三萜類化合物（三萜皂苷I），12 個氨基酸類化合物，2 個氨基酸衍生物類化合物，3 個香氣前體類化合物，13 個酚酸類化合物，9 個有機酸類化合物，12 個脂類化合物，11 個生物堿類化合物及10 個其他類化合物，具體信息見表4。

表4 毛健綠茶水提物中鑒定出的化合物信息Table 4 Information of compounds identified from MJ-GTE

本實驗前期對毛健綠茶代謝組學化學成分解析表明黃酮/黃烷酮苷元及其對應的7-O-葡萄糖苷是毛健綠茶的主要成分[8]，因此本實驗進一步對這些關鍵成分進行定量分析。黃酮/黃烷酮苷元及7-O-葡萄糖苷標準品及其在毛健綠茶水提物中的色譜圖如圖1 所示。定量結果表明毛健綠茶水提物中的黃酮/黃烷酮苷元總量為（2.89±1.18）mg/g，其中圣草酚含量最高（圣草酚＞木犀草素＞柚皮素＞芹菜素），為（1.49±0.43）mg/g。黃酮/黃烷酮苷-7-O-糖苷總量為（53.11±1.97）m g/g，是其對應游離苷元總量的18 倍，芹菜素-7-O-葡萄糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷和柚皮素-7-O-葡萄糖苷的含量分別為（0.57±0.04）、（38.98±0.62）、（9.07±0.31）mg/g和（4.49±0.10）mg/g（表5）。

圖1 黃酮/黃烷酮苷元及7-O-葡萄糖苷標準品（A）和毛健綠茶水提物中黃酮/黃烷酮苷元及7-O-葡萄糖苷（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of standards of flavone/flavanone aglycones and their 7-O-glycosides (A),and chromatograms of flavone/flavanone aglycones and their 7-O-glycosides from MJ-GTE (B)

表5 毛健綠茶水提物中主要黃酮/黃烷酮苷元及其7-O-葡萄糖苷含量Table 5 Contents of major flavones/ flavanones and their 7-O-glycosides in MJ-GTE

2.3 毛健綠茶水提物促消化功能與化學成分關系探討

胃腸道是營養物質攝取、消化與吸收的器官，對食物的消化功能主要依靠胃腸運動的機械性消化和消化酶的化學消化完成，如果某一食品或藥品能對此環節具有調節作用，便有可能起到促進消化的作用[23]。本實驗結果可以看出，盡管各劑量組毛健綠茶水提物對正常大鼠的體質量、體質量增量、攝食量和食物利用率無顯著影響，但結合高劑量毛健綠茶水提物組可以顯著提高小鼠墨汁推進率和中劑量毛健綠茶水提物組可以顯著促進大鼠胃蛋白酶排出量這兩個指標，可以得出毛健綠茶水提物具有一定的促消化作用。

進一步采用基于UPLC-Q-Exactive/MS的代謝組學方法對毛健綠茶水提物化學成分進行解析，共鑒定出98 個化合物，其中，黃酮（芹菜素和木犀草素，0.14～0.77 mg/g）、黃烷酮（柚皮素和圣草酚，0.49～1.49 mg/g）、黃酮-7-O-葡萄糖苷（0.57～9.07 mg/g）和黃烷酮-7-O-葡萄糖苷（4.49～38.98 mg/g）是其特征性成分，其中圣草酚-7-O-葡萄糖苷含量最高（（38.98±0.62）mg/g）。近些年來，關于黃酮類化合物對促消化功能的研究報道相對較多。Wu Lei等[27]研究發現毛健綠茶水提物可以顯著促進大鼠的胃排空和小腸推進作用，并通過增加有益菌群的豐度改善胃腸蠕動，推測可能與其富含黃酮類化合物如圣草酚、木犀草素、圣草酚-7-O-葡萄糖苷和木犀草素-7-O-葡萄糖苷等有關；另一項研究也表明[28]，毛健綠茶醇提物可以顯著修復胃腸蠕動活動的慢性破壞如改善大鼠胃排空延遲和小腸推進功能下降等現象。王煜姣等[29]發現木犀草素和柚皮素是治療功能性消化不良的主要活性成分，如木犀草素能直接作用于胃腸道平滑肌，對大鼠回腸收縮和蠕動有興奮作用，而柚皮素則具有顯著促進胃腸蠕動等藥效作用，從而對腸道運動產生調節作用。傅曼琴等[23]研究表明黃酮類化合物可能是廣陳皮發揮促消化功能的主要活性成分，如川陳皮素、橘皮素、橙皮苷及三者組合（川陳皮素、橘皮素、橙皮苷質量比1∶1∶5）可以顯著促進胃液、胃蛋白酶的排出，提高胃蛋白酶活性并增強其消化能力；另有研究表明不同劑量橙皮苷（50、100 mg/kg和200 mg/kg）均可顯著提高功能性消化不良大鼠的小腸推進率和胃排空率[30]。吳鎮宇等[31]報道枳實總黃酮苷提取物對功能性消化不良大鼠近端胃適應性具有一定的調節作用，其作用途徑可能與降低近端胃體平滑肌張力有關。程秋月等[32]的研究也表明高良姜總黃酮可以顯著抑制回腸收縮運動，這種效應可能主要通過H受體介導、膽堿能受體、Ca2+通道或對平滑肌直接起作用而改善消化系統。因此推測，本研究毛健綠茶水提物具有一定的促消化作用可能也與其含有豐富的黃酮類化合物有關。此外，有研究報道山楂及其水提液可以通過收縮大鼠腸平滑肌和增加胃蛋白酶分泌而顯著促進胃腸運動作用，這可能與其富含的綠原酸有關[33-34]，本研究化學成分分析表明毛健綠茶提取物中也含有一定量的綠原酸（表4）。后續實驗將進一步對上述化合物單體成分的促消化功能及其作用機理進行深入研究。

3 結論

本研究采用保健食品功效學實驗對毛健綠茶水提物的促消化功能進行評價，并結合UPLC-Q-Exactive/MS的代謝組學方法對毛健綠茶水提物的化學成分進行系統解析。動物實驗結果表明高劑量毛健綠茶水提物組（0.83 g/（kg·d））小鼠墨汁推進率和中劑量毛健綠茶水提物組（0.21 g/（kg·d））大鼠胃蛋白酶排出量均顯著升高（P＜0.05），表明毛健綠茶具備一定的促消化功能；代謝組學分析在毛健綠茶水提物中鑒定出98 種化合物，其中黃酮（芹菜素和木犀草素，0.14～0.77 mg/g）、黃烷酮（柚皮素和圣草酚，0.49～1.49 mg/g）、黃酮-7-O-葡萄糖苷（0.57～9.07 mg/g）和黃烷酮-7-O-葡萄糖苷（4.49～38.98 mg/g）為毛健綠茶水提物的主要特征性成分。毛健綠茶水提物通過促進小腸推進運動和胃蛋白酶排出量，進而增強腸道蠕動發揮促消化作用，推測可能與其富含的黃酮類化合物有關，后續將進一步對具體化合物的促消化功能進行深入探討。