醬香型原酒貯存期金屬元素含量變化及其對風味化合物的影響

范宸銘，惠 明,2, ，田 青，尤永松

（1.河南工業大學生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.工業微生物菌種保藏與選育河南省工程實驗室，河南 鄭州 450001；3.貴州省金沙縣貴奇酒廠，貴州 金沙 551801）

醬香型白酒采用獨特的“12987”的釀造工藝，即為2 次投料、9 次蒸煮、8 次發酵、7 次取酒[1]，造就了其獨特的酒體風格，使其成為中國白酒的代表之一[2]。然而新蒸餾出來的白酒，入口暴辣、刺激性強、單薄[3-4]，是生產的半成品。為得到高質量的勾調醬香型白酒，醬香型原酒一般都需要在陶壇中貯存，少則半年，多則1 a或者3 a乃至更長的時間[5]。金屬元素對白酒老熟的催化作用，已成為近年來普遍研究的課題[6]。隨著對白酒老熟研究的深入，金屬元素對于白酒酒體風格的解析研究成為了白酒科研領域的熱點之一，同時白酒中金屬元素含量也成為品質標準化和生產機械化的關鍵[7]。

層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）被應用于白酒不同輪次研究[8]、年份識別[9]、品質鑒定[10]等方面。卓俊納等[11]使用電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasmamass spectrometry，ICP-MS）法測定4 個品牌醬香型白酒金屬元素含量，利用聚類分析、PCA和PLS-DA對酒樣進行分類鑒定。王振杰等[12]使用ICP-MS測定豫產白酒中金屬元素的含量，利用PCA和聚類分析對金屬元素分布進行評價，研究豫酒中各金屬元素含量的分布規律及其特征。

本實驗采用ICP-MS檢測同一產地、同一釀造原料、皆為取酒階段中第4輪次原酒且貯存年份分別為0、2、4、6、8、10 a的3 個不同品牌的36 個原酒酒樣中的25 種金屬元素含量。主要采用PCA構建鑒別模型，利用HCA、PLS-DA找出不同貯存年份原酒之間的關鍵差異金屬元素，分析其對原酒風味的影響。為探究金屬元素與貯存年份之間提供量化關系，建立模型對不同貯存年份醬香型原酒進行有效分類和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：由3 個貴州酒企提供的36 個原酒。將酒樣按不同貯存年份分為6 類，其中，貯存0、2、4、6、8、10 a原酒各6 個。樣品編號分別為AX、BX、HX、HZX、JX、JJX，其中X為貯存年份。

驗證酒樣：取不同于樣品中3 個酒廠的原酒樣品6 個，貯存年份分別為0、2、4、6、8、10 a（所有酒樣均選用同種材質、同種規格陶壇貯存）。

差異性金屬酒樣：在HZ原酒貯存0 a樣品中加入Al、Ca、K、Na、Fe單元素金屬標準溶液，分別得到含2 mg/L Al、Ca、K、Na、Fe的原酒樣品。添加金屬的原酒樣品為實驗組，不添加金屬的原酒樣品為對照組。所有樣品裝灌于玻璃瓶避光環境15 ℃保存兩個月。

Na、K、Al、Fe、K、Mg、Li、Be、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Sr、Ru、Cd、In、Ba、Ce、Hg、Ti、Bi、Rh和Ge單元素標準溶液 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸（65%，分析純）德國Merck公司；叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸（均為色譜純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所用器皿在使用前均經質量分數為30%的HNO3溶液浸泡24 h以上，依次用超純水沖洗備用。

1.2 儀器與設備

iCAP RQ ICP-MS儀、TSQ 9000氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀 美國Thermo Fisher公司；超聲波清洗機寧波新芝生物科技股份有限公司；ZXRD-7140恒溫鼓風干燥箱 上海智城分析儀器公司；SK-2-20超純水制備機科爾頓水務有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金屬元素檢測

1.3.1.1 溶液的配制

混標溶液配制：因酒樣中各元素質量濃度與各元素本身特性存在差異，故將Na、Ca、Al配成一組混標溶液，系列質量濃度為0、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20 mg/L。Fe、K、Mg配成一組混標溶液，系列質量濃度為0、10、20、50、100、200、300、400、500 μg/L。Li、Be、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Sr、Ru、Cd、In、Ba、Ce、Hg、Ti配成一組混標溶液，系列質量濃度為0、0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、50 μg/L。

內標溶液配制：將Bi、Ge、Rh配成質量濃度為25 μg/L內標標準溶液。

1.3.1.2 樣品預處理吸取1 mL酒樣于微波消解罐中，加入5 mL硝酸，進行微波消解，參數：最大功率1400 W，微波加熱5 min至120 ℃保持5 min，繼續加熱5 min至160 ℃保持10 min，最后加熱5 min至180 ℃保持10 min。冷卻后取出微波消解罐，在電熱板中于140～160 ℃趕酸至1 mL左右，待至冷卻后用超純水洗滌微波消解罐定容至10 mL容量瓶中[13]。

1.3.1.3 金屬元素含量測定

為避免多種金屬元素測定時相互影響，故采用動能歧視（kinetic energy discrimination，KED）模式進行測定。將酒樣進行ICP-MS測定，參數：射頻功率1550 W，輔助氣流量0.8 L/min，冷卻氣流量4 L/min，霧化氣流量1.0264 L/min，霧化室溫度1.7 ℃，等離子氣流量15 L/min，采集駐留時間40 ms，蠕動泵轉數40 r/min，KED電壓3 V，重復進樣3 次。并在線加入內標溶液進行內標標準溶液校正。由工作站軟件分析數據、繪制標準曲線、計算酒樣各金屬元素含量。

1.3.2 揮發性物質測定

取適量酒樣過0.22 μm有機濾膜，吸取990 μL過膜后的酒樣于2 mL氣相色譜進樣瓶中，加入10 μL混和內標溶液（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸，體積分數1%），加蓋密封，備用、待測。所有酒樣重復測定3 次。

氣相色譜條件：TR-FFAP色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm，260 N 154 P）；載氣為高純度氦氣（99.999%），流速1.00 mL/min；進樣口溫度250 ℃；分流進樣，分流比30∶1；溶液延遲2 min；升溫程序：初始溫度30 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫至100 ℃，再以15 ℃/min升溫至220 ℃，保持8 min。

質譜條件：電離能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度230 ℃；監測方式為采用多反應監測模式，掃描時間設置300 ms；四極桿溫度150 ℃；溶液延遲5 min。

1.4 數據處理

用SPSS 26.0軟件對測定數據進行z-score標準化處理、PCA、HCA、單因素方差分析；用SIMCA 14.1軟件進行PCA、PLS-DA及變量權重重要性排序分析；用Excel 365、Origin 2021軟件對測定數據進行歸一化處理統計及畫圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同貯存年份原酒的金屬元素

通過ICP-MS測定所有酒樣中Na、K、Al、Fe、K、Mg、Li、Be、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Sr、Ru、Cd、In、Ba、Ce、Hg、Ti共計25 種金屬元素的質量濃度，具體見表1。

表1 各貯存年份醬香型原酒金屬元素質量濃度范圍Table 1 Concentration ranges of metal elements in base liquor of different ages for Maotai-flavor Baijiu μg/L

據研究顯示K對白酒的口感以及酒體的質量起到重要的作用，能夠促使酒體的老熟，使得酒體柔和、細膩、醇香；Ca和Mg含量通?？梢蚤g接反映水體的硬度情況，含量越高說明水體硬度越高，當質量濃度小于10 mg/L時反映出水體質量相對較好；Fe含量是影響酒體顏色最重要的原因，含量越多，酒體就會相對較黃[14]。金屬元素也與酒的穩定性有關，如Ca、Mg、Fe、Ba等均可引起白酒的渾濁或沉淀，影響白酒的質量，但適量的金屬元素能使能使酒體柔和，減少刺激感[15]。故原酒中各金屬元素在一定限度的增加會促進酒體老熟，但貯存過久各金屬含量過高會使得原酒咸、苦、澀，導致酒質變差[16]。由表1所示，隨著貯存年份的增加，Fe、Al、K、Mg、Ca、Na質量濃度都呈明顯增加的趨勢，Zn、Mn、Ba、Ga、As質量濃度略有增加。因貯存所用陶罐是用燒制的黏土制成，表面涂上釉。它的主要成分是SiO2和Al2O3并含有少量的金屬氧化物，如CaO、Fe2O3、CuO、NiO和TiO2等[17]，這些金屬氧化物在貯存過程中慢慢溶解到白酒中，使原酒中大部分金屬元素質量濃度與貯存年份呈正相關。

2.2 PCA結果

PCA是一種常用的降維多元分析方法[18]。在PCA的前提下，采集公因子，并針對性的展開分析，具體數據見表2。以累計方差貢獻值＞80%且特征值＞1為原則，選擇公因子數為5 個時，累計方差貢獻率為84.835%，25 種元素的有關參數都顯示在其中，選擇前5 個PC，并基于這一結果對36 種酒樣的分布規律予以說明。并得到其PC的特征值、方差貢獻率及累計貢獻率（表2），PC載荷矩陣及特征向量（表3）。

表2 PC特征值及其貢獻率Table 2 Eigenvalues and contribution rates of principal components

表3 PC載荷矩陣及特征向量Table 3 Load matrix and eigenvectors of principal components

由表3可建立5 個PC的線性回歸方程，即：

以每個PC所對應的特征值占所提取PC總的特征值之和的比例作為權重，計算PC綜合得分模型。即為：

將36 個樣品按照貯存0、2、4、6、8、10 a分類，進而更系統、準確地分析不同貯存年份的變化，利用PCA構建鑒別模型，找出鑒別不同貯存年份醬香型原酒的客觀評價方法。根據評價模型計算不同貯存年份原酒的PC得分及綜合得分。運用PCA降低原始數據中的25 個變量，選取5 個能夠代表全部指標的PC為新變量，即可以用這5 個新變量衡量金屬元素在不同貯存酒樣中的分布情況。從表3可以看出，PC1在X2、X3、X7、X8、X9、X10、X13、X14、X15、X17、X19、X21、X22、X23、X24處出現較大負荷值，與其對應的Cd、Bd、Ga、Co、V、Se、As、Cu、Li、Mn、Fe、Al、K、Mg、Ca存在高度的正相關性，并結合使用相關系數矩陣繪制成圖1對數據進行適應性檢驗，表明酒樣中的金屬元素間相關性較強，該結果與卓俊納等[11]研究結果類似。如表4所示，在原酒貯存0～10 a區間，貯存年份越久，金屬元素對于原酒酒體影響的綜合得分越高。該模型與綜合得分僅用于金屬元素對于醬香型原酒的影響程度及鑒別不同貯存年份醬香型原酒，并不能作為分辨酒體本身屬性的標準。綜上，說明建立的模型具有實際意義，能夠判別不同貯存年份醬香型原酒。

圖1 各金屬元素相關性熱圖Fig.1 Heatmap for correlation among metal elements

表4 不同貯存年份酒樣PC得分及綜合得分Table 4 Principal component scores and comprehensive scores of base liquor samples of different ages

2.3 HCA結果

HCA是用于探索數據集時發現新的組、類結構的一組統計方法[19]。對36 個酒樣中25 種金屬元素含量進行標準化處理，基于歐氏距離為聚類距離，繪制層次聚類熱圖[20]，以顯示不同貯存年份醬香型原酒聚類狀態，更直觀地呈現金屬元素的含量變化規律及差異。以單一酒樣為聚類個體（圖2A），由于不同品牌酒樣間金屬元素含量存在較大差異，層次聚類不夠清晰直觀。而以貯存年份為聚類個體（圖2B），不同貯存年份醬香型原酒被明顯區分開。說明不同品牌酒樣之間雖差異很大，但貯存過程中金屬元素的析出具有時間效應。趙金松等[21]研究指出白酒中金屬元素含量尤其是鐵離子含量隨貯存時間延長而增加，這些金屬元素與香氣物質形成了較強的絡合作用[22]，改變了酒體的色、香、味、格。

圖2 不同貯存年份酒樣聚類熱圖Fig.2 Cluster heatmaps of base liquor samples of different ages

隨著貯存年份的增加，Se、Ba、Ru、In、Hg、Ti的相對含量呈下降的趨勢，Ni、Ce、Sr、V、As、Cu、Ga、Li、Mg、K、Mn、Fe、Al、Ca、Na、Zn、Cd、Bd、Co的相對含量呈上升趨勢。聚類結果表明，所有酒樣共分為4 類。貯存2、4 a的酒樣為一類，貯存6、8 a的酒樣為一類，貯存0、10 a的酒樣單獨為一類。其中貯存0 a酒樣更靠近貯存2 a酒樣與貯存4 a酒樣，貯存10 a酒樣更靠近貯存6 a酒樣與貯存8 a酒樣。

2.4 PLS-DA結果

2.4.1 PLS-DA模型檢驗

PLS-DA是一種用于預測和描述建模的多元統計分析方法[23]。采用SIMCA 14.1進行PLS-DA，找出不同貯存年份酒樣的金屬元素差異[24]。如圖3所示，PLS-DA能有效區分不同貯存年份酒樣，隨著貯存時間延長，對應酒樣散點均會向X負半軸方向進行推移，且相對集中。結果表明，PLS-DA分類結果與PCA、HCA類似，說明原酒中的各金屬元素種類及含量能通過PLS-DA模型有效區分不同貯存年份醬香型原酒。如圖4所示，由R2和Q2回歸線可知，通過置換檢驗得到的R2＝0.0733，Q2＝-0.169，Q2∈（-1，0），說明此模型沒有過擬合現象。此模型穩健，故可進行后續差異分析。

圖3 不同貯存年份醬香型原酒PLS-DA散點圖Fig.3 PLS-DA scattering plot of base liquors of different ages for Maotai-flavor Baijiu

圖4 PLS-DA模型的置換檢驗Fig.4 Permutation test PLS-DA model

2.4.2 關鍵差異金屬元素分析

每個變量對已構建模型的貢獻大小如圖5所示。其中，離原點和聚集集團越遠的變量對樣本的差異貢獻度越大[25]?？煽闯鯝l、Ca、K、Na、Fe、Mg、Zn離原點及金屬元素聚集集團較遠，可能對不同貯存年份酒樣有較大的差異貢獻度。

圖5 不同貯存年份醬香型原酒PLS-DA載荷圖Fig.5 PLS-DA loading plot of base liquor of different ages for Maotaiflavor Baijiu

變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值是PLS-DA模型變量的變量權重值，VIP＞1為常見的差異物質篩選標準[26-27]。圖6為不同貯存年份醬香型原酒的VIP分布圖，VIP值越大，則代表其對不同貯存年份醬香型原酒差異貢獻度越大。為找出對不同貯存年份醬香型原酒差異貢獻度較大的金屬元素，故選擇VIP＞1的金屬元素，即Al（VIP＝2.903）、Ca（VIP＝2.503）、K（VIP＝1.930）、Na（VIP＝1.534）、Fe（VIP＝1.448）、Zn（VIP＝1.153）。再通過對Al、Ca、K、Na、Fe、Zn進行單因素方差分析，以P值小于0.01作為極為顯著金屬元素，最終確定5 個差異金屬元素，即Al、Ca、K、Na、Fe。上述金屬元素與Song Xuebo等[28]通過金屬元素對不同產區醬香型白酒分類鑒定的差異性金屬元素類似，故PLS-DA能有效鑒定不同貯存年份酒樣差異性金屬元素。

圖6 不同貯存年份醬香型原酒VIP圖Fig.6 VIP analysis of key differential metal elements in base liquor of different ages for Maotai-flavor Baijiu

2.4.3 不同貯存年份醬香型原酒金屬元素含量差異分析

本實驗對所有酒樣進行25 種金屬元素檢測，利用PLS-DA與單因素方差分析篩選出5 種關鍵差異金屬元素，即Al、Ca、K、Na、Fe。因貯存時間不同導致酒樣生產時間不同，為減少其他原因影響本實驗，故所有酒樣均選用第4輪次取酒階段且貯存容器都為同種陶壇，造成這種差異現象可能有以下兩個方面：1）釀酒水質不同[29]。茅臺鎮醬香型白酒均選用凈化過后的赤水河河水作為釀酒水源，但赤水河河水每年的水質不盡相同，其含金屬元素種類及含量也各不相同，故在生產過程中會使該年河水中的金屬元素保留在酒體中。2）酒體平衡度不同[30]。因酒體自身所含金屬元素及陶壇析出的金屬元素，在貯存初期能促進乙醇分解，使得酒體醇厚、口感柔和。酒體中低沸點、易揮發的成分物質揮發，促進乙醇與水分子之間發生氫鍵締合，導致酒體的刺激性、沖鼻味和粗糙感等逐漸消失，締合達到平衡[31]。達到平衡后酒體可能緩慢或不再吸收陶壇析出的金屬元素。

2.5 不同貯存年份醬香型原酒鑒別模型驗證結果

在相同的條件下分別對驗證酒樣的不同貯存年份醬香型原酒進行ICP-MS金屬元素檢測。采用已構建的鑒別模型（2.2節）計算各酒樣的綜合得分F并對其排名，對鑒別模型進行驗證，結果見表5。

表5 不同貯存年份醬香型原酒綜合得分Table 5 Comprehensive scores of base liquor of different ages for Maotai-flavor Baijiu

由表5可知，不同貯存年份酒樣的綜合得分F隨著貯存年份的增加而升高，貯存10 a酒樣得分F大于1。且結合表4可判斷其品質應與模型中貯存10 a酒樣類似；貯存6、8 a酒樣的綜合得分F值∈（0，1）；貯存0、2、4 a酒樣的綜合得分F值均低于0，且F值∈（-1，0）。綜上，驗證酒樣綜合得分與模型接近。本研究構建的鑒別模型可有效識別不同貯存年份醬香型原酒，具有實際應用意義。

2.6 關鍵差異金屬對原酒風味影響分析

將差異性金屬原酒5 個實驗組、1 個對照組共計6 個酒樣進行氣相色譜-質譜檢測，由工作站進行定性、定量以及氣味活性值（odor active value，OAV）計算，結果見表6。

表6 不同金屬元素酒樣揮發性物質的定性、定量分析及OAVTable 6 Qualitative and quantitative analysis and OAV of volatile components in base liquor of different ages for Maotai-flavor Baijiu

通過氣相色譜-質譜共檢出42 種風味物質，包括酯類14 種、醇類9 種、酸類5 種、醛酮類5 種、呋喃類3 種、吡嗪類3 種、芳香烴類3 種。酒樣中添加了金屬元素后，風味化合物質量濃度均有變化。其中實驗組對比對照組的酯類總質量濃度降低。在添加Al后，除了異丁酸乙酯，其他酯類質量濃度降低了0.13%～42.65%。添加Ca后，除了乙酸乙酯、異丁酸乙酯、甘油二酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、其他酯類質量濃度降低了4.72%～35.68%。添加K后，除了乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯，其他酯類質量濃度降低了2.82%～38.64%。添加Na后，除了異丁酸乙酯、甘油二酯、棕櫚酸乙酯，其他酯類質量濃度降低了5.17%～39.64%。添加Fe后，除了乙酸乙酯、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯，其他酯類質量濃度降低了0.34%～38.64%?？傮w來看，金屬元素對酒體中風味化合物的合成分解有不同的影響。這些金屬元素通常促進酯類的水解，使得酒體中酸類化合物增加，有助于加強水和乙醇之間的氫鍵作用[32]，從而減少入口的感官刺激。此外，不同的金屬元素的添加導致了酒樣中大部分醛酮類與芳香烴類質量濃度的減少，可能是因為金屬元素易于促進醛酮類與芳香烴類合成或分解成其他化合物[33]。對于吡嗪類，除了添加了K和Fe的其他酒樣，吡嗪類化合物質量濃度均有不同質量濃度上升。綜上，金屬元素對原酒貯存有促進作用，主要表現為原酒在貯存過程中，金屬元素促進了總酸含量增加，總酯含量減少[34]，因此金屬元素可用于分類鑒定不同貯存年份醬香型原酒。

3 結論

采用微波消解法結合ICP-MS測定了3 種品牌6 個不同貯存年份的36 個醬香型原酒的25 種金屬元素含量。對所有樣品進行PCA、HCA和PLS-DA。采用PCA可將貯存年份為0、2、4、6、8、10 a的醬香型原酒明顯區分為6 類并構建不同貯存年份醬香型原酒鑒別模型，選擇1 組不同貯存年份醬香型原酒酒樣進行驗證，結果表明，鑒別模型均能很好地識別不同貯存年份醬香型原酒。利用PLS-DA中的載荷圖鑒別、VIP值、單因素方差分析對造成差異性的關鍵金屬元素進行分析，最終確定不同貯存年份醬香型原酒間的5 個關鍵差異金屬元素，即Al、Ca、K、Na、Fe。通過與ICP-MS金屬元素定性、定量與HCA，發現5 個關鍵差異金屬元素及總金屬元素含量隨著貯存年份的延長而增加，說明貯存過程中金屬元素的析出具有時間效應。在貯存0 a原酒中加入差異性金屬元素發現其對原酒貯存有促進作用，主要表現為原酒在貯存過程中，金屬元素促進了總酸含量增加，總酯含量減少。因此，利用ICP-MS的檢測技術結合多種化學計量學分析方法能對不同貯存年份醬香型原酒進行有效的分類和鑒定，更加準確、高效地探究醬香型原酒貯存過程中金屬元素含量變化規律。