環嗪酮在藍莓上的殘留及其膳食風險評估

何紅梅，徐玲英，張昌朋，王祥云，蔣金花，李艷杰，趙學平

（省部共建農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，農業農村部農藥殘留檢測重點實驗室，浙江省農業科學院農產品質量安全與營養研究所，浙江 杭州 310021）

藍莓是杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，因其果實中富含花青素等營養保健功能成分，在全球種植廣泛，2020年總種植面積為20.567萬 hm2[1]；我國于2000年開始藍莓商業化生產，到2020年底，全國栽培面積為6.64萬 hm2[2]。雖然我國藍莓種植面積不小，但在藍莓生產上登記的農藥品種較少[3]。

環嗪酮是一種內吸選擇性、芽后觸殺性三氮苯酮類廣譜型除草劑，1974年由美國杜邦公司研發，能有效防除多種一年生和多年生雜草、一些矮灌木[4-5]。至今，環嗪酮已在森林、森林防火道、藍莓和甘蔗上登記[3]，但我國僅制定了環嗪酮在甘蔗上的最大殘留限量值（maximum residue limit，MRL），為0.5 mg/kg。僅美國、韓國和日本制定了環嗪酮在藍莓上的MRL，分別為0.6[6]、0.05 mg/kg[7]和0.2 mg/kg[8]。

目前，關于環嗪酮的相關文獻報道主要有對生態環境影響評價研究[5]、氣相色譜法分析原藥[9]、毒性研究[10]、合成述評[11]、土壤中降解研究[12-14]、水中降解研究[15]、環境污染風險研究[16]、殘留分析方法[4,17-21]和甘蔗上的殘留行為研究[18]。謝夢醒等[4]報道了高效液相色譜法測定甘蔗和土壤中環嗪酮殘留量，張丹華等[17]采用毛細管電泳法測定了紫薯中環嗪酮、嗪草酮和氰草津的殘留量，黃文源等[18]采用高效液相色譜-串聯質譜法研究了甘蔗和土壤中環嗪酮的殘留和消解動態。Bouchard等[19]報道了液相色譜法檢測土壤和水中環嗪酮殘留量。Kubilius等[20]采用毛細管電泳法測定了地表水中環嗪酮和其代謝物殘留。Yu Xinru等[21]報道了氣相色譜-串聯質譜法測定淡菜、扇貝（小）和小貝肉等貝殼類海鮮中的三嗪類除草劑殘留量。目前，鮮見關于環嗪酮在藍莓上的殘留行為和殘留分析方法報道，基于此，在浙江省、遼寧省、吉林省和北京市開展了75%環嗪酮水分散粒劑在藍莓上的殘留研究，建立了環嗪酮在藍莓上的殘留分析方法，并對4 地的最終殘留結果進行了膳食風險評估，旨在為環嗪酮使用安全性評價和中國在藍莓上制定MRL值提供參考資料和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ProElut十八烷基鍵合硅膠（C18）小柱（500 mg/6 mL）北京迪馬科技有限公司；鹽包（1.5 g NaCl+6 g無水硫酸鎂）島津上海實驗器材有限公司；Cleanert MAS-Q凈化管（乙二胺-N-丙基硅烷（primary second amine，PSA）50 mg+MgSO4150 mg+C1850 mg）天津博納艾杰爾科技有限公司；Waters BEHC18（1.7 μm，2.1×100 mm）和Waters HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）美國Waters公司。

75%（質量分數）環嗪酮水分散粒劑 江蘇禾裕泰化學有限公司；環嗪酮標準品（純度98.68%）德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）美國Fisher公司；甲酸（色譜純）美國ROE Scientific公司；飲用純凈水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司；其余有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UPLC XEVO TQ-XS液相色譜-串聯質譜聯用儀美國Waters公司；AB104-S電子天平 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；SE602F電子天平 奧豪斯常州儀器有限公司；NMSG-12多管旋渦混合器 泰州諾米醫療科技有限公司；3-18K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；TD5A-WS臺式大容量離心機 金壇市金南儀器制造有限公司；SI-A256渦旋儀 美國Scientific Industries公司；R6v.v.攪拌機 德國Robertcoupe s.n.c公司；BD/BC-720hcz冰柜 青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.3 方法

1.3.1 田間實驗

參照實驗準則[22]，2021年在浙江紹興、遼寧沈陽、吉林長春和北京懷柔區4 地開展了75%環嗪酮水分散粒劑在藍莓上的殘留實驗。

1.3.1.1 施藥

田間實驗在相鄰區域設1 個對照小區和1 個處理小區，并設置間隔區避免污染。處理小區施藥劑量為1800 g/hm2（制劑量160 g/畝），施藥1 次，施藥時期為雜草生長期，施藥方式為噴霧，藥后第90天和100天采集樣品；對照小區則噴施清水。

1.3.1.2 樣品采集及其制備

用隨機的方法在實驗小區內不少于12 個點或6 叢灌木采集藍莓，采集樣品至少1 kg，裝入樣本容器中包扎妥當，貼好標簽。每小區每次采集2 個樣品；第一次和最后一次采集處理小區樣品時，同時采集對照小區樣品，并按先對照小區后處理小區順序采樣；小區內距離兩端0.5 m內不采樣。

將藍莓樣品去除果柄后經攪拌機干冰制樣后得到實驗室樣品，用四分法分取150 g樣品兩份（正樣和備樣，一份用于檢測，一份用于備份），裝入封口樣品袋中，貼好標簽待測。

1.3.2 標準溶液配制

準確稱取環嗪酮標準品于容量瓶中，用甲醇配成標準儲備溶液。用體積分數50%甲醇溶液逐步稀釋得到0.0001、0.0005、0.001、0.002、0.005 mg/L和0.01 mg/L的環嗪酮溶劑標準工作溶液；同時用藍莓基質空白溶液配制同系列質量濃度的基質標準工作溶液。

1.3.3 樣品檢測

1.3.3.1 樣品前處理

于50 mL離心管中稱取10 g藍莓樣品（精確到0.01g），然后加入5 mL水和10 mL乙腈，渦旋提取3 min，再加入鹽包（1.5 g NaCl+6 g無水硫酸鎂），渦旋混勻1 min，離心3 min（4000 r/min），取上清液1.5 mL至Cleanert MAS-Q凈化小管（PSA 50 mg+MgSO4150 mg+C1850 mg），渦旋混勻30 s，離心3 min（10000 r/min），取上清液0.7 mL與0.7 mL水混勻后過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.3.3.2 樣品檢測條件

液相色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進樣體積為1.0 μL；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min。流動相：A相為甲醇，B相為體積分數0.1%甲酸溶液。采用梯度洗脫程序：0～2 min，60%～90% A、40%～10% B；2～4 min，90% A、10% B；4.0～4.5 min，90%～60% A、10%～40% B；4.5～5.0 min，60% A、40% B。

質譜條件：電噴霧電離源，采用多反應監測。毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為30V，脫溶劑溫度為400 ℃，脫溶劑氣流量為800 L/h。環嗪酮定性、定量（*）離子對分別為253.1/171.1*、253.1/71.0。

1.3.4 添加回收實驗

在空白的藍莓中分別添加0.01、0.1、1.0 mg/kg 3 個環嗪酮添加量，每個水平做5 個平行。按照1.3.3節的方法進行檢測。

1.3.5 貯藏穩定性實驗

1.3.5.1 提取凈化液冷藏實驗

將2 個1.0 mg/kg的添加回收樣品經前處理后獲得待檢提取凈化液，放置于冰箱內冷藏。分別于0 d和貯藏3、7、15 d取出檢測。

1.3.5.2 樣品冷凍貯藏實驗

稱取藍莓空白樣品10 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，共20 個。其中4 個作為空白樣品，8 個經添加標樣后作為質量控制樣品，8 個經添加標樣后作為貯藏實驗樣品，添加量為1.00 mg/kg。樣品采集間隔為0、30、55 d和89 d。

1.3.6 膳食風險評估

環嗪酮國家估算每日攝入量（national estimated daily intake，NEDI）按公式（1）計算[23-25]：

式中：STMRi為環嗪酮在中國登記作物上的規范殘留實驗中值/（mg/kg）；對于沒有殘留實驗中值的登記作物，選用相應的MRL值計算，如果中國沒有MRL，可選取國際食品法典委員會、美國、澳大利亞等制定MRL值進行計算；Fi為中國一般人群的人均食品消費量[26]/kg。

環嗪酮的膳食攝入風險與NEDI和每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）以及人均體質量有關，用風險熵（risk quotient，RQ）表示，按公式（2）計算。如果RQ小于100%，則膳食風險可以接受，大于100%則表示膳食風險不可接受，數值越大風險越大[23-25]。

式中：ADI為每日允許攝入量/（mg/kgmb）；m為中國消費者的平均體質量（63 kg）[26]。

1.4 數據處理

數據采用Excel進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 檢測方法建立

2.1.1 色譜和質譜條件優化

首先在電噴霧電離正離子模式下，對環嗪酮進行母離子、子離子和碰撞能量的確定，然后在含甲酸的甲醇水流動相體系下比較環嗪酮在Waters BEH C18和Waters HSS T3色譜柱上的色譜保留行為。實驗結果表明：1）發現環嗪酮有3 個碎片離子，分別是m/z71、85.1和171.1，其中m/z171.1（100%）豐度最高，然后是m/z71（40%）、85.1（24%），實驗選取m/z71和m/z171.1碎片離子用于定性、定量分析，與文獻報道[13]監測子離子（m/z171.3和m/z85.4）不完全一致。2）在相同流動相條件下，雖然環嗪酮在HSS T3的保留（2.78 min）比在BEH C18的保留（2.28 min）強，但環嗪酮在這2 款色譜柱上均能獲得較好的峰型和靈敏度，最終，實驗選取通用性BEH C18用于樣品分析。

2.1.2 前處理方法選擇

目前已報道的食品中環嗪酮的前處理方法主要有三氯甲烷提取后經中性氧化鋁玻璃層析柱凈化[4]、QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged and safe）凈化法（PSA和石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）為吸附劑）[17]、QuEChERS凈化法（C18為吸附劑）[18]、改進QuEChERS凈化法（分子印跡聚合物和PSA為吸附劑）[21]等。QuEChERS前處理方法因其快速、簡單、環保等特點被廣泛應用于食品領域農藥殘留檢測，本實驗也采用了QuEChERS前處理方法，選取PSA和C18作為吸附劑，獲得了較好的實驗結果。

2.1.3 標準曲線及基質效應考察

通過比較基質標準曲線和溶劑標準曲線的斜率可獲得基質效應，具體計算見式（3），當基質效應絕對值少于20%時說明基質效應不顯著，計算時可采用溶劑標樣[27-28]。以環嗪酮質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標制作標準曲線；環嗪酮在0.0001～0.01 mg/L范圍內，溶劑和基質標準曲線方程分別為y＝109182887.5115x+960.3265（R2＝0.9998）和y＝100826667.1258x+1165.2208（R2＝0.9997），基質效應為-7.7%，說明線性良好，基質效應不顯著。

式中：A為基質匹配標準曲線的斜率；B為溶劑標準曲線的斜率。

2.1.4 回收率、定量限和檢出限

藍莓中環嗪酮添加量（0.01、0.1 mg/kg和1.0 mg/kg）的回收率結果見表1，代表性添加回收色譜圖見圖1A～C。從表1可見，3 個添加水平的平均回收率為87%～91%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.7%～3.7%，結果均滿足殘留分析要求，可將該方法應用于實際樣品中環嗪酮殘留量的分析檢測。根據最低添加濃度確定方法的定量限，環嗪酮在藍莓中定量限為0.01 mg/kg。根據3 倍信噪比確定方法檢出限，方法檢出限為2.6×10-6mg/L。

圖1 環嗪酮標準品、藍莓果實添加回收和殘留樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of hexazinone standard,hexazinone spiked and residue samples in blueberry fruit

表1 環嗪酮在藍莓中的回收率（n ＝5）Table 1 Recovery rates of hexazinone in blueberry fruit (n=5)

2.2 樣品貯藏穩定性

2.2.1 提取凈化液冷藏穩定性

2 個1.0 mg/kg的環嗪酮藍莓添加回收樣品的初始含量分別為0.830 mg/kg和0.858 mg/kg，提取凈化液在-0.5～7.7 ℃的冰箱中貯藏3、7 d和15 d后取出測定，結果分別為：1）貯藏3 d后環嗪酮含量分別為0.853 mg/kg和0.932 mg/kg，降解率分別為-2.8%和-8.6%；2）貯藏7 d后環嗪酮含量分別為0.899 mg/kg和0.964 mg/kg，降解率分別為-8.3%和-12%；3）貯藏15 d后環嗪酮含量分別為0.864 mg/kg和0.896 mg/kg，降解率分別為-4.1%和-4.4%。結果表明，冷藏條件下，環嗪酮在樣品提取凈化液中貯藏15 d內穩定。

2.2.2 樣品冷凍貯藏穩定性

藍莓冷凍實驗結果見表2，環嗪酮的平均初始含量為0.948 mg/kg，貯藏30、55 d和89 d的平均含量分別為0.943、0.981 mg/kg和0.950 mg/kg，平均降解率分別為0.55%、-3.40%和-0.20%；4 次質量控制樣品的平均回收率為94%～107%，說明實驗有效。冷凍貯藏期內，冰柜溫度為-23.9 ℃～-18.0 ℃，平均溫度為-20.1 ℃，環嗪酮的降解率均小于30%，說明冷凍貯藏條件下，環嗪酮在藍莓中貯藏89 d內穩定。代表性冷凍貯藏樣品色譜圖見圖1D。

表2 環嗪酮在藍莓中的冷凍貯藏穩定性Table 2 Frozen storage stability of hexazinone in blueberry fruit

2.3 最終殘留量測定結果

2021 年在浙江、北京、遼寧、吉林4 地，以1800 g/hm2的施藥劑量在藍莓園進行雜草定向莖葉噴施75%環嗪酮水分散粒劑1 次，于施藥后90 d和100 d采樣測定藍莓中環嗪酮殘留量。

施藥后90 d和100 d，4 地的藍莓樣品中環嗪酮殘留量均低于0.01 mg/kg，均低于美國、日本和韓國制定的MRL（分別為0.6、0.2 mg/kg和0.05 mg/kg）[6-8]。最終殘留樣品測定時進行4 次重復添加量為0.01 mg/kg的質量控制樣品分析，回收率為95%～103%，RSD為4.4%；所有殘留樣品均在冷凍貯藏穩定期89 d內完成殘留樣品提取和凈化，且樣品提取凈化液均在15 d內完成儀器測定，故實驗結果可靠。環嗪酮雖然具有內吸性，但通過最終殘留實驗結果可見其在藍莓果實中的殘留量極低，發生食品安全風險可能性很小。最終殘留實驗結果見表3，代表性最終殘留樣品色譜圖見圖1E。

表3 環嗪酮在4 個實驗點藍莓樣品中的最終殘留量（n＝2）Table 3 Final residues of hexazinone in blueberry samples from four test sites (n=2)

2.4 膳食風險評估

環嗪酮在我國僅在甘蔗和藍莓2 種可食作物上獲得登記[3]，GB 2763—2021《食品中農藥最大殘留限量》規定環嗪酮的殘留物為環嗪酮，ADI值為0.05 mg/kgmb，在甘蔗上的MRL值為0.5 mg/kg[29]。根據環嗪酮在我國登記作物和MRL制定情況，以及本實驗獲得的環嗪酮在藍莓上的規范殘留實驗中值（0.01 mg/kg），并依據衛健委2002年發布的《中國不同人群消費膳食分組食譜》中的膳食結構數據，計算普通人群環嗪酮在甘蔗和藍莓上的NEDI分別為0.0022、0.000457 mg，環嗪酮的RQ為0.084%，表明膳食攝入風險小，具體計算相關信息見表4。

表4 甘蔗和藍莓樣品中環嗪酮膳食風險評估Table 4 Dietary risk assessment of hexazinone in sugarcane and blueberry samples

3 結論

樣品采用QuEChERS前處理方法，選取PSA和C18作為凈化材料，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定藍莓中環嗪酮殘留量的方法，結果表明方法快速、準確、穩定、無顯著基質效應。

最終殘留結果顯示，采用質量分數為75%環嗪酮水分散粒劑按有效成分1800 g/hm2施藥劑量施藥1 次，4 個實驗點的藍莓樣品中環嗪酮殘留量均低于0.01 mg/kg，最終殘留實驗結果可以為中國制定藍莓中環嗪酮的MRL值提供數據支持。此外，根據最終殘留實驗數據進行了甘蔗和藍莓樣品中環嗪酮的膳食風險評估，RQ為0.084%，結果表明風險很小。因此，在藍莓園使用質量分數為75%環嗪酮水分散粒劑時，建議最高施藥劑量為1800 g/hm2，施藥次數為1 次，安全間隔期為90 d。在藍莓園合理使用75%環嗪酮水分散粒劑，發生藍莓食品中環嗪酮殘留安全風險可能性不大。