4 種植物源性成分多重real-time PCR檢測方法的建立及其在食用淀粉中的應用

范 維，高曉月，董雨馨，劉虹宇，李賀楠，趙文濤，郭文萍

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，北京 100068）

淀粉一直是人們日常飲食中較為常見的食品。現階段的淀粉已經不局限于為人們日常烹飪所用，更是作為一種工業原料在食品生產、化學化工領域得以廣泛使用[1-2]。目前，主要的淀粉種類有紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉等[3]。由于各類淀粉原料成本和加工工藝不同[4-5]，使其在價格上存在明顯差異，加之不同淀粉顆粒的感官性狀，物化指標較為相近，消費者很難辨識，這就導致淀粉及其制品中蓄意摻假的行為越發嚴重[6-7]。這不僅給消費者帶來利益損失、干擾食品行業有序發展，更有甚者可引起食品安全問題[8]。近些年，我國深化改革，大力加強食品安全監管和檢測技術支撐能力建設，并于2022年發布了《“十四五”推動高質量發展的國家標準體系建設規劃》，力求通過落實“四個最嚴”要求，切實保障群眾“舌尖上的安全”。但是，目前針對淀粉中植物源性成分鑒定，我國尚無現行有效的標準方法，存在標準留白的情況。因此，亟需建立一種準確可靠、高通量，且便于推廣使用的淀粉種類摻假鑒別方法，為我國標準體系進一步完善添磚加瓦。

目前，國內外對于淀粉種類摻假鑒別檢測方法的研究主要集中在近紅外光譜[9-10]、掃描電鏡[11-12]、高光譜成像[13-14]、傅里葉變換紅外光譜[15-16]等方法。如Khamsopha[17]利用近紅外高光譜成像技術對木薯淀粉中常見的摻假成分進行鑒定；常云彩等[18]利用掃描電鏡對常見的19 種食用淀粉顆粒結構、基本特性以及摻假檢測方法進行了研究。這些方法主要是通過淀粉顆粒的性狀（如形態、結構等）來鑒別不同的淀粉，但在實際應用中易受到品種、產地、加工方式的影響，也存在依賴昂貴儀器設備、需建立復雜數學模型、對人員技術要求高等問題[19-21]。相較之下，多重實時聚合酶鏈式反應（realtime polymerase chain reaction，real-time PCR）技術是通過分析物種基因水平上的差異鑒定其真實屬性，具有高通量，結果準確、可靠，不易受加工工藝和環境等因素影響，儀器普及率高等優勢[22]，可作為一種有效的淀粉種類高通量鑒別標準方法在監管部門、中小型企業及一般檢測實驗室得到推廣使用。

當前，采用real-time PCR技術對淀粉中植物源性成分進行鑒定的研究多集中在單重成分鑒定方面，如韓建勛等[23]建立了一種可快速檢測食用淀粉中木薯成分的real-time PCR法；姚曉靜等[24]利用real-time PCR技術對復配粉中馬鈴薯成分進行了鑒定。對于利用多重TaqMan探針real-time PCR技術同時檢測木薯、紅薯、馬鈴薯、玉米源性成分的研究較少。因此，本研究旨在建立一種高通量、快速、準確的木薯、紅薯、馬鈴薯、玉米源性成分多重TaqMan探針real-time PCR方法，使其可以應用于市場上可食用淀粉及其制品的種類摻假鑒別，彌補目前標準中的空缺，以期為監管部門開展食品安全摻假鑒別風險監測提供強有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于對照或模擬樣品制備的27 種原料及原料制成的淀粉由北京市食品質量監督檢驗三站提供，均為單一成分，包括：紅薯（煙薯25、普薯32、北京553）、木薯（面包木薯、華南9號、華南6068）、馬鈴薯（中薯5號、華薯1號、晉薯2號）、玉米（農華101、登海618、京科968）、小麥、大麥、黑麥、蕎麥、大米、薏米、小米、芋頭、山藥、燕麥、蓮藕、綠豆、紅豆、黃豆、豌豆及其淀粉。用于實際樣品測定的50 份淀粉購自北京農貿市場或超市。

深加工食品DNA提取試劑盒、多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）天根生化科技（北京）有限公司；2×PCR Premix ExTaqTM大連寶生物科技有限公司；引物、探針合成 北京華大基因科技有限公司；試劑盒A：植物定性檢測紅薯源性成分核酸檢測試劑盒、試劑盒C：摻假摻雜木薯源性成分檢測試劑盒 廣州雙螺旋基因技術有限公司；試劑盒B：紅薯源性成分檢測PCR試劑盒 上海雅吉生物科技有限公司；試劑盒D：木薯源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒 上海聯邁生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

FTC-3000P型實時熒光PCR儀 加拿大Funglyn公司；微量核酸分析測定儀 美國BioTek公司；3-30K臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；DK-80恒溫金屬浴 上海一恒儀器有限公司；Thermostat plus振蕩器賽默飛世爾科技有限公司；ZK系列小型高速萬能粉碎機上海達平儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物與TaqMan探針設計

從GenBank上查找并下載紅薯g3pdh基因（GenBank.EF119215）、木薯g3pdh基因（GenBank.MK129037）、馬鈴薯UGPase基因（GenBank.U20345）、玉米zSSIIb基因（GenBank.AF019297）序列，參考近年文獻發表的相關序列，使用SnapGene軟件進行序列比對，篩選出種內保守、種間差異性區域片段，使用Primer Express和Primer Premier 5.0軟件設計引物探針，再通過SnapGene軟件檢測引物和探針的可行性，具體序列見表1。植物內參照引物及探針來自文獻[25]。

表1 實驗所用引物及TaqMan探針序列Table 1 Primer and TaqMan probe sequences used in this study

1.3.2 樣品前處理

鮮原料樣品：去皮后用自來水進行簡單沖洗，清洗掉樣品表面可能沾染的其他源性組織或細胞。取原料內部組織，用清洗干凈的剪刀、高速粉碎機等將其研磨成糜（或粉）狀。

淀粉樣品：充分混勻后進行取樣。不同源性的樣品使用不同的器具，防止交叉污染。

1.3.3 DNA提取方法選擇

鮮原料樣品：按照植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書進行提取并測定DNA純度。

淀粉樣品：分別用深加工食品DNA提取試劑盒、多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）對1.0 g淀粉進行提取，并用微量核酸分析測定儀進行DNA質量評估，選出最適的淀粉樣品DNA提取方法。

DNA的OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間、OD260nm/OD230nm在2.0～2.4之間，可用于DNA擴增。將提取出的樣品和對照DNA均稀釋成30 ng/μL，作為擴增模板，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.4 多重real-time PCR體系及擴增條件優化

多重反應體系為50 μ L：25 μ L 2×P C R Premix ExTaqTM；紅薯、馬鈴薯、木薯、玉米探針（10 μmol/L）加入量在0.4、0.6、0.8、1.0 μL 4 個梯度內調整；上、下游引物（10 μmol/L）加入量在0.6、0.8、1.0 μL 3 個梯度內調整；DNA模板2.0 μL；根據引物探針加入量補水至50 μL。依據控制變量法則，每次試驗只設一個變量，以擴增效率、特異性、靈敏度為考察依據，確定最佳多重反應體系參數。

內參基因反應體系為50 μ L：25 μ L 2×P C R Premix ExTaqTM；探針（10 μmol/L）1 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL；DNA模板2.0 μL，補水至50 μL。

擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火60 s，40 個循環，在每個循環退火階段收集熒光信號。

1.3.5 多重real-time PCR特異性及包容性實驗

提取12 種目標原料（不同品種）和15 種非目標原料的DNA，并以此為模板，進行紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米源性成分的多重real-time PCR擴增，驗證本方法的特異性及包容性。

1.3.6 多重real-time PCR靈敏度實驗

分別將4 種鮮原料提取出的DNA用TE緩沖溶液進行10 倍系列梯度稀釋至3×10-3ng/μL，取同等稀釋水平的4 種DNA按等體積進行混合，以各稀釋度混合后的DNA為模板進行多重real-time PCR擴增，各稀釋度進行3 次平行，同時進行陰性和空白對照實驗。以質量濃度的對數為橫坐標，Ct值為縱坐標制作標準曲線，并按下式計算擴增效率，以此考察該方法的DNA靈敏度。

1.3.7 多重real-time PCR檢出限實驗

1.3.7.1 不同摻入比例模擬樣品制備

以紅薯淀粉為本源，按5 個不同的質量比（0.01%、0.1%、1%、10%、100%），分別向其中摻入木薯淀粉、馬鈴薯淀粉和玉米淀粉。不同紅薯淀粉摻入比例模擬樣品以小麥淀粉為本源。參照Chen Xiaoyu等[26]的方法進行不同比例模擬樣品的制備：使用高速破碎機將1 g木薯淀粉與9 g紅薯淀粉間歇性混合6 min，得到木薯淀粉添加量為10%的樣品（編碼為A1）；從A1樣品中取出1 g與9 g紅薯淀粉間歇性混合6 min，得到木薯淀粉添加量為1%的樣品（編碼為A2）；從A2樣品中取出1 g與9 g紅薯淀粉間歇性混合6 min，得到木薯淀粉添加量為0.1%的樣品（編碼為A3），同樣方法依次制備0.01%樣品以及其他源性混合樣品。每個樣品中兩種淀粉的總質量為10 g，每組混合樣品設10 個平行。

1.3.7.2 檢出限測定

取不同摻入比例混合后的淀粉樣品各1.0 g進行DNA提取，并采用本實驗建立的多重real-time PCR方法進行檢測。根據≥95%置信水平法則[26]，在10 次平行實驗中，10 次結果均為檢出的最低目標源性摻入量即為該目標源性的檢出限。

1.3.8 實際樣品檢測

從農貿市場或超市購買淀粉樣品共計50 份，包括紅薯淀粉20 份（編號1～20）、木薯淀粉10份（編號21～30）、馬鈴薯淀粉10 份（編號31～40）、玉米淀粉10 份（編號41～50）。取混勻后的各樣品1.0 g進行DNA提取，之后采用建立的多重real-time PCR方法對紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米源性成分進行檢測。同時用標準方法SN/T 1198—2013《轉基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》[27]和SN/T 1196—2018《轉基因成分檢測 玉米檢測方法》[28]進行馬鈴薯和玉米源性結果驗證；采用試劑盒A和試劑盒B進行紅薯源性結果驗證；采用試劑盒C和試劑盒D進行木薯源性結果驗證。

1.3.9 結果判定

內參對照、陽性對照：熒光通道有熒光信號檢出，且出現典型的擴增曲線，Ct值≤35.0；空白對照、陰性對照：熒光通道無熒光信號檢出，相應Ct值＞40.0；樣品判定：熒光通道有熒光信號檢出，相應Ct值≤40.0，判定為陽性；熒光通道無熒光信號檢出，相應Ct值＞40.0，判定為陰性。

1.4 數據統計

2 結果與分析

2.1 引物、TaqMan探針設計結果

使用SnapGene軟件對紅薯g3pdh基因（GenBank.EF119215）、木薯g3pdh基因（GenBank.MK129037）、馬鈴薯UGPase基因（GenBank.U20345）、玉米zSSIIb基因（GenBank.AF019297）序列進行比對，并將設計的引物、探針導入軟件中，對其可行性進行分析，結果見圖1。所設計的4 組引物、探針均可以在各自對應的靶基因序列中搜索到，且均在序列差異性區域內。說明4 組引物探針可以用于紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米4 種目標源性的特異性檢測。

圖1 引物、TaqMan探針可行性分析Fig.1 Feasibility analysis of primers and TaqMan probes

2.2 DNA提取方法選擇結果

淀粉樣品本身含有大量蛋白質、多糖等成分，且屬于經過粉碎、精制、干燥等加工過程的深加工食品[24]，因而在DNA提取方面存在難度。為獲得高質量的模板DNA，本實驗分別采用3 種試劑盒對其進行提取，并對提取出的DNA質量進行評估。由表2可知，采用深加工食品DNA提取試劑盒（試劑盒A）提取的DNA，其純度（OD260nm/OD280nm及OD260nm/OD230nm）滿足real-time PCR方法對于模板DNA的要求，且在相同取樣量的條件下，試劑盒A提取出的DNA質量濃度更高。

表2 不同DNA提取試劑盒提取效果對比Table 2 Comparison of efficiencies of different DNA extraction kits

綜上，選擇深加工食品DNA提取試劑盒（試劑盒A）進行淀粉樣品的DNA提取。

2.3 多重real-time PCR體系優化結果

以最高擴增效率、對非目標源性無交叉反應、高靈敏度為考察依據，對引物探針加入量進行了篩選和優化，確定最佳多重real-time PCR反應體系為：25 μL 2×PCR Premix ExTaqTM；紅薯、馬鈴薯、木薯探針（10 μmol/L）各0.8 μL，玉米探針（10 μmol/L）1.0 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL；DNA模板2.0 μL，補水至50 μL。

2.4 多重real-time PCR特異性及包容性實驗結果

通過12 種目標源性和15 種非目標源性的多重realtime PCR檢測結果發現（表3、圖2），本實驗開發的方法對常見的紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米品種均可檢出，且當添加的DNA模板初始質量濃度為30 ng/μL時，非特異性信號Ct值均大于40.0。由此可知，建立的四重體系具有較好包容性，且對非目標源性無交叉反應。

圖2 引物、TaqMan探針特異性效果分析Fig.2 Specificity analysis of primers and TaqMan probes

表3 方法特異性及包容性實驗結果Table 3 Specificity and inclusiveness of the proposed method

2.5 多重real-time PCR靈敏度實驗結果

按1.3.6節方法進行標準曲線繪制，結果如圖3所示。4 種源性DNA在質量濃度范圍3×101～3×10-3ng/μL內具有良好的線性相關性。紅薯源性標準曲線為y＝-3.063x+27.695，R2＝0.9914，擴增效率＝108.9%；木薯源性標準曲線為y＝-3.0426x+27.772，R2＝0.9956，擴增效率＝110.2%；馬鈴薯源性標準曲線為y＝-3.2423x+23.047，R2＝0.9987，擴增效率＝99.5%；玉米源性標準曲線為y＝-3.0013x+28.947，R2＝0.9964，擴增效率＝113.7%。由此可知，本實驗開發的多重real-time PCR方法對目標DNA的檢測靈敏度可達3×10-3ng/μL，高于韓建勛等[29]的研究。而當模板DNA質量濃度低于該質量濃度時，仍有擴增，但不呈線性關系，且重復性和準確性差。

圖3 4 種目標源性擴增曲線及標準曲線圖Fig.3 Amplification curves and standard curves for four target plant sources

2.6 多重real-time PCR檢出限實驗結果

從表4可知，當摻入比例≥0.1%時，4 種目標源性10 次平行實驗的檢出次數均可以達到10 次，滿足不小于95%置信區間的測試要求，表明該摻入比例可以檢出且實驗的重復性較好；而當摻入比例為0.01%時，紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米源性的檢出次數分別為8、7、9、7 次，存在未檢出的情況，若以0.01%摻入量作為方法的檢出限，會造成假陰性結果的產生。綜上，為了確保使用本方法進行淀粉樣品檢測時的準確性，現規定本方法對于淀粉樣品的檢出限為0.1%。該檢出限低于姚曉靜等[24]研究的2%及韓建勛[29]、Wang Deguo[30]等研究的1%。

表4 不同源性多重real-time PCR樣品檢出限結果Table 4 Detection limits of the multiple real-time PCR for four adulterated plant sources

2.7 實際樣品檢測結果

采用本實驗建立的多重real-time PCR方法與參比方法同時對50 份實際樣品中的紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米源性成分進行檢測。其中馬鈴薯和玉米源性分別采用標準方法SN/T 1198—2013[27]和SN/T 1196—2018[28]作為參比方法；由于紅薯和木薯源性沒有對應的標準方法，因此采用市售的2 種不同品牌的試劑盒作為參比方法。從表5可知，本方法與參比方法結果一致，均有7 個淀粉樣品檢出含有與標簽成分不符的其他源性成分，不合格率為14%（7/50）。7 個不合格樣品包括5 個紅薯淀粉和2 個馬鈴薯淀粉。其中5 個不合格紅薯淀粉中有2 個只檢出了木薯源性，1 個只檢出馬鈴薯源性，2 個既檢出紅薯又檢出木薯源性；2 個不合格馬鈴薯淀粉中有1 個只檢出木薯源性，1 個既檢出馬鈴薯又檢出木薯源性。綜上可知，兩種方法的檢測結果一致，說明所建方法結果準確可靠；同時，檢測4 種目標源性成分所用的時間僅為參比方法的1/4，且檢測成本遠低于試劑盒法。因此，所建方法可作為一種有效技術手段用于市售淀粉的種類摻假鑒別檢測。此外，通過不合格樣品檢測結果還發現，用木薯淀粉代替或將木薯淀粉摻入到紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉中是目前主要的摻假手段。

表5 實際樣品中不合格樣品的PCR檢測結果Table 5 Results of detection of unqualified samples by the PCR method

3 結論

本研究通過篩選靶基因、對比目標區域片段、設計特異性引物探針，建立了一種可同時對紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米源性成分進行檢測的四重TaqMan探針real-time PCR方法，實現同一體系同時擴增4 種目標源性，達到了縮短檢測時間、提高檢測效率的目的。考慮到淀粉是一類深加工食品，本研究選取的目標序列均小于150 bp，可以有效防止因DNA降解造成的假陰性結果[31]。同時，還充分考慮了不同DNA提取試劑盒對淀粉樣品DNA提取質量的影響，為該方法的應用范圍從鮮原料進一步擴展到深加工淀粉制品提供研究基礎。本方法具有較強的特異性和包容性，對于常見的目標源性品種均可檢出，且與15 種非目標源性均無交叉反應。此外，本方法還具有較高的靈敏度，可檢測到質量濃度為3×10-3ng/μL的模板DNA，且對于淀粉樣品的檢出限可達0.1%，滿足目前各標準中對4 種目標源性檢出限的要求。用該方法對50 份實際淀粉樣品進行檢測，結果均與參比方法一致，而用時僅為參比方法的1/4，且檢測成本遠低于試劑盒方法。綜上，本研究建立的四重TaqMan探針real-time PCR方法可以作為一種有效的檢測手段，應用于市場上淀粉種類的真偽性鑒別，為完善標準體系建設、打擊非法摻假欺詐、規范市場秩序和保障人民食品安全提供技術支持。