火雞源性成分實時聚合酶鏈式反應檢測方法ISO標準研制

潘良文，寧 雪，王 強，蔡一村，許鎮堅，張 晨

（上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135）

肉類摻假是影響食品安全的一個重要方面。一些不法企業和商人經常將低價肉類原料摻入到高價肉制品中以牟取暴利，侵害消費者權益，擾亂市場秩序。肉及肉制品真偽鑒別主要是基于DNA序列的分子生物學檢測技術，如普通聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、實時PCR（real-time PCR）、數字PCR和DNA條形碼等。我國現行的動物源性成分鑒定標準繁多（國家標準、行業標準、地方標準、企業標準等），各種鑒定方法和標準不能有效統一。表1是我國現行有效的主要動物成分檢測標準，這些標準還不包括一些地方標準。

表1 我國現行有效的部分主要動物成分檢測標準Table 1 China’s current standards for detection of main animalderived materials

國內的動物成分檢測標準不統一，國際上此前也沒有統一的檢測標準。為保證動物源性制品國際國內貿易的順利進行，需要建立統一的國際標準。為此，上海海關向國際標準化組織（International Organization for Standardization，ISO）申請立項建立動物成分檢測的ISO標準，ISO組織專門設立了一個工作組（食品技術委員會/分子生物標記/肉類物種鑒別工作組（ISO/TC34/SC16/WG8））。通過研究，ISO組織于2020年7月發布了由上海海關主持制定的食品和飼料中牛、綿羊、豬、雞、山羊、馬、驢等動物成分檢測的ISO標準：ISO/TS 20224-1:2020[23]、ISO/TS 20224-2:2020[24]、ISO/TS 20224-3:2020[25]、ISO/TS 20224-4:2020[26]、ISO/TS 20224-5:2020[27]、ISO/TS 20224-6:2020[28]、ISO/TS 20224-7:2020[29]。

火雞是一種用作食品原料的重要禽類，與其他肉類相比蛋白質含量較高，脂肪含量和膽固醇的含量較低。火雞肉價格較高，在加工食品中，容易被雞、鴨等價格較低的肉類混雜假冒，也容易被混雜假冒其他價格較高的肉類，如牛、羊肉，因此有必要建立火雞成分的檢測方法。

在國外，Martín等[30]利用12S rRNA線粒體基因、Kesmen等[31]利用線粒體NADH脫氫酶亞基2基因、Pegels等[32]利用線粒體DNA控制區和12S rRNA基因區域的特異性序列建立了火雞成分的real-time PCR檢測方法，Shehata等[33]基于線粒體DNA序列建立了微粒式數字PCR定量檢測方法；在國內，張舒亞等[34]利用線粒體12S rRNA基因建立了火雞成分的real-time PCR檢測方法，李偉琦等[35]利用TGF-β3基因序列建立了適用于微滴式數字PCR和芯片式數字PCR平臺的火雞成分的定量檢測方法。

real-time PCR法具有特異性強、靈敏度高、成本低、操作簡便等優點，到目前為止，該方法在日常檢測中一直是檢測動物成分的最常用的方法。在本研究完成之前，國際上沒有一個統一的火雞成分檢測的國際標準。本研究選擇火雞染色體Z DNA序列的單拷貝的保守性的特異片段作為檢測靶序列，建立了real-time PCR檢測方法，完成國際協同實驗，驗證了方法的假陽性率、假陰性率、絕對檢測限和檢出概率（probability of detection，POD），制訂出火雞成分檢測的ISO標準（ISO/TS 20224-8:2022）[36]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

家火雞（Meleagris gallopavo domesticus）品種尼古拉、青銅、貝蒂娜，由山東嘉祥征博特種動物養殖場提供；家火雞品種荷蘭白、黑火雞、石板青、波朋、眼斑火雞（Meleagris ocellata）肉，由美國佛羅里達愛立生家庭農場提供；歐洲家鵝（Anser anser domesticus）、中國家鵝（Anser cygnoides domesticus）、綠頭鴨（Anas platyrhynchos）DNA，由揚州大學提供；印度瘤牛（Bos indicus）、牦牛（Bos mutus）、普通牛（Bos taurus）、水牛（Bubalus bubalis）血液，由云南省草地動物科學研究院提供；美洲野牛DNA，由美國國家野生動物研究中心提供；金魚（Carassius auratus）、番鴨（Cairina moschata）、駱駝（Camelus bactrianus）、狗（Canis familiaris）、山羊（Capra hircus）、麋鹿（Cervus canadensis）、鴿（Columba livia）、鵪鶉（Coturnix coturnix）、鯉魚（Cyprinus carpio）、驢（Equus asinus）、馬（Equus caballus）、驢（Equus caballus×asinus）、貓（Felis catus）、雞（Gallus gallus）、恒河猴（Macaca mulatta）、小鼠（Mus musculus）、鱒魚（Onchorhynchus mmaykiss）、兔子（Oryctolagus cuniculus）、綿羊（Ovis aries）、野雞（Phasianus colchicus）、大鼠（Rattus norvegicus）、鴕鳥（Struthio camelus）、豬（Sus scrofa domesticus）；油菜籽（Brassica rapa）、大豆（Glycine max）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays），來自本單位收集的樣本。

通過NCBI中BLAST功能進行序列對比分析，選擇火雞染色體Z DNA序列的物種特異性單拷貝片段作為檢測靶序列，其位置信息見表2。利用Primer Express 3.0軟件設計出real-time PCR檢測的引物和探針，序列信息見表3，引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 檢測靶序列位置信息Table 2 Location information of detection target sequence

表3 本實驗所用的引物和探針序列Table 3 Sequences of primers and probes used in this study

real-time PCR試劑2×PCR Master Mix預混液（貨號：4369016）美國Thermo Fisher Scientific公司；普通PCR試劑2×PCR Master Mix預混液（貨號：B639295）生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA分子質量標記DL2000（貨號：3427A）寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

SPEX 6850型冷凍碾磨機 美國SPEX SamplePrep公司；QX100微粒式數字PCR儀 美國Bio-Rad公司；ABI ViiA7 real-time PCR儀、NanoDrop 2000微量核酸蛋白測定儀 美國賽默飛世爾科技公司；5425小型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；UFE500AO型烘箱德國Memeert公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理和核酸提取

樣品碾磨：對于肉類產品，先切碎，然后在烘箱80 ℃干燥72 h，再使用冷凍碾磨機粉碎成超細粉末。

核酸提取：使用天根生化科技（北京）有限公司生產的基因組DNA提取試劑盒（DP305）對各類動植物樣品提取，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 質粒構建

將火雞的特異性擴增片段（基因序列號NC_015041.2中57643369～57643486 bp之間118 bp的片段）與pUC57載體進行連接，得到質粒pUC57-t，轉化培養。質粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并提取質粒DNA，用于驗證所建立real-time PCR方法的絕對檢測限。

1.3.3 real-time PCR反應體系和循環程序

反應體系：25 μL反應體系，每條引物（10 μmol/L）1 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，實時熒光2×PCR Master Mix（Thermo Fisher）12.5 μL，無核酸酶和蛋白酶的重蒸水5 μL，樣品或質粒DNA 5 μL（基因組DNA質量濃度為20～200 ng/μL，質粒濃度分別為：4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.02 拷貝/μL）。循環程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，45 個循環。

1.3.4 普通PCR反應體系、循環程序和電泳條件

反應體系：25 μL反應體系，每條引物（10 μmol/L）1 μL，2×PCR Master Mix（生工生物工程（上海）股份有限公司）12.5 μL，無核酸酶和蛋白酶的重蒸水5 μL，樣品DNA 5 μL（基因組DNA質量濃度為20～200 ng/μL）。循環程序：預變性94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，45 個循環；72 ℃延伸10 min。電泳條件：220 V、20 min。

1.3.5 特異性測試

利用各種動植物的DNA樣本，按照1.3.3節realtime PCR反應體系和循環程序進行檢測。按照1.3.4節普通PCR反應體系、循環程序和電泳條件，反應體系只加引物不加探針，進行定性PCR測試，并對PCR產物進行測序確證。

1.3.6 測試

利用數字PCR技術對含有火雞特異擴增片段的質粒pUC57-t拷貝數進行精確定量檢測，準確稀釋到1000 拷貝/μL。將定量后的樣品DNA稀釋至7 個濃度，分別為4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.02 拷貝/μL，每個PCR反應加入5 μL模板，含有靶序列的質粒拷貝數分別為20、10、5、2、1、0.5、0.1 拷貝。

1.3.7 real-time PCR結果判定

當陽性對照出現擴增、陰性對照和空白對照未出現擴增時，若待測樣品出現S型的擴增曲線，并且產生Ct值時，則樣品被判定為陽性；若待測樣品未出現S型的擴增曲線時，則被判定為陰性。

1.3.8 國際協同實驗

檢測方法要上升為ISO 標準，需要組織國際協同實驗完成對所建立的檢測方法進行驗證。根據ISO 20813:2019[38]的要求，對實驗室的數量要求是不少于8 家，其中國外實驗室不少于4 家。本研究邀請了12 家實驗室參加了協同實驗，其中，國外4 家分別來自德國、法國、馬來西亞、美國，國內8 家分別來自海關、市場監管、中國科學院、中國農業科學研究院等系統。使用儀器涉及Roche LightCycler480 II、ABI 7500、Agilent Mx3005P、ABI 7500 Fast、ABI QuanStudio 12K Flex、Bio-Rad CFX966 種品牌和型號的PCR儀。

假陽性率和假陰性率測試：提取火雞DNA，通過數字PCR將基因組DNA稀釋至10 拷貝/μL，作為陽性樣品。選取牛肉DNA，通過數字PCR定量至20 拷貝/μL，作為陰性樣品。每個實驗室測試6 個陽性樣品和6 個陰性樣品（均為盲樣），利用所建立的檢測方法進行檢測。收集檢測結果后，計算檢測方法的假陽性率和假陰性率。

絕對檢測限測試和POD分析：將載有火雞的特異性擴增片段的質粒pUC57-t利用數字PCR將質粒濃度稀釋至1000 拷貝/μL。再將質粒人工稀釋至4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.02 拷貝/μL 7 個濃度梯度，稀釋液為含有20 ng/μL的超聲粉碎鮭魚精DNA的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液。對每個濃度點的樣品設置6 個重復，進行real-time PCR檢測，計算各濃度點的陽性結果占總樣品數的百分比。POD是指單個實驗室使用定性方法在指定濃度下對給定基質進行測試分析得到陽性分析結果的概率，按照ISO/TS 16393:2019[39]和Uhlig等[40]發表的分析方法以及Quo Data在線數據分析程序（https://www.quodata.de/en/interlaboratory-studies.html#0）對絕對檢測限測試的結果進行POD分析。

2 結果與分析

2.1 特異性檢測分析

使用火雞檢測方法對收集到的各類動植物樣品進行特異性檢測。結果顯示，只有家火雞和眼斑火雞檢測結果為陽性，其他物種均為陰性，特別是與火雞親緣關系較近的鵪鶉、野雞也未出現擴增（表4）。為了對建立的real-time PCR方法進行確證，利用上游引物Turkey-118 bp-F和下游引物Turkey-118 bp-R，不添加探針，對以上樣品進行定性PCR結合電泳測試，結果顯示，也只有家火雞和眼斑火雞出現陽性擴增結果，部分禽類和主要肉類動物樣品的定性PCR產物電泳圖譜見圖1。對家火雞和眼斑火雞定性PCR的擴增產物分別進行克隆測序，其序列均與火雞染色體Z DNA序列（GenBank序列號：NC_015041.2）的57643369～57643486 bp的序列一致，長度為118 bp。使用NCBI BLAST功能對該118 bp的序列進行搜索比對，在整個GenBank庫中只有NC_015041.2與之完全配對（圖2）。說明利用該引物和探針建立的real-time PCR方法高度特異。

圖1 部分禽類和肉類動物樣品PCR檢測電泳圖譜Fig.1 PCR detection electrophoresis of partial poultry and meat animal samples

圖2 火雞PCR擴增產物測序序列BLAST結果Fig.2 BLAST results of the sequence of PCR amplicon from turkey

表4 物種特異性測試Table 4 Results of species specificity tests

特別值得一提的是，眼斑火雞與一種野火雞，主要分布于美國、墨西哥、洪都拉斯、危地馬拉等很小一部分地區的山林。眼斑火雞與家火雞同屬于火雞科火雞屬，一些國家將眼斑火雞與家火雞雜交培育出新的家火雞品種。NCBI GenBank庫中有家火雞的基因組序列，但到目前為止未見眼斑火雞的基因組全序列。本實驗通過對眼斑火雞具有和家火雞的PCR產物進行測序，證明兩者具有相同的靶序列。本檢測方法能同時檢測出家火雞和眼斑火雞。

2.2 種內一致性測試

使用real-time PCR方法對尼古拉、青銅、貝蒂娜、荷蘭白火雞、黑火雞、石板青、波朋火雞等常見火雞品種進行檢測，所有品種均檢測出陽性結果（表5），品種鑒定方法準確率為100%。利用上游引物Turkey-118 bp-F和下游引物Turkey-118 bp-R，不添加探針，對以上樣品進行定性PCR檢測和電泳測試。結果顯示，所有火雞品種出現陽性擴增結果（圖3）。對這些PCR產物進行克隆測序，序列均與GenBank序列號NC_015041.2的57643369～57643486 bp的序列一致。結果表明：本檢測方法的測試結果具有良好的種內一致性，適合于各種品種火雞的檢測。

圖3 不同火雞品種樣品的定性PCR檢測電泳圖譜Fig.3 Electrophoregrams of PCR products from various turkey breeds

表5 種內一致性檢測結果Table 5 Results of intraspecies specificity tests

2.3 絕對檢測限測試

利用數字PCR技術對含有火雞特異基因片段的pUC57質粒樣品進行定量檢測稀釋至1000 拷貝/μL。將定量后的質粒樣品DNA稀釋4、2、1、0.4、0.2、0.1 拷貝/μL和0.02 拷貝/μL 7 個濃度梯度。每個物種樣品每個濃度做6 次重復。結果顯示所建立的檢測方法在DNA濃度為1 拷貝/μL（5 拷貝/PCR反應）時都能清楚檢測到特異性DNA（表6），說明所設計的引物探針絕對檢測限可達5 拷貝/PCR反應。

表6 絕對檢測限測試Table 6 Results of absolute detection limit tests

2.4 國際協同實驗驗證

2.4.1 假陽性率、假陰性率驗證

每個參加協同實驗的實驗室均收到12 個盲樣，包括6 個陽性樣品和6 個陰性樣品。共計12 個實驗室參加了協同實驗，測試樣品總數量為144 個，假陽性率和假陰性率測試結果統計見表7。協同實驗統計結果表明，應用火雞成分檢測方法對陽性樣品全部檢出，陰性樣品全未檢出（表7），方法的假陽性率和假陰性率均為0%，達到ISO 20813:2019標準中規定假陽性率和假陰性率小于5%的要求。說明該方法產生的假陽性和假陰性結果的可能性很低，能保證檢測結果的準確性。

表7 假陽性率和假陰性率協同實驗測試結果統計Table 7 Statistics of false positive and false negative rates in collaborative trials

2.4.2 絕對檢測限測試驗證和POD分析

每個參加協同實驗的實驗室均收到4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.02拷貝/μL 7 個濃度的質粒DNA樣品各6 個，共計12 個實驗室參加了協同實驗，每一濃度點的測試樣品數為72 個，這些實驗室的測試結果見表8。計算各濃度點的陽性結果占該濃度點總樣品數的百分比，結果見表9。協同實驗結果表明：當PCR反應體系中靶序列模板數分別為20、10、5、2、1、0.5、0.1 拷貝時，檢測結果的陽性百分比分別為100%、100%、100%、91.7%、70.1%、54.2%、16.7%。也就是說，當靶序列高于5 拷貝/PCR反應時，樣品陽性檢出率均達到100%，說明該方法的絕對檢測限為5 拷貝/PCR反應。

表9 絕對檢測限的協同實驗結果分析Table 9 Analysis of collaborative trial results for absolute detection limit

按照ISO/TS 16393:2019和Uhlig發表的分析方法以及Quo Data在線數據分析（https://www.quodata.de/en/interlaboratory-studies.html#0）對方法的絕對檢測限和POD進行分析。所有參加協同實驗室在不同濃度稀釋點所測試的定性數據都被用來判斷檢測方法POD等于95%的分析（表10），實驗室間標準偏差為0.30，低于最大允許值1；在95%的POD的情況下，方法的絕對檢測限為3.2 拷貝/PCR反應，低于最大允許值20 拷貝/PCR反應[39]。表明所建立起來的火雞成分real-time PCR檢測方法具有較低的絕對檢測限，并且結果之間偏差較小。

表10 POD的協同實驗結果Table 10 Collaborative trial results for POD

2.4.3 不同品牌和型號的PCR儀器對檢測結果的影響

參加協同實驗的實驗室所使用的PCR儀有Roche LightCycler 480 II、ABI 7500、Agilent Mx3005P、ABI 7500 Fast、ABI QuanStudio 12K Flex、Bio-Rad CFX966 種不同品牌和型號（表11）。從表8和表11可以看出，各參加實驗室的假陽性、假陰性測試結果一致，在絕對檢測限（5 拷貝靶序列/PCR）反應以上檢測結果呈現出100%的陽性率，在絕對檢測限以下的2 拷貝靶序列/PCR時，各實驗室檢測結果也表現出較好的準確性和一致性，因此不同品牌和型號儀器對PCR檢測結果無明顯差異。

表11 各實驗室使用的PCR儀的品牌和型號Table 11 Make and model of PCR instrument used in each laboratory

2.5 ISO標準制訂

課題組向ISO組織提出火雞檢測方法的新工作項目提案，經ISO各成員國投票，ISO同意決定立項。立項編號為：ISO/NP 20224-8。經過工作組草案、委員會草案、技術規范草案（Draft of Technical Specification，DTS）等不同階段投票，并根據各國專家意見進行修改，多次召開ISO/TC34/SC16/WG8工作組會議討論修改，形成最終的DTS標準草案。2022年7月，火雞real-time PCR檢測方法在DTS階段以ISO各成員國100%的贊成率獲得通過。2022年10月，ISO組織正式發布了火雞成分檢測ISO標準ISO/TS 20224-8:2022[36]。

3 結論

本研究以火雞染色體Z DNA序列的特異片段為檢測靶序列建立了火雞源性成分real-time PCR檢測方法，并對方法的特異性、靈敏度進行測試。在此基礎上，組織國際協同實驗對建立的方法進行了驗證。協同實驗表明，所建立的檢測方法陽性率、假陰性率、絕對檢測限、POD等指標均達到ISO 20813:2019所要求的標準制定指標。通過本研究建立了火雞源性成分real-time PCR檢測的ISO標準。