基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜法快速測定米飯和乳制品中蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素Cereulide

曾 羲，王 宇，徐巨才，黃穗東，王 涓，徐振林,

（1.華南農業(yè)大學食品學院，廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511400；3.五邑大學生物科技與大健康學院，江門市大健康國際創(chuàng)新研究院，廣東 江門 529020）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，Bc）是一種在自然環(huán)境廣泛分布、可產芽孢的革蘭氏陽性桿菌[1-2]，也是一種檢出率極高的條件食源性致病菌[3-4]，其在食品的污染率高達20%～40%，且大部分陽性樣的污染水平遠超現在國家限量標準[5-7]。Bc的多個致吐毒株可分泌產生對酸、堿及熱穩(wěn)定的環(huán)肽型嘔吐毒素Cereulide（圖1），被認為是亞洲“炒飯綜合征”的罪魁禍首[8]。Cereulide為十二環(huán)肽，其不受蛋白酶干擾，且對自然殺傷細胞有作用抑制，會影響免疫功能和引發(fā)急性肝衰竭[9-11]，在Bc活菌被消除的情況下依然可引起食物中毒[12]。僅被Cereulide污染的食品不會發(fā)生腐敗變質、無異味，有極大的食品安隱患，2017年我國由Bc引發(fā)的食物中毒總人數比例高達3.63%[13]；2019年我國即食食品樣本中Bc的檢出率高達35.1%[8]；有研究表明，體質量約70 kg的成年人食用含有0.01～1.28 μg Cereulide的食物即可發(fā)生嘔吐中毒[14]。因此，建立食品中低濃度Cereulide的快速高效分析篩查方法十分必要。

圖1 Cereulide的結構示意圖Fig.1 Chemical structure of cereulide

隨著檢測技術的發(fā)展，Cereulide的檢測方法從早期不夠準確且昂貴的動物實驗法[15]對其進行半定量，到使用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法[16-17]對Bc毒株進行鑒定，但無法定量測定，再到準確的儀器分析方法。張秀堯等[18]利用高效液相色譜-串聯質譜法可實現對食品中Bc嘔吐毒素Cereulide的準確分析測定，但此方法前處理復雜、基質效應明顯，需加入同位素內標方可達到精準檢測；José等[19]以苝酰亞胺為熒光探針和Cereulide競爭結合K+從而實現對Cereulide的定量分析測定，此法操作簡單，但基質中其他離子對檢測結果的干擾較大；Veronika等[20]利用高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜聯合核磁共振法分析測定出Cereulide及其異構體的化學結構，但無法進行定量測定。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種新興的軟電離生物質譜[21]，其靈敏度高、能夠輔助被測物保持完整的分子結構，可用于表征并量化各種分子質量的生物分子[22-24]，近年來在多肽、蛋白質[25-26]的篩選和測定中發(fā)揮了重要作用。Sebastian[27]和Doellinger[28]等均使用MALDI-TOF MS分析技術實現了對Cereulide的定性分析，但無法進行定量檢測。

本研究通過篩選MALDI-TOF MS傳統(tǒng)基質對Cereulide的最佳響應強度，簡化食品樣品前處理過程、優(yōu)化分析方法，實現大批量、多批次樣品中Cereulide高效快速的定性、定量檢測，為調研、評價日常食物中Cereulide殘留量及污染風險狀況提供可靠的技術補充。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶 市購；米飯及面制品由當地餐飲店提供。

α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）、介子酸（sinapic acid，SA）、2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）（高效液相色譜級）德國Bruker公司；Cereulide標準品（2.0 mg/mL，純度99.0%，CAS號：157232-64-9）荷蘭Chiralix公司；甲醇、乙腈（色譜純）美國Thermo Fisher Scientific公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MS205DU電子天平 梅特勒-托利多（上海）國際貿易有限公司；ultraflextreme MALDI-TOF MS儀（配384孔ground steel靶板）德國Bruker公司；2600TH超聲清洗儀 上海安譜科學儀器有限公司；M37610-33CN渦旋混合儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Allegra X-30R高速冷凍離心機 美國Beckman公司；Milli-Q超純水制備系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1.3.1.1 標準溶液的配制

準確移取Cereulide標準品溶液50 μL于10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得10 μg/mL的標準儲備液，于-18 ℃避光儲存6 個月；精密量取上述儲備液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到1.0 μg/mL的標準中間液，臨用時將上述標準中間液用甲醇-水（50∶50，V/V）稀釋至指定標準曲線質量濃度。

1.3.1.2 基質的配制

稱取適量傳統(tǒng)基質HCCA（SA或DHB）至離心管中，加入1.0 mL TA50（乙腈-水（1∶1，V/V））（含0.1% TFA）溶劑，配成對應的質量濃度HCCA（SA或DHB）基質溶液，超聲溶解10 min。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 低脂肪制品

參考文獻[18]前處理方法并作適當修改。稱取0.50 g米飯或米面制品，加入2 g無水Na2SO4和5.0 mL甲醇后超聲提取10 min，經8000 r/min離心5 min后移取上清液，殘渣再用5.0 mL甲醇提取、離心1 次，合并提取液后用甲醇定容至10 mL，再吸取5.0 mL提取液，于60 ℃以氮氣吹干，溶于500 μL甲醇-水（50∶50，V/V），點靶上機測定。

1.3.2.2 乳制品

稱0.5 g乳制品（豆奶、牛奶、含乳飲料、奶粉等）加入1 mL水后，再加入0.5 mL乙酸鋅（92 g/L）和0.5 mL亞鐵氰化鉀（183 g/L）混勻，用甲醇定容至10 mL后旋渦2 min，經超聲提取10 min后10000 r/min離心5 min，吸取5 mL上清液，55 ℃以氮氣吹至約1 mL，再用5 mL正己烷萃取2 次，合并上清液后轉移至由100 mgN-丙基乙二胺固相吸附劑、40 mg C18和20 mg石墨化碳黑吸附劑混合均勻的離心管，振搖2 min，超聲提取5 min后10000 r/min離心5 min，將上清液用甲醇-水（50∶50，V/V）定容至2 mL，點靶上機測定。

1.3.3 點靶方式與MALDI-TOF MS分析條件

1.3.3.1 點靶方式

按點靶方法[29]，具體為雙鋪法1：先移取1 μL樣品于384 孔ground靶板上，自然揮干后，再移取1 μL基質覆蓋，自然揮干待測；雙鋪法2：先移取1 μL基質于384 孔ground靶板上，自然揮干后，再移取1 μL樣品覆蓋，自然揮干待測；混合點樣法：取2 μL樣品和2 μL基質混合均勻后，取2 μL混合物直接于384 孔ground靶板上點樣，自然揮干待測；三明治法：取0.5 μL基質溶液于384 孔ground靶板上，自然揮干后，取1 μL樣品覆蓋基質，自然揮干后，再取0.5 μL基質溶液揮干待測。

1.3.3.2 MALDI-TOF MS條件

光源：氮氣激光；離子源：電噴霧電離源；波長：337 nm；檢測模式：反射線性正離子模式；采集范圍：100～1500 Da；激光強度：70%；質譜響應強度疊加次數均為20 次。

1.4 數據處理

利用儀器配置的flexControl軟件對質譜圖質量軸質荷比（m/z）進行標記和默認平滑處理，并用flexAnalysis 3.4軟件分析原始數據，根據疊加所得Cereulide對應m/z的峰面積換算成標準曲線中標準物質的含量。結果以平均值表示（n＝6），并采用Excel 2011進行數據分析及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 MALDI-TOF MS裂解規(guī)律研究與基質選擇

按1.3.1節(jié)中方法配制100 ng/mL的Cereulide標準溶液和10 mg/mL的HCCA、SA和DHB基質溶液，觀察Cereulide標準溶液與基質的成膜過程及成膜情況，并分別采用反射線性正離子模式和反射線性負離子模式分析Cereulide在3 種基質的MALDI-TOF MS響應情況，結果見圖2。結果表明，Cereulide在3 種基質的負離子模式均無法檢測到目標物；以HCCA和DHB作為基質時，在正離子模式下可以檢測到離子化形式為[M+Na]+和[M+K]+的Cereulide質譜峰，其m/z分別為1175.8138和1191.7983，與Sebastian等[27]的分析結果一致，且以DHB為基質的疊加響應強度達105以上；以SA為基質時，僅在正離子模式下能檢測到離子化形式為[M+K]+的質譜峰；以DHB為基質時，在正離子模式下可產生[M+Na]+和[M+K]+的質譜信號峰。但值得注意的是，在以HCCA為基質時，其在靶板上的成膜性、響應強度均優(yōu)于DHB，其原因是DHB與樣品重結晶的“甜點”效應明顯[30-31]，故選用HCCA作為Cereulide的分析基質。

圖2 不同基質下Cereulide的MALDI-TOF MS圖Fig.2 MALDI-TOF MS spectra of cereulide in different matrixes

2.2 點靶方式的選擇與基質溶劑優(yōu)化

基質結晶質譜信號不穩(wěn)定、響應重復性差和“甜點”效應是影響MALDI-TOF MS定量分析測定的關鍵問題[30]。為實現HCCA對Cereulide的準確定量分析，以HCCA為基質，通過考察不同點樣方式對質譜信號的影響，即按1.3.3.1節(jié)中操作采用雙鋪法1、雙鋪法2、混合點樣法和三明治法，將100 ng/mL的Cereulide標準溶液作為樣品在384 孔ground靶板上點樣，每種方式做6 次平行，并按1.3.3.2節(jié)儀器分析條件進行檢測，結果見圖3A。4 種不同的點靶方式對Cereulide的[M+Na]+和[M+K]+的質譜峰響應強度從高到低依次為三明治法、雙鋪法2、雙鋪法1和混合點樣法，且三明治法與雙鋪法2的響應強度平均值均介于0.57×105～0.67×105，但因實際操作過程中雙鋪法2的操作步驟少及所需等待時間遠少于三明治法，可提高實驗效率，因此選用雙鋪法2作為Cereulide的點靶方式。

圖3 HCCA在不同點靶方式下（A）和HCCA分散在不同溶劑（B）Cereulide質譜響應強度Fig.3 Mass spectral response intensity of cereulide with HCCA using different spotting methods (A) and HCCA dispersed in different solvents (B)

將HCCA分別按1.3.3.1節(jié)中方法分散在TA50、TA50（含0.1% TFA）和甲醇-水（1∶1，V/V）溶劑后，分別觀察其與100 ng/mL標準溶液點樣成膜過程，并按1.3.3.2節(jié)儀器條件分析其響應強度，結果見圖3B。結果表明，3 種溶劑均可用于HCCA基質的溶解和MALDITOF MS分析，但在實際操作過程中發(fā)現甲醇-水所需的分散時間遠多于其他2 種溶劑；3 種溶劑對Cereulide的[M+Na]+和[M+K]+的質譜峰響應強度從高到低依次為TA50（含0.1% TFA）、TA50和甲醇-水，且以TA50（含0.1% TFA）作為溶劑時，HCCA在ground靶板上可均勻鋪展，分散性好、成膜性佳，Cereulide的質譜信號強度高重復性好，疊加的[M+Na]+質譜峰響應強度可達105，故選用TA50（含0.1% TFA）作為HCCA溶劑。

2.3 基質濃度優(yōu)化

在1 mL TA50（含0.1% TFA）中加入2.0、4.0、6.0、8.0 mg和10.0 mg不同質量的HCCA基質，考察其對100 ng/mL Cereulide標準溶液的MALDI-TOF MS分析效果，結果見圖4A。隨著HCCA質量濃度的增加，Cereulide的[M+Na]+質譜信號強度呈現先增加后降低的趨勢，在4.6×104～1.4×105之間，且在6.0 mg/mL時達最大值，為1.4×105；而Cereulide的[M+K]+質譜信號強度較為穩(wěn)定，整體介于0.4×105～0.5×105；說明基質濃度對[M+Na]+質譜峰信號影響較大，對[M+K]+質譜峰信號影響較小。因此，后續(xù)實驗均采用6.0 mg/mL HCCA的TA50（含0.1% TFA）基質溶液。

圖4 不同質量濃度HCCA（A）和HCCA在不同激光強度下（B）的Cereulide質譜信號強度Fig.4 Mass spectral intensity of cereulide as a function of HCCA concentration (A) and laser intensity (B)

2.4 MALDI-TOF MS激光強度優(yōu)化

以100 ng/mL的Cereulide標準溶液為樣品，分析MALDI-TOF MS不同激光強度（10%～90%）對HCCA與Cereulide的共結晶物的質譜信號強度影響情況，以10%的能量間隔遞增，各質譜信號響應強度的結果如圖4B所示。結果表明，隨著激光強度的增加，[M+Na]+和[M+K]+的質譜離子峰響應強度也增加，即分別從9.0×103增加到1.9×105、5.9×103增加到1.2×105，說明激光強度對兩個目標質譜離子峰信號影響較大，且2 個目標離子峰在激光強度達20%以上時信號較強。具體地，當激光強度增加到60%時，[M+Na]+的響應強度達最大，當激光強度增加到70%時，[M+K]+的響應強度達最大；當激光強度超過70%時，2 個目標離子峰的信號強度均呈現下降趨勢。故選擇70%的激光強度作為MALDITOF MS對Cereulide的分析條件。

2.5 方法學評價

2.5.1 檢出限、定量限和線性范圍

按1.3.1節(jié)中方法配制標準曲線，以HCCA為基質，采用雙鋪法2，在1.3.3.2儀器條件下對Cereulide的MALDI-TOF MS峰面積進行測定，繪制Cereulide的[M+Na]+和[M+K]+疊加峰面積（y）與標準物質質量濃度（x/（ng/mL））的線性曲線，線性范圍、線性方程和相關系數見表1。在5～100 ng/mL的線性范圍內，Cereulide的2 個目標離子峰的疊加峰面積與質量濃度的r均＞0.99，說明線性關系良好。本研究在信噪比RSN≥3條件下確定檢出限（表1），結果表明，以HCCA作為基質的MALDI-TOF MS對Cereulide的[M+Na]+和[M+K]+檢出限分別為3.0 ng/g和5.0 ng/g。

表1 Cereulide的線性范圍、線性方程和檢出限Table 1 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients and limits of detection and quantification for cereulide

2.5.2 加標回收實驗和精密度結果

選擇米飯和牛奶進行低、中和高3 個質量濃度（即20、50 ng/g和100 ng/g）進行Cereulide加標回收實驗。按1.3.2節(jié)方法制備樣品，以HCCA為基質采用雙鋪法2，按照1.3.3.2節(jié)儀器方法上機測定，每個樣品點靶6 次，同時用外標法定量并計算回收率，結果見表2。結果表明，Cereulide在米飯和牛奶中的加標回收率為73.3%～118.2%，相對標準偏差為0.3%～10.9%，說明本研究建立的MALDI-TOF MS對Cereulide的定量分析檢測方法準確可靠。

表2 Cereulide標準物質在低、中和高3 個水平的加標回收率和相對標準偏差（n ＝6）Table 2 Recoveries and relative deviations for cereulide at three spiked concentration levels (n=6)

2.6 實際樣品檢測結果

將本方法用于廣州市餐飲和銷售環(huán)節(jié)中9 批次米飯和6 批次乳制品中Cereulide污染情況篩查和檢測，通過比較實際樣品在MALDI-TOF MS的質譜離子峰和信號強度進行篩查確證，檢測結果表明，1 批次米飯樣品為陽性，其MALDI-TOF MS定量分析結果為（10.3±0.6）ng/g，陰性樣品與陽性樣品的MALDI-TOF MS圖見圖5。

圖5 米飯陰性（A）和陽性（B）樣品的MALDI-TOF MS圖Fig.5 MALDI-TOF MS spectra of negative (A) and positive (B)cooked rice samples

3 結論

通過優(yōu)化基質和儀器分析條件，建立了以HCCA為基質的反向線性正離子模式定量測定蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素Cereulide的MALDI-TOF MS分析方法，將傳統(tǒng)的Bc菌株定性檢測方法轉移到其確定蛋白質代謝物的定量分析檢測，提高了對Cereulide污染準確性的判定。該方法不僅靈敏度高、篩查結果準確、精密度好、節(jié)能環(huán)保高效，而且不需要內標即可實現Cereulide的定性定量分析；同時，每個樣品經儀器分析僅需0.3 s即獲得篩查結果，可實現日常檢驗和應急抽檢對大批量、多批次樣品中Cereulide的定性篩查。

MALDI-TOF MS在生物毒素分析測定方面有巨大優(yōu)勢，目前已基本可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)生化方法，通過優(yōu)化樣品凈化條件也可為食品非法添加物的風險評估提供快速、準確和極其高效的篩查方法，但由于目前MALDITOF MS在生物毒素方面的數據庫并不完整，因此不斷完善此數據庫或開發(fā)出不依賴數據庫的鑒定方法是亟待解決的問題和研究方向。