殼聚糖微花的制備及影響其形貌的因素

焦思宇，許丁予，姚先超，何麗欣，林日輝

（廣西民族大學化學化工學院，林產化學與工程國家民委重點實驗室暨廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西林產化學與工程協同創新中心，廣西 南寧 530006）

甲殼素是一種維持和保護甲殼動物和微生物軀體的線性氨基多糖，廣泛存在于節足動物類（蜘蛛類、甲殼類）的翅膀或外殼中，也存在于真菌和藻類的細胞壁中[1]，其化學名為β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。在天然高分子中的貯存量居于第二，僅次于纖維素。殼聚糖（chitosan，CS）是殼素脫除55%以上的乙酰基后得到的產物[2]，其化學名為β-(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，是自然界中的唯一大量存在的陽離子堿性多糖[3]，也是僅次于蛋白質的第二大氮源。它有良好的可降解性、抗菌性、成膜性、生物相容性等特性，故被廣泛的研究與應用在農業[4]、醫藥[5]、食品[6]、水處理[7]、抗菌劑[8]等方面。雖然CS有這些優良的性能，但是它的分子質量大、比表面積較小和水溶性差等特性，一定程度上限制了其應用范圍。

納米技術是研究在微觀納米的角度上制造特殊定位的功能產品，以此來達到生產方式的進一步飛躍。納米材料與其他功能性材料不同，具有特殊的表面效應、體積效應與宏觀量子隧道效應，表現出許多卓越的特性和新穎的功能，應用前景十分廣闊。基于CS本身的巨大應用前景與其豐富的來源以及它獨特良好的化學特性，結合納米材料的卓越特性和諸多功能，將CS進行納米化可以使其在原先的應用領域上再進行突破，小尺寸的粒徑為納米顆粒與基質的接觸提供了更大的比表面積，從而提高了納米CS的生物活性[9]。而且納米CS在抗氧化性、抗菌性、滲透性和吸收性等方面也得到了顯著提高[10]。目前納米CS的制備一般采用離子交聯法[11]、乳化交聯法[12]和噴霧干燥法[13]等。在通過離子交聯法制備納米CS的過程中加入Ca2+后會得到一種形貌類似于花朵狀的CS基材料，簡稱為殼聚糖微花（chitosan microflower，CSMF），而CSMF在吸附染料和酶催化方面表現出高效率[14]。由于CSMF特殊的形貌及其具有較大的比表面積，引起了眾多學者的廣泛研究。如Liu Shangpeng等[15]用聚多巴胺包裹CS/焦磷酸鈣雜化微花作為止血劑，結果發現經聚多巴胺包裹的微花可誘導血細胞和血小板聚集，促進血液凝固，實現體外和體內出血控制。Maurya等[16]用CS/焦磷酸鈣雜化微花固定了α-淀粉酶，固定化的α-淀粉酶比游離態的α-淀粉酶對玉米、小麥和馬鈴薯淀粉水解能力更強。

目前CSMF的制備方法單一，基本制備方式為以CS-三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）絡合物為模板，誘導焦磷酸鈣在其上面仿生礦化，進而焦磷酸鈣晶體進行生長，最終得到了CS/焦磷酸鈣雜化微花。探究一種新型的CSMF的制備方法就顯得尤為重要。因此本研究對離子交聯法進行改進，將CS原料進行超聲/過氧化氫預處理，并將TPP由下而上地注入到CS溶液中，通過冷凍干燥的方式得到了CSMF，并結合掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀、傅里葉紅外變換光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）、熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）技術，對其形貌、結構和性質等進行分析。通過改變制備條件，探究影響其形貌的因素，以期為CS特殊形貌的構筑提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CS（脫乙酰度≥95%）、TPP（分析純）上海麥克林生化有限公司；冰醋酸（分析純）上海阿拉丁生化技術有限公司；過氧化氫（分析純）天津致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

JY92-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；FD-A10N-50冷凍干燥機 上海皓莊儀器有限公司；TG1650-WS 型臺式高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SUPRA 55 Sapphire型場發射SEM 德國卡爾蔡司公司；MiniFlex600 XRD儀日本理學公司；TGA55 TGA儀 美國TA儀器公司；K-Alpha XPS儀、MAGNA-1R 550 FTIR儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 CSMF的制備

通過離子交聯法制備CS-TPP微花。首先，在磁力攪拌下將1.0 g CS溶解在質量分數為1%的乙酸溶液中。并向CS溶液中加入10 mL質量分數為6%的H2O2溶液進行輔助溶解，在45 ℃條件下磁力攪拌20 min。其次，將完全溶解的CS溶液超聲粉碎（功率為100%）30 min。然后，在超聲粉碎的條件下將質量分數為5%的TPP溶液由下而上地加入到CS溶液中（此時CS溶液溫度為40 ℃）。通過離心（6000 r/min）法收集微花，并用乙醇洗滌3 次，用蒸餾水洗滌一次。最后，冷凍干燥后得到CSMF粉末。

1.3.2 SEM觀察

取一定量干燥的CS和CSMF通過導電膠均勻地分散到樣品臺上，輕輕吹去多余的浮樣，置于真空鍍膜儀下噴鍍鈀金，制成觀察樣品，在SEM下拍攝具有代表性的不同放大倍數下的淀粉顆粒性形貌，加速電壓為10 kV。

1.3.3 FTIR分析

采用KBr壓片法[17]，取1～2 mg樣品與干燥KBr粉末按照質量比1∶50混合并壓制成薄膜層，然后通過FTIR儀進行測量。樣本掃描波數范圍為4000～400 cm-1，平均掃描32 次，分辨率為4 cm-1。

1.3.4 XRD分析

使用MiniFlex600型XRD儀對樣品進行分析，Cu（Kα）射線，Ni片濾波，電壓40 kV，電流15 mA，掃描范圍2θ為4°～60°，掃描速率為2°/min，掃描步長為0.02°。

1.3.5 熱穩定性分析

使用T G A 儀研究粉末樣品的熱穩定性，即在氮氣氣氛下，將大約10 mg樣品以20 ℃/min的升溫速率從35 ℃加熱到800 ℃，得到CS和CSMF的熱重（thermogravimetry，TG）、熱重微分（differential thermal gravity，DTG）曲線。

1.3.6 XPS分析

XPS數據是使用工作在6 mA和12 kV的消色差AlKα X射線源獲得。使用平均10 次掃描收集全元素光譜，通過能量為100 eV，掃描范圍1400～0 eV。使用平均5 次掃描收集單元素光譜，通過能量為50 eV，步長為0.05 eV。

1.3.7 影響CSMF形貌的因素考察

為探究影響CSMF形貌的因素，做了一系列單因素試驗，見表1。

表1 單因素試驗設計Table 1 Design of single factor experiments

1.4 數據處理

所有實驗均進行3 次重復，采用Excel 2010進行實驗數據統計，采用Origin（Pro 9.0）軟件對實驗參數和結果進行擬合分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 SEM觀察結果

由圖1A可知，CS本身為二維片層結構，CS緊密排列在一起，表面相對光滑，沒有孔洞，且整體黏連在一起，粒徑較大。而經過H2O2和超聲協同處理后得到的CSMF（圖1B）呈現三維花瓣形狀，花瓣直徑約為1.5～2.0 μm，是由厚度約為30～70 nm的納米片組成，并且CSMF相互之間沒有黏連，整體分散均勻；花瓣之間有一定的空隙，使一些活性位點裸露出來，并通過氮氣吸附脫附儀測試得知CSMF的比表面積為48.9 m2/g，因此更容易對其進行改性或者是充當吸附劑。

圖1 CS（A）與CSMF（B）的SEM圖Fig.1 Scanning electron microscope (SEM) images of CS (A) and CSMF (B)

2.2 FTIR分析結果

由圖2可知，CS在3374 cm-1處的峰歸因于CS結構單元上—NH2與—OH伸縮振動共同作用的結果[18]；2877 cm-1處的峰為CS未去除的乙酰基上的—CH3的伸縮振動峰；1662、1592 cm-1和1311 cm-1處的峰分別歸因于酰胺I振動（C＝O伸縮振動）、酰胺II振動（—NH2彎曲振動）和酰胺III振動（C—N伸縮振動）[19]；1427cm-1處的峰為CS C6位上—CH2中的C—H彎曲振動峰；1380 cm-1處的峰為乙酰基上—CH3中的C—H彎曲振動峰；1080 cm-1處的峰為C—O伸縮振動峰，這與紀建華[20]的報道相似。對比分析CSMF的FTIR圖譜可知：CS結構單元上—NH2與—OH伸縮振動共同作用的峰從3374 cm-1處位移到3243 cm-1，造成此峰偏移的原因是，首先CS在形成CSMF的過程中，糖苷鍵斷裂，使—OH含量有所增加，其次在CS溶解的過程中—NH2帶上了正電荷形成了—，因此N—H鍵的含量也有所增加，最后，CS溶解過程中又進一步去除了乙酰基，同時也是—NH2含量增加，所以多種原因共同作用使此處的峰發生了顯著的偏移；同時CSMF在2881 cm-1處—CH3伸縮振動峰減弱，但還存在1643 cm-1處酰胺I振動（C＝O伸縮振動）、1538 cm-1處酰胺II振動（—NH2彎曲振動）和1380 cm-1處乙酰基上—CH3中的C—H彎曲振動峰，也證明了在形成CSMF的過程中CS上乙酰基又脫除了一部分，其次CSMF在1087、894 cm-1和532 cm-1處的峰分別為C—O伸縮振動峰、糖苷鍵上的C—O伸縮振動峰和磷酸基團的特征峰[14]，而532 cm-1處的峰也證明了CS-TPP雜交微花的形成。

圖2 CS與CSMF的FTIR圖譜Fig.2 FTIR spectra of CS and CSMF

2.3 XRD分析結果

如圖3所示，CS在20.1°處有一個尖銳的特征衍射峰，這是典型的CS指紋圖譜，具有明顯的半結晶結構[21]。CSMF的特征峰為2θ11.9°、19.08°和23.94°，這些特征峰表明了CSMF是一種多晶型結構，在文獻中被稱為“肌腱”水合多晶型[22]。其產生原因為TPP改變了CS的晶體結構，影響了CS分子間和分子內氫鍵的排列，進而出現了這些新的衍射峰[22]。CSMF改變了CS的結晶狀態，使其從無定形結晶向有序晶型排列。

圖3 CS和CSMF的XRD圖Fig.3 X-ray diffraction patterns of CS and CSMF

2.4 TGA結果

如圖4曲線a、b所示，CS有兩個質量損失階段，CS第1階段質量損失發生在溫度為60～150 ℃范圍內，質量損失約12.7%，其原因是CS表面的自由水和結合水的溢出，這一階段的最大質量損失速率溫度約為92 ℃；第2階段發生在220～430 ℃，質量損失約為46.6%，這與CS糖苷鍵的斷裂有關，這一階段的最大質量損失速率溫度約為308 ℃，這與侯文龍等[23]的研究結果一致。對比分析圖4曲線c、d可知，CSMF有兩個質量損失階段，CSMF第1階段質量損失發生在溫度為低于150 ℃范圍內，質量損失約12%。其原因是CSMF表面的自由水和結合水的溢出，這一階段的最大質量損失速率溫度約為97 ℃。第2階段發生在175～320 ℃，質量損失約為30%，這與CS糖苷鍵的斷裂有關，這一階段的最大質量損失速率溫度約為249 ℃[24-26]。通過對比可知CSMF的熱穩定性要略差于CS，其原因可能是由于TPP的引入，改變了CS的氫鍵排列，使之形成微花結構，而CS由于分子間和分子內氫鍵，使之排列十分緊密（圖1A），因此這種片層結構的熱穩定性就要優于微花結構。

圖4 CS和CSMF的TGA-DTG圖Fig.4 TGA-DTG profiles of CS and CSMF

2.5 XPS分析結果

XPS主要是對樣品表面元素組成及狀態的分析手段，因此為了解CS和CSMF的表面元素組成，對CS和CSMF進行XPS分析，結果如圖5所示。對比圖5A和E可知，經TPP交聯后的CS表面C原子含量從之前的65.57%降低到了50.81%；而N原子和O原子含量分別從之前的5.93%和28.5%增加到了6.41%和38.84%，并且交聯后CSMF表面含有3.95%的P原子，這是因為TPP本身含有大量的O原子和P原子，因此當形成CSMF時會使CS表面的O原子含量增加而C原子含量減少，并且會使CSMF表面含有少量的P原子，而CSMF表面N原子的增加可能與CSMF的形貌有關，CSMF的微花結構使更多的N原子裸露出來，進而使CSMF的表面N原子含量增加，而CSMF表面N原子的增加使其更容易進行表面改性。

圖5 CS和CSMF的XPS光譜對比Fig.5 Comparison of XPS spectra between CS and CSMF

對比圖5B和F，CS的C1s的XPS光譜在結合能為284.78、286.29、287.78 eV處分為3 個峰，每個峰分別歸因于C—C/C—H、C—OH和O—C—O鍵；CSMF的C1s光譜在結合能為284.84、286.42、287.86處分為3 個峰，每個峰分別歸因于C—C/C—H、C—OH和O—C—O鍵[27]。對比發現交聯后CSMF的C—OH含量顯著提高，而C—C/C—H的含量有所下降，產生此現象的原因可能是CS在溶解過程中糖苷鍵斷裂，從而在糖苷鍵斷裂處又形成了新的—OH，進而使C—OH含量增加，其次因為CSMF是一個三微的微花結構，因此C—C可能在這個微花結構內部含量較多，進而表面含量減少。

對比圖5C和G N1s XPS光可知，CS的N1s XPS僅在398.46 eV處有唯一的一個C—N鍵峰，而CSMF的N1s XPS有兩個峰，在398.45 eV處為C—N鍵峰，在400.56 eV處為C—N+鍵峰[28]。對比可知CSMF表面比CS多了一個新鍵C—N+，這個新鍵產生的原因是CS溶解過程就是—NH2得質子的過程，進而生成—，從而產生了C—N+鍵。

最后對比圖5D和H O1s可知，CS的O1s XPS僅有一個O—H鍵的峰，在532.63 eV處，而CSMF的O1s XPS有兩個峰，在531.86 eV處為O—H鍵的峰，在533.56 eV處為O＝C鍵的峰[29]。CSMF的C＝O鍵來源于CS未去除的那部分乙酰基，之所以在CSMF的O1s XPS顯示出來可能也是因為CSMF的微花結構。

綜上所述，CS經TPP交聯后形成的CSMF表面多了一種新原子P，且表面也產生了一種C—N+新鍵；而CSMF表面C—OH和C＝O鍵含量增加，C—C鍵含量減少，可能是因為其三維的微花結構。

2.6 影響CSMF形貌的因素

為探究影響CSMF形貌的因素，單因素試驗（1.3.7節）對應的SEM圖如圖6所示。

圖6 單因素試驗1～15所對應的SEM圖Fig.6 SEM images of samples obtained in single factor experiments 1–15

對比單因素試驗1～3可知，當CS僅只經過超聲處理時，CS-TPP的絡合物呈現三維網絡狀結構，并且CS-TPP絡合物分散效果不好，不成顆粒，全部都黏連在一起；而當CS僅經過H2O2處理時，CS-TPP的絡合物也呈現三維網絡狀結構，但是其孔洞較僅超聲處理的要小一點，雖然也黏連在一起，但分散效果要優于僅超聲處理的；而將CS經過超聲和H2O2協同處理后的CS-TPP絡合物呈現微花結構，且分散均勻直徑在1.5～2.0 μm左右。推測產生這樣現象的原因可能是當CS僅通過超聲或H2O2處理時，CS的分子質量下降程度有限，整體黏度較大，使之與TPP交聯后，團聚在一起，難以形成單獨的、分散性較好的顆粒，而當CS經過超聲和H2O2協同處理后，其分子質量降低明顯，此時的黏度較小和流動性較好，使之與TPP絡合后能形成均勻的顆粒。為驗證其黏度的大小，用烏氏黏度計測量3 種不同處理條件下CS溶液的相對黏度，結果依次為29.54、18.03和1.65，因此黏度越小越有利于顆粒的生成。

對比分析單因素試驗3～5可知，H2O2添加量并不會影響CSMF的形成，但仔細對比發現7%的H2O2處理過的CSMF整體上大小均勻，而經9.3%的H2O2處理過的CSMF大多數花朵的花瓣密集，且微花直徑也有所增大。

對比分析單因素試驗3、6、7可知，超聲時間對CSMF的形貌有顯著影響。當超聲10 min時，CS-TPP絡合物形成了顆粒，分散性較好，也比較均勻，并且部分顆粒具有三維結構，但是不成花，卻有成花的趨勢；而當超聲60 min時，由單因素試驗7可知，CS-TPP絡合物也形成顆粒，分散效果不如前兩者，且顆粒呈現為二維的片狀結構，而且顆粒排列的十分致密，推測出現這樣現象的原因是超聲和H2O2對CS糖苷鍵斷裂后形成的小分子CS鏈長度是隨機的，當超聲時間太短時，CS沒有得到充分地降解，此時的CS溶液中降解后的CS鏈的長度較大，此時CS與TPP交聯后多以花狀結構的底座形態存在；當超聲時間太長時，CS得到了充分地降解，此時CS溶液中的CS鏈長較小，而CS與TPP交聯后主要形成CS-TPP納米片，此時納米片少了花狀結構的底座，所以也形不成微花結構。因此，形成微花結構必須滿足既要有CS長鏈與TPP交聯形成底座，又要有CS短鏈與TPP交聯形成納米片及花瓣。

在對比分析單因素試驗3、8、9可知，超聲的功率對CSMF的形成沒有太大的影響，仔細對比發現超聲功率越大CSMF分散的效果越好，大小越均勻。

在對比單因素試驗10～12可知，溫度對CSMF的形成有著顯著的影響，當CS溶液溫度為0 ℃時，CS-TPP所形成的絡合物緊密地排列在一起，也是三維的網絡結構，但是其孔隙率較低，并且表面相對光滑；而當溫度升到25 ℃時，CS-TPP所形成的絡合物也呈現三維網絡結構，也緊密的排列在一起，但與0 ℃的形貌相比孔隙率要高，表面要粗糙；而在當溫度升到50 ℃時，CS與TPP交聯后就形成了CSMF，此時的CSMF粒徑在1.0～1.5 μm左右，比40 ℃條件下的CSMF粒徑要小一點，且分散得也十分均勻，大小也十分均勻。推測產生此現象的原因是當溫度較低時，CS的流動性較差且黏度較高，所以此時CS與TPP交聯后就難以形成顆粒，直接黏連在一起形成網絡結構，而當溫度上升到一定值后，CS溶液的流動性和黏度就得到了顯著的改善，繼而與TPP交聯后能夠形成微花結構。

最后對比分析單因素試驗13～15可知，CS與TPP的比例也會對微花的形成產生巨大的影響。當CS與TPP質量比為1∶2.5時，此時CS與TPP交聯后有形成顆粒的趨勢，但還黏連在一起形成網絡結構；當CS與TPP質量比為1∶10時，此時CS與TPP交聯后雖然也形成微花結構，但是花狀結構不如1∶5時的完整，且此時的分散性也不如1∶5時的好；當CS與TPP質量比為1∶15時，此時CS與TPP交聯后形成片狀顆粒。推測出現這樣現象的原因是TPP水溶液呈弱堿性，當TPP含量減少時，溶液體系pH值偏小，此時CS的—基團含量較多，與磷酸根離子交聯的次數也就較多，所以可能形成網絡結構，而當TPP含量較多時，溶液體系pH值偏大，此時CS的—基團含量減少，與磷酸根離子交聯的次數也就減少了，所以可能形成片層結構。

綜上所述，影響CSMF的形貌的因素有預處理方式、超聲時間、CS溶液溫度和CS與TPP的添加比例。結合Sasidharan[30]和Wang Xiaoli[14]等的成花機理，推測CSMF的形成機理可能為將原CS降解成在一定分子質量范圍內的短長鏈CS，然后TPP與降解后相對較長的CS鏈交聯形成微花結構的底座，與降解后相對較短的CS鏈交聯形成納米片，然而底座和納米片的形成需要一定的溫度和能量維持，最后再通過CS結構上面的—與磷酸根離子之間的相互作用，將納米片自組裝到底座上，進而生成微花結構。

3 結論

本研究以離子交聯法為基礎，通過對CS進行超聲和H2O2預處理后與TPP交聯形成了一種微花結構，并且CSMF的比表面積為48.9 m2/g，極大地增加了CS的比表面積。對CS與CSMF進行FTIR、XRD、TGA和XPS表征，研究影響CSMF形貌的因素。結果表明：經FTIR和XPS對比可知，CSMF比CS多出了磷酸根基團和C—N+鍵，表明CS成功與TPP交聯；并且CSMF的結晶度較CS有所下降，但晶體組成和有序性得到了增強；而CSMF的熱穩定性也較CS有所降低；得知了影響CSMF形貌的因素有預處理方式、超聲時間、CS溶液溫度和CS與TPP質量比，推測了CSMF的成花機理，可能為將原CS降解成在一定分子質量范圍內的短長鏈CS，然后TPP與降解后相對較長的CS鏈交聯形成微花結構的底座，與降解后相對較短的CS鏈交聯形成納米片，然而底座和納米片的形成需要一定的溫度和能量維持，最后再通過CS結構上面的—與磷酸根離子之間的相互作用，將納米片自組裝到底座上，進而生成了微花結構。因此本實驗不同于Wang Xiaoli等[14]CS微花的構筑（通過Ca2+在CS上仿生礦化所得），為CS特殊形貌的構筑提供了新思路。