環狀RNA circ-TAGLN在卵巢癌細胞中的表達及對卵巢癌細胞增殖和侵襲的影響

劉毅力,郭 沖,尹 恒,劉 洋

(1.湖北醫藥學院附屬太和醫院婦產中心,湖北 十堰 442000;2.昆明醫科大學第一附屬醫院腫瘤科,云南 昆明 650032)

2023年全球癌癥統計結果表明,卵巢癌的發病率位于女性生殖系統惡性腫瘤第3位,并且是全球病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。早期卵巢癌患者并無明顯的臨床表現,因而多數卵巢癌患者出現癥狀時已處于中晚期[2]。目前,針對卵巢癌的治療策略有限,患者往往療效較差、生存期較短[3]。探究卵巢癌細胞生長和侵襲的分子機制,有助于篩選有效、安全的分子治療靶點。環狀RNA(circRNA)是一類呈封閉環狀結構的非編碼RNA,長度通常小于2000個堿基,由外顯子序列經過反向首尾拼接而成[4]。circRNA不含游離的末端,因而其結構穩定,在人體細胞中具有較高的保守性[5]。大量研究[6-7]表明,circRNA在骨肉瘤、喉癌、膠質瘤等很多腫瘤組織中異常表達,影響腫瘤細胞的增殖、化療敏感性、侵襲等行為。circRNA在卵巢癌中的表達和功能具有重要臨床研究價值。circ-TAGLN基因組位于人染色體11q23.3區域,其由第3號和4號兩個相鄰的外顯子反向首尾連接形成。然而,circ-TAGLN是否影響腫瘤如卵巢癌的發生、發展并不清楚。本研究主要分析circ-TAGLN在卵巢癌細胞系中表達,通過改變卵巢癌細胞中circ-TAGLN的表達,利用細胞功能實驗探索circ-TAGLN在卵巢癌細胞中的功能及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 正常卵巢上皮細胞IOSE80和卵巢癌細胞系SK-OV-3、OC3、Caov-3、A2780、HO-8910購于中國科學院上海細胞庫;細胞培養基、胎牛血清購于美國Invitrogen公司;Trizol試劑、Lipofectamine 3000購于日本TaKaRa公司;RT-qPCR試劑盒購于廣州銳博生物有限公司;miR-NC mimic、miR-425-5p mimic、雙熒光素酶載體購于上海碧云天生物科技公司;pcDNA3.1對照質粒和pcDNA3.1-circ-TAGLN質粒購于上海吉瑪制藥技術有限公司;Transwell小室和細胞裂解液購自美國Corning公司;雙熒光素酶活性試劑盒和基質膠購自北京索萊寶科技有限公司;p-PI3K兔單克隆抗體、p-AKT兔單克隆抗體、p-mTOR兔單克隆抗體、β-tubulin兔單克隆抗體、VEGF兔單克隆抗體、eNOS兔單克隆抗體購于英國Abcam公司。

1.2 細胞培養與轉染 將IOSE80、K-OV-3、Caov-3、A2780、HO-8910細胞培養在DMEM培養基中,將OC3細胞培養在RPMI-1640培養基中,每100 ml培養基中添加12 ml胎牛血清。SK-OV-3細胞匯合度為60%時,通過Lipofectamine 3000試劑分別轉染pcDNA3.1對照質粒和pcDNA3.1-circ-TAGLN質粒,分別命名為NC組和circ-TAGLN組。

1.3 RT-qPCR法檢測circ-TAGLN和miR-425-5p表達 利用Trizol試劑提取細胞總RNA,經逆轉錄合成cDNA,分別加入相應引物,根據RT-qPCR試劑盒說明書進行擴增,引物序列見表1。通過GAPDH和U6為內參,以2-ΔΔCt法分析circ-TAGLN和miR-425-5p相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4 平板克隆實驗檢測SK-OV-3細胞增殖 將NC組和circ-TAGLN組SK-OV-3細胞消化、離心、計數,均勻鋪在6孔板,每孔400個細胞,在培養箱中培養13 d,直到細胞克隆成團。用低溫PBS溶液清洗,加入700 μl甲醇固定35 min,加入700 μl 1.2%結晶紫染色35 min。用低溫PBS溶液清洗,肉眼下記錄細胞克隆形成數。

1.5 Transwell實驗檢測SK-OV-3細胞侵襲 在Transwell上室均勻鋪滿基質膠,將NC組和circ-TAGLN組SK-OV-3細胞消化、離心、計數,均勻鋪在Transwell上室,每孔6×104個細胞。Transwell下層加600 μl含15%胎牛血清的培養基。培養箱培養24 h后,用低溫PBS溶液清洗,加入700 μl甲醇固定35 min,加入700 μl 1.2%結晶紫染色35 min。顯微鏡(×100)下拍照,記錄侵襲細胞數,比較各組細胞的侵襲能力。

1.6 雙熒光素酶報告實驗驗證circ-TAGLN與miR-425-5p的靶向關系 分別采用雙熒光素酶載體構建circ-TAGLN野生型報告質粒(WT-circ-TAGLN)和突變型報告質粒(MUT-circ-TAGLN),取對數生長期的SK-OV-3細胞,按照Lipofectamine 3000轉染試劑盒說明書將WT-circ-TAGLN、MUT-circ-TAGLN分別與miR-NC和miR-425-5p轉染到SK-OV-3細胞。常規轉染45 h后,通過雙熒光素酶報告基因試劑盒分析每孔SK-OV-3細胞的熒光素酶活性。

1.7 Western blot檢測SK-OV-3細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白表達 經細胞裂解液裂解NC組和circ-TAGLN組SK-OV-3細胞,高速離心提取總蛋白,經8% SDS-PAGE膠電泳、聚偏二氯乙烯膜轉膜、牛血清白蛋白封閉后,TBST溶液洗滌45 min。加入一抗p-PI3K(1∶2000)、p-AKT(1∶1000)、p-mTOR(1∶3000)、β-tubulin(1∶4000)、VEGF(1∶3000)、eNOS(1∶3000),3 ℃處理13 h。TBST溶液洗滌45 min,加入羊抗兔二抗(1∶9000)處理3.5 h,TBST溶液洗滌45 min,采用化學發光法顯影、拍照。

2 結 果

2.1 circ-TAGLN在卵巢癌細胞系中的表達比較 RT-qPCR結果顯示(圖1),卵巢癌細胞系SK-OV-3、OC3、Caov-3、A2780、HO-8910中circ-TAGLN表達低于IOSE80細胞(均P<0.05),SK-OV-3細胞中circ-TAGLN表達相對較低,因此選擇SK-OV-3細胞進行過表達實驗(P<0.01)。

注:與IOSE80細胞相比,*P<0.05,**P<0.01

2.2 過表達circ-TAGLN后SK-OV-3細胞的增殖情況 利用脂質體轉染過表達SK-OV-3細胞中circ-TAGLN的表達,NC組與circ-TAGLN組中circ-TAGLN相對表達量分別為(1.01±0.34)和(7.56±1.07),circ-TAGLN組SK-OV-3細胞中circ-TAGLN表達高于NC組(均P<0.01)。平板克隆實驗結果顯示(圖2),NC組和circ-TAGLN組克隆數量分別為(116.00±11.16)個和(40.29±7.65)個,與NC組相比,circ-TAGLN組SK-OV-3細胞增殖能力被抑制(均P<0.01)。

注:與NC組相比,**P<0.01

2.3 過表達circ-TAGLN后SK-OV-3細胞的侵襲情況 Transwell實驗結果顯示(圖3),NC組和circ-TAGLN組侵襲細胞數分別為(52.13±5.75)個和(15.95±3.49)個,兩組侵襲細胞數比較,差異有統計學意義(P<0.01)。表明與NC組相比,circ-TAGLN組SK-OV-3細胞侵襲能力被抑制。

注:與NC組相比,**P<0.01

2.4 circ-TAGLN與miR-425-5p之間的靶向關系 雙熒光素酶報告實驗結果顯示(圖4),在WT質粒共轉染中,與miR-NC組比較,miR-425-5p組相對熒光素酶活性明顯降低(P<0.01);在MUT質粒共轉染中,miR-NC組和miR-425-5p組相比,相對熒光素酶活性的差異沒有統計學意義(P>0.05)。

注:與miR-NC組相比,**P<0.01

2.5 過表達circ-TAGLN后SK-OV-3細胞中miR-425-5p表達 RT-qPCR檢測結果顯示,NC組與circ-TAGLN組SK-OV-3細胞中miR-425-5p表達分別為(5.57±0.91)和(1.01±0.17),與NC組相比,過表達circ-TAGLN后SK-OV-3細胞中miR-425-5p表達被抑制,兩組表達量比較具有統計學差異(P<0.01)。

2.6 過表達circ-TAGLN后SK-OV-3細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白表達 Western blot檢測顯示,與NC組相比,過表達circ-TAGLN的SK-OV-3細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、VEGF、eNOS的表達水平明顯降低,兩組表達量比較具有統計學差異(均P<0.01),見表2。

表2 Western blot檢測SK-OV-3細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白表達

3 討 論

卵巢癌是嚴重影響女性生殖健康的惡性腫瘤,外科手術、放療和化療等傳統治療方式并不能有效改善中晚期卵巢癌患者的預后[8]。circRNA在調節染色質的結構、基因轉錄、蛋白修飾等方面承擔重要角色,其表達異常與糖尿病、類風濕性關節炎、腫瘤等疾病的發生有關[9]。大量研究[10-12]表明,circRNA在卵巢癌中表達升高或降低,與卵巢癌細胞的上皮間質轉化、衰老、凋亡等過程密切相關。例如,circ-SETDB1在紫杉醇耐藥的卵巢癌中高表達,敲低circ-SETDB1可抑制紫杉醇耐藥性卵巢癌細胞的增殖活力、細胞周期進展,誘導細胞凋亡以及對紫杉醇的敏感性,miR-508-3p是circ-SETDB1的靶標[13]。例如,卵巢癌組織和細胞系中circ-CERS6表達顯著降低,過表達circ-CERS6能夠通過作用于miR-630抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化[14]。

為了研究circ-TAGLN在卵巢癌進展中的功能,本研究通過RT-qPCR檢測證實circ-TAGLN在多個卵巢癌細胞系中低表達。在卵巢癌SK-OV-3細胞中過表達circ-TAGLN后,SK-OV-3細胞增殖和侵襲能力均被抑制,提示circ-TAGLN表達上調可能會抑制卵巢癌的進展。隨著分子生物學的發展,circRNA已被證實富含miRNA的互補位點,circRNA能夠發揮miRNA的海綿作用,誘導miRNA的表達沉默,進而在腫瘤的發生、進展過程發揮關鍵作用[15-17]。本研究利用circAtlas數據庫預測顯示,circ-TAGLN與miR-425-5p之間存在結合位點。經雙熒光素酶報告實驗證實,circ-TAGLN能夠靶向結合miR-425-5p。在卵巢癌SK-OV-3細胞中過表達circ-TAGLN后,miR-425-5p表達顯著降低。miR-425-5p是miR-425成熟體的一種,已被證實在結直腸癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等實體瘤中表達上調,miR-425-5p能夠促進惡性腫瘤細胞的增殖和侵襲,抑制細胞凋亡,同時提示患者預后較差[18-20]。ZHAO等[21]研究表明,卵巢癌組織和細胞中miR-425-5p高表達,沉默miR-425-5p表達可有效抑制卵巢癌進展。以上結果表明,circ-TAGLN通過下調miR-425-5p表達抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲。卵巢癌細胞中PI3K/AKT信號通路存在異常激活,miR-425-5p則通過活化PI3K/AKT信號通路促進腫瘤的發生和發展[22-25]。在卵巢癌SK-OV-3細胞中過表達circ-TAGLN后,PI3K/AKT信號通路蛋白表達均顯著下降,進一步表明circ-TAGLN通過miR-425-5p發揮腫瘤抑制作用。

綜上所述,本研究證實circ-TAGLN在卵巢癌細胞系中低表達,過表達circ-TAGLN通過調控miR-425-5p/PI3K/AKT信號通路抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲,circ-TAGLN有望成為卵巢癌的潛在分子治療靶點。