蘆丁調控miR-155和HMGB1/RAGE通路對糖尿病視網膜病變大鼠炎性反應的影響

王雅清,王 勇,劉永勝

(保定市第二醫院內分泌科,河北 保定071051)

糖尿病視網膜病變(Diabetesretinopathy,DR)是一種可導致失明的糖尿病微血管并發癥,近年來其發病率有升高趨勢[1]。目前,激光、手術和玻璃體內注射抗血管內皮生長因子等是臨床治療DR的重要手段,但防治效果并不理想[2]。既往研究[3-5]顯示,具有廣泛藥理活性的天然化合物在防治DR方面有著潛在的臨床研究價值。蘆丁是槐米的主要成分,是一種天然的黃酮苷,具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗病毒等功效,可減輕牙周膜干細胞的炎癥效應[6],但其在治療DR方面的作用并不清楚。本課題擬通過糖尿病大鼠模型,探討蘆丁在 DR中的作用及分子機制,為 DR的預防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物:健康雄性SD大鼠50只(8周齡、體重180～220 g),購于河北大學實驗動物中心,使用許可證號SYXK(冀)2022-009;大鼠在溫度為25～27 ℃、濕度為55%～65%、晝夜交替12 h的環境下自由進食、飲食。本實驗經本院動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2 藥品與試劑:蘆丁(純度≥98%,CAS編號153-18-4),購于長沙禾普生物科技有限公司;伊凡斯蘭購于美國Sigma公司;Trizol、高效放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(組織/細胞)、動物組織/細胞總蛋白提取試劑盒,購于北京索萊寶科技有限公司;兔抗鼠B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(BAX)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體,英國Abcam公司;兔抗鼠剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)多克隆抗體,美國Cell Signal公司;原位末端標記(Tunel)細胞凋亡試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6、IL-1β 酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒,購于江蘇酶免實業有限公司。

1.1.3 儀器:One Touch Ultra血糖測定儀,上海強生醫療器材有限公司生產;Synergy-HT 多功能酶標儀,美國 Bio-Tek 公司生產;Chemi Doc XRS圖像分析系統,美國Bio-Rad公司生產;IX83熒光顯微鏡,日本Olympus公司生產;7500熒光定量 PCR 儀,美國 ABI 公司生產。

1.2 研究方法

1.2.1 造模、分組和給藥:造模前大鼠禁食12 h,可自由飲水,參照文獻[7]以腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素的方法制備糖尿病大鼠模型,注射后3 d尾靜脈取血測量血糖濃度,當血糖濃度>16.7 mmol/L時表示模型制備成功。將造模成功的大鼠隨機分為蘆丁低、中、高劑量組及模型組,分別給予50、100、150 mg/(kg·d)蘆丁及相同劑量的0.9%氯化鈉溶液,正常大鼠20只為對照組,給予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液,持續12周。

1.2.2 血糖儀、伊凡斯蘭實驗分別測定大鼠血糖和視網膜組織中伊凡斯蘭滲透量:給藥干預結束后,隨機選取10只大鼠,禁食12 h后尾靜脈取血,使用血糖測定儀測定大鼠血糖濃度;尾靜脈快速注入20 g/L伊凡斯蘭,2 h后戊巴比妥鈉腹腔麻醉摘取眼球并分離視網膜,參照文獻[8]稱重后,加入甲酰胺65 ℃孵育15 h,低溫高速離心后,收集上清,分光光度計測定628 nm與740 nm處的吸光度值之差,根據標準曲線對伊凡斯蘭進行量化,并以組織蛋白(μg/g)表示。

1.2.3 Tunel法檢測大鼠視網膜組織神經節細胞凋亡:將各組剩余大鼠麻醉處死后,摘取眼球并分離視網膜,部分組織保存于4%多聚甲醛中備用;另一部分組織制成石蠟切片,根據參考文獻[9]洗脫切片后,以含蛋白激酶 K雙蒸水孵育15 min;Tunel反應液避光孵育1 h,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后、封片,使用熒光顯微鏡對凋亡細胞數進行觀察并計算凋亡指數,凋亡指數(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4 免疫印跡技術測定大鼠視網膜組織Bcl-2、BAX及 Cleaved Caspase-3蛋白表達:根據蛋白提取試劑盒說明書提取大鼠視網膜組織總蛋白并以二喹啉甲酸定量后,根據參考文獻[10]將蛋白樣品進行電泳、轉膜、封閉、一抗(Bcl-2、BAX、Cleaved Caspase-3抗體濃度1∶3000)孵育、二抗(1∶5000)孵育、ECL處理后,凝膠成像系統分析Bcl-2、BAX和Cleaved Caspase-3蛋白相對表達水平。

1.2.5 ELISA法檢測大鼠視網膜組織IL-6、TNF-α和IL-1β表達水平:取部分視網膜組織,參考文獻[11]加入組織裂解液,離心收集上清液,定量上清液蛋白后,按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測大鼠視網膜組織中IL-6、TNF-α和IL-1β表達水平。

1.2.6 逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測大鼠視網膜組織中微小RNA(miR)-155和高遷移率族蛋白1(HMGB1)、晚期糖基化終產物受體(RAGE) mRNA表達水平:采用Trizol法提取視網膜組織總RNA,并采用酶標儀測定RNA濃度;根據逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄后,根據參考文獻[12]中的引物進行PCR擴增。其中,miR-155上游引物為5’-UGGGGAUAGUGUUAAUCGUAAUU-3’,下游引物為5’-UGGGGAUAGUGC UAAUCGUAAUU-3’;U6上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;GAPDH上游引物為5’-GGAGTCTACTGGCGTCTT CAC-3’,下游引物為5’-ATGAGCCCTTCCACGATGC-3’;HMGB1上游引物為5’-GTGAGGGAGAGAGTGGGTAAA-3’,下游引物為5’-GCAATCTGAGACCAACCTCACT-3’;RAGE上游引物為5’-CGCCCAGGTCAAGATAGAGC-3’,下游引物為5’-CACCCCACCTGAGGACATTG-3。分別以U6和GAPDH為內參采用2-ΔΔCt法計算視網膜組織中miR-155和HMGB1、RAGE mRNA表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠血糖水平和視網膜組織中伊凡斯蘭滲透量比較 模型組和對照組比較,大鼠血糖水平和視網膜組織中伊凡斯蘭滲透量均明顯升高(均P<0.05);且與模型組比較,蘆丁低劑量組、蘆丁中劑量組、蘆丁高劑量組三組大鼠上述指標呈劑量依賴性降低(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血糖水平和視網膜組織中伊凡斯蘭滲透量比較

2.2 各組大鼠視網膜神經節細胞凋亡情況比較 模型組和對照組比較,大鼠視網膜神經節細胞凋亡指數明顯升高(P<0.05);且與模型組比較,蘆丁低劑量組、蘆丁中劑量組、蘆丁高劑量組三組大鼠上述指標呈劑量依賴性降低(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠視網膜神經節細胞凋亡指數比較(%)

2.3 各組大鼠視網膜組織中BAX、Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平比較 與對照組相比,模型組BAX和Cleaved Caspase-3表達水平均顯著升高,Bcl-2的表達則顯著降低(均P<0.05)。與模型組相比,蘆丁低劑量組、蘆丁中劑量組、蘆丁高劑量組三組大鼠的 BAX和Cleaved Caspase-3表達水平呈濃度依賴性降低;相反,Bcl-2表達水平呈濃度依賴性升高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠視網膜組織中BAX、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較

2.4 各組大鼠視網膜組織中IL-6、TNF-α和IL-1β表達水平比較 與對照組比較,模型組大鼠視網膜組織中IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明顯升高(均P<0.05);與模型組比較,蘆丁低劑量組、蘆丁中劑量組、蘆丁高劑量組大鼠上述指標均呈劑量依賴性降低(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠視網膜組織中IL-6、TNF-α和IL-1β表達水平比較(ng/g)

2.5 各組大鼠視網膜組織中miR-155和HMGB1、RAGE mRNA表達水平比較 模型組和對照組比較,大鼠視網膜組織中miR-155和HMGB1、RAGE mRNA水平均明顯升高(均P<0.05);與模型組比較,蘆丁低劑量組、蘆丁中劑量組、蘆丁高劑量組三組大鼠上述指標呈濃度依賴性降低(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠視網膜組織中miR-155和HMGB1、RAGE mRNA表達水平比較

3 討 論

蘆丁又名蕓香苷、紫槲皮苷,是一種來源很廣的黃酮類化合物,是一種生物活性很強、臨床應用廣泛的中藥。大量研究發現蘆丁的藥理作用比較廣泛,能夠很好地抑制自由基活性,抑制脂質過氧化,抗病毒,還能夠治療急性胰腺炎,可以被廣泛地應用在各種疾病上[13-15]。蘆丁是一種具有抗氧化作用的自然產物,它具有多種藥理學作用,如消炎、抗病毒、防治心腦血管病等。研究指出,蘆丁可能是一種抑癌物質,可延緩大鼠癌癥的發展同時減弱其炎癥效應[16];此外蘆丁在治療潰瘍性結腸炎小鼠的炎癥效應方面顯示出良好療效,可顯著降低模型小鼠的炎癥因子表達[17]。

DR的發生、發展與炎癥因子息息相關,通過藥物治療減輕炎性反應可有效控制糖尿病視網膜病變的進一步發展。當視網膜組織受到病理性刺激或損傷時,細胞間隙可能會擴大,導致注入的伊凡斯蘭能夠滲透到組織中。因此,伊凡斯蘭滲透量可以用來間接評估視網膜組織的血管損傷程度,視網膜神經節細胞凋亡指數可用于評價神經節細胞凋亡程度。研究結果表明,經蘆丁干預的三組大鼠血糖水平、組織蛋白含量、視網膜神經節細胞凋亡指數與未經蘆丁干預的模型組大鼠相比明顯下降,這代表蘆丁干預可加速血糖代謝,減輕視網膜組織損傷。表明蘆丁可通過抑制視網膜組織炎性反應和神經節細胞凋亡改善視網膜組織損傷,延緩DR。

Bcl-2為凋亡抑制因子,可與蛋白質發生二聚化,抑制細胞凋亡;BAX為促凋亡因子,可增加細胞色素 C釋放,引起Caspase-9活化,進而引起其他Caspase家族成員的活化,引起細胞凋亡。當Caspase蛋白被活化時,其N-端前肽與較大亞基間的特異性位點發生水解,然后在較大亞基間裂開,釋放較大的基團,從而生成具有較強生物活性的異源四聚物,這時Caspase-3會被一種外源蛋白質所剪切并活化[18-19]。研究發現,與未使用蘆丁干預的模型組大鼠相比,三組經蘆丁干預的大鼠促凋亡蛋白BAX、Cleaved Caspase-3表達下降,抗凋亡Bcl-2表達升高,表明蘆丁可降低糖尿病大鼠促凋亡蛋白BAX、Cleaved Caspase-3表達,減少細胞凋亡。據此,我們推測:蘆丁可能通過上調 BAX和抑制Bcl-2的表達,發揮其抗癌效應。

miR-155是一種重要的促炎miRNA,可通過抑制其表達減輕炎癥,保護視網膜功能[20]。HMGB1/RAGE通路是一種與炎癥、免疫應答和疾病發展密切相關的生物通路,當細胞受到損傷或感染時,HMGB1釋放到胞外并與RAGE結合,導致免疫細胞的激活和炎癥介質的釋放,這一過程有助于免疫系統應對感染和損傷,但也可能導致慢性炎癥和自身免疫疾病。HMGB1是一種重要的轉錄調節因子,可激活HMGB1/RAGE信號通路介導的炎性反應。被激活后可通過促進IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達加重病變部位的炎癥損傷,還可上調BAX表達促進細胞凋亡,此外 HMGB1還可介導糖尿病視網膜血管病變與神經病變,并調控Caspase蛋白的表達[21]。RAGE是一種受體,它能夠與HMGB1結合,觸發細胞內信號傳導通路,導致炎癥和免疫應答。HMGB1是天然免疫受體中作用最強的一種蛋白,是炎癥通路上游的重要的因子,可通過激活RAGE在DR進展中發揮著重要作用[22-25]。本研究結果顯示miR-155、HMGB1、RAGE水平,以及IL-6、TNF-α、IL-1β炎癥因子水平在糖尿病大鼠視網膜中升高,經蘆丁干預后,以上指標均下降,炎性反應減輕,且下降水平與蘆丁劑量呈相關性,表明蘆丁干預可降低糖尿病大鼠視網膜組織中miR-155和HMGB1、RAGE mRNA表達,降低炎性因子水平,這提示蘆丁可能通過抑制miR-155和HMGB1/RAGE通路,減輕視網膜組織炎性反應和凋亡,進而延緩DR。

綜上所述,蘆丁干預可改善DR大鼠視網膜細胞損傷,減輕炎性反應,延緩DR進展。其藥理機制可能與抑制miR-155和HMGB1/RAGE通路激活,減少炎性因子釋放有關。本研究為蘆丁臨床應用于延緩DR提供了理論依據,同時也為后期的新藥靶點的選擇提供見解,但是本次研究為動物實驗,還需進一步研究探討其作用機制與療效。