三金通淋排石顆粒質量標準的研究*

唐莉華 黃學娣 蔣司晨 李 凡

三金通淋排石湯是院內泌尿外科依據經典名方八正散合岳美中老中醫驗方三金二石湯,同時結合科室多年臨床經驗化裁而成[1,2],具有清熱利濕、通淋排石、涼血止血之功效,經過長期臨床實踐應用,其療效確切、安全性高,已成為院內臨床治療濕熱蘊結證之石淋的協定處方。由于該方傳統水煎劑質量不穩定,無法滿足臨床患者的治療需求,現利用現代化制藥技術,對三金通淋排石湯進行顆粒制劑工藝的研究,但仍未建立其制劑相關質量控制標準。為了建立三金通淋排石顆粒的質量標準,本研究參考《中華人民共和國藥典》[3]和文獻研究[4,5],應用薄層色譜法建立了三金通淋排石顆粒中炒梔子和雞內金的定性鑒別方法,同時利用高效液相色譜法建立了三金通淋排石顆粒指標性成分梔子苷的含量測定方法,保障中藥顆粒制劑質量可控性的同時,提高了臨床用藥的安全性和有效性,為醫院制劑的質量標準提供了實驗依據。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀、自動進樣器、紫外檢測器(Agilent 1260);電子分析天平(FA2204B,濟南歐萊博技術有限公司);恒溫干燥箱(DHG-9146A,蘇州威爾試驗用品有限公司);超聲波清洗機(SAKEZI-22SX,上海佰博儀器有限公司);硅膠G板(青島海洋化工,0.20～0.25 mm)、硅膠GF254板(青島海洋化工,0.20～0.25 mm),聚酰胺薄膜(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠);甲醇、乙腈為色譜純,磷酸為分析純,水為超純水;梔子苷對照品(批號:110749-201919)、雞內金對照藥材(批號:121153-201002),由中國食品藥品檢定研究院購入;三金通淋排石顆粒(批號:001、002、003,自制)。

2 方法與結果

2.1 炒梔子中梔子苷的鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備取本品5 g,研細后,加50%甲醇50 ml,超聲處理40 min,濾過后并蒸干,殘渣加水25 ml使之溶解,再用乙酸乙酯振搖并提取3次,每次用量為20 ml,合并提取液后蒸干,殘渣加甲醇1 ml溶解,即為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備取梔子苷的對照品,加甲醇制成1 mg/ml的對照品溶液。

2.1.3 缺炒梔子陰性對照品溶液的制備稱取缺炒梔子的陰性樣品適量,按照“2.1.1”項下同法制成缺炒梔子的陰性對照溶液。

2.1.4 專屬性鑒別按照薄層色譜法[3]實驗,吸取上述供試品溶液、缺炒梔子陰性對照品溶液各10 μl、對照品溶液8 μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開劑,展開后取出并晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點顯色清晰,置于日光下檢視。從梔子苷色譜圖中可以看出,三金通淋排石顆粒樣品與梔子苷對照品相應的位置上,均可見相同顏色的斑點,缺炒梔子陰性對照品相應位置上未出現干擾影響,說明該方法專屬性良好。見圖1。

注:1,2,5.供試品;3.對照品;4.陰性對照品。圖1 炒梔子中梔子苷TLC圖譜

2.2 雞內金的鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備取本品1.5 g,研細,加乙醇50 ml,加熱回流30 min,放冷后過濾,濾液蒸干,殘渣加水20 ml,微熱使溶解,用三氯甲烷分別提取2次,每次用量為15 ml,合并提取液后蒸干,殘渣加甲醇1 ml使之溶解,即為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備取雞內金的對照藥材1 g,按照“2.2.1”項下同法制成對照品的溶液。

2.2.3 缺雞內金陰性對照品溶液的制備稱取缺雞內金的陰性樣品適量,按照“2.2.1”項下同法制成缺雞內金的陰性對照品溶液。

2.2.4 專屬性鑒別按照薄層色譜法[3]實驗,吸取上述供試品溶液、缺雞內金陰性對照品溶液、對照藥材溶液各10 μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-丙酮-甲酸(10∶4∶1.6)為展開劑,展開后取出并晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點顯色清晰,置于紫外光燈(365 nm)下檢視。從雞內金色譜圖中可以看出,三金通淋排石顆粒樣品與雞內金對照藥材相應的位置上,均可見相同顏色的熒光斑點,缺雞內金陰性對照品相應位置上未出現干擾影響,說明該方法專屬性良好。見圖2。

注:1,2,5.供試品;3.對照品;4.陰性對照品圖2 雞內金TLC圖譜

2.3 梔子苷的含量測定

2.3.1 色譜條件色譜柱為Welch C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-水(10∶90)為流動相。流速:1.0 ml/min,柱溫:30 ℃,檢測波長:238 nm,進樣量:10 μl,理論板數按梔子苷峰計應不低于1500。

2.3.2 對照品溶液的制備取梔子苷的對照品適量,精密稱定后加入甲醇,制成1 ml含梔子苷60 μg的溶液,即得對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備取三金通淋排石顆粒適量,研細后取約1 g,精密稱定后加入甲醇50 ml,再精密稱定重量,超聲處理20 min(功率350 W,頻率50 kHz),放冷后稱定重量,再使用甲醇補足減少的重量,搖勻后再過濾,留取續濾液,即得供試品溶液。

2.3.4 陰性對照品溶液的制備按照三金通淋排石顆粒處方和工藝制備方法,制成缺炒梔子的樣品,再按照“2.3.3”項下同法制備,即得陰性對照品溶液。

2.3.5 專屬性試驗精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液以及缺炒梔子的陰性對照品溶液各10 μl,按照“2.3.1”項下色譜條件,分別進行測定后記錄色譜圖。見圖3。實驗結果可見,梔子苷對照品色譜(圖3A)與三金通淋排石顆粒供試品溶液色譜(圖3B)在相同保留時間(梔子苷保留時間約在14 min)有對應的色譜峰,峰形良好且與其他各峰分離度高,陰性對照樣品色譜(圖3C)在相同保留時間(14 min)無對應的色譜峰。表明本實驗方法專屬性良好,陰性對照品色譜不干擾本實驗方法的測定。

圖3 梔子苷對照品(A) 三金通淋排石顆粒供試品(B)和缺炒梔子陰性樣品(C)

2.3.6 方法學考察線性關系。精密吸取梔子苷對照品溶液(濃度為41.8 μg/ml)1 μl、2 μl、4 μl、6 μl、8 μl和10 μl,按照“2.3.1”項下色譜條件分別進行測定,同時記錄峰面積。以梔子苷的進樣量(ng)為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線并進行線性回歸,得到回歸方程為y=1.4339x+22.69,R2=0.9992。實驗數據結果表明,梔子苷進樣量在130.1～1301.1 ng范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

精密度。實驗精密吸取梔子苷的對照品溶液10 μl,按照“2.3.1”項下色譜條件分別進樣6次,同時記錄峰面積,計算相對標準偏差(RSD)為0.58%。實驗數據結果示儀器精密度良好,能滿足三金通淋排石顆粒中梔子苷含量測定的要求。

重復性實驗。分別取三金通淋排石顆粒(批號:001)6份,每份約1 g,按照“2.3.3”項下同法制備6份供試品溶液,再按照“2.3.1”項下色譜條件分別進行測定,計算梔子苷平均含量為2.88 mg/g,RSD為0.94%。實驗數據結果示,該實驗方法的重復性良好。

穩定性實驗。稱取三金通淋排石顆粒(批號:001)約1 g,按照“2.3.3”項下同法制備供試品溶液,于室溫下放置0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h以后,分別精密吸取供試品溶液各10 μl,按照“2.3.1”項下色譜條件進行測定,同時記錄峰面積,計算RSD為0.73%。實驗數據結果示,供試品溶液在室溫條件下放置24 h,其穩定性良好。

加樣回收率實驗。取三金通淋排石顆粒(批號:001,1 g含梔子苷2.88 mg)6份,精密稱定0.50 g后置錐形瓶中,分別精密加入梔子苷的對照品溶液1 ml(1 ml含梔子苷1.5555 mg),按照“2.3.3”項下同法,制成加樣回收樣品溶液,再按照“2.3.1”項下色譜條件分別進行測定,同時記錄峰面積,計算加樣回收率平均值為98.75%,RSD為0.61%。見表1。實驗數據結果示本實驗方法準確度良好。

表1 加樣回收率實驗結果

2.3.7 樣品的測定取三金通淋排石顆粒(批號:001、002、003,每批次3份)共9份,每份約1 g,按照“2.3.3”項下同法制備成樣品溶液,再按照“2.3.1”項下色譜條件分別進行測定,同時記錄峰面積,計算三金通淋排石顆粒中梔子苷的平均含量為2.85 mg/g。見表2。

表2 梔子苷的含量測定結果

3 討論與分析

三金通淋排石湯為院內長期協定處方,隨著臨床廣泛應用,湯劑的不足之處愈發凸顯。中藥顆粒劑是傳統中藥劑型變化的一個新方向,顆粒劑在生產過程和臨床應用中,繼承了傳統湯劑吸收迅速、起效快的特點,又克服了傳統湯劑煎煮不便、用量大、易變質等缺點,具有質量穩定、服用方便等優點[6]。其處方組成固定、制備工藝的穩定性,對于中藥制劑的質量控制,有著不可或缺的作用。

3.1 定性質量研究中藥制劑指標性成分或物質的定性質量研究,主要針對指標性成分或物質的鑒別,薄層色譜法具有操作簡單、分析速度快、結果直觀顯著、成本低廉等特點,并且可同時鑒別多個樣品,具有分離和鑒別的雙重功能,在中藥制劑定性質量控制中有著不可替代的地位[7]。本研究參考《中華人民共和國藥典》[3]和文獻報道[8],利用薄層色譜法對制劑處方中全部飲片進行鑒別。其中君藥金錢草、海金沙,臣藥車前子、石韋、萹蓄、瞿麥,佐藥川牛膝在分別選擇指標性成分和對照藥材的情況下,缺陰性樣品與供試品色譜專屬性不強,陰性存在干擾;在改變樣品提取方法和展開條件后,其效果仍不明顯,故均未納入質量標準。同時采用多因素(薄層板、溫度、濕度)評價炒梔子和雞內金的定性鑒別方法,其重現性好,耐用性佳,可納入三金通淋排石顆粒的定性質量控制。

3.2 定量質量研究中藥制劑指標性成分的定量質量研究,主要針對飲片指標性成分的含量測定。高效液相色譜法目前在藥品研發、生產、質控、監督等領域有著不可或缺的地位,在藥品真偽鑒定、指標性成分含量測定、藥品純度監測等方面,已成為藥品檢驗的主流分析方法[9]。其適應范圍廣、分析速度快、分離效率高、重現性好等特點,也廣泛應用于中藥制劑的定量測定[10]。本研究參考《中華人民共和國藥典》[3]和文獻報道[4,5,11,12],君藥金錢草(槲皮素、山柰酚)與臣藥車前子(京尼平苷酸、毛蕊花糖苷)的陰性對照均存在干擾,不適宜作為三金通淋排石顆粒指標性成分的定性研究對象,故均未納入質量標準。由于高效液相色譜法樣品取樣量少,中藥指標性成分的濃度通常較低,為了保證所建立的分析方法的可行性與可靠性,通過方法學(線性關系、精密度實驗、穩定性實驗、重現性實驗、回收率實驗等)的驗證[13],證明了制劑中梔子苷含量測定的分析方法專屬性強、重復性好、穩定性佳、準確度高,可納入三金通淋排石顆粒的定量質量控制。

3.3 梔子苷含量限度研究《中華人民共和國藥典》[3]炒梔子項下規定:水分不得過8.5%,干燥品含梔子苷(C17H24O10)不得少于1.5%。三金通淋排石顆粒每1 g含炒梔子0.15 g,充分考慮大生產環節中的飲片損耗等因素,梔子苷的轉移率以60%為標準(制劑工藝研究梔子苷轉移率為67%),得出本品每1 g含梔子苷為1.24 mg。故擬將三金通淋排石顆粒含量限度定為: 每克含炒梔子的量,以梔子苷(C17H24O10)計,不得少于1.24 mg。

本研究運用薄層色譜法建立了三金通淋排石顆粒炒梔子和雞內金的定性鑒別方法,同時運用高效液相色譜法建立了梔子苷的含量測定與含量限度,實驗方法操作簡便,專屬性強,重現性佳,可用于三金通淋排石顆粒定性定量的質量控制。