高溫脅迫下厚殼貽貝(Mytilus coruscus)消化腺代謝組學研究*

郭 鋒 王玉霞 董震宇 姚榮輝 王偉峰 葉瑩瑩嚴小軍, 郭寶英, ①

(1. 國家海洋設施養殖工程技術研究中心 浙江舟山 316022; 2. 浙江海洋大學海洋科學與技術學院 浙江舟山 316022)

近幾十年來, 全球變暖現象持續加劇, 海水溫度長期以來一直被認為是影響潮間帶海洋生物生長、生存、發育和繁殖的重要非生物因素(Jansenetal, 2007;Guoetal, 2020)。潮間帶貝類生活在巖石上, 活動范圍有限, 而貝類作為變溫動物, 適應環境溫度變化的能力被認為是它們適應自然環境的主要決定因素。預計到22 世紀末, 全球海洋溫度將上升1～4 °C, 可能導致貝類產生生理應激反應(Maulvaultetal, 2018;Alfonsoetal, 2021)。氣溫持續上升, 極端熱浪事件頻率增加(Smithetal, 2023)等全球變暖正影響著世界各地的動物群落, 而潮間帶貝類對溫度等環境因素的變化極為敏感(姜高偉等, 2021)。為了預測在全球氣候變化背景下海洋生物的命運, 特別是對于生活在極端或溫度波動環境中的生物, 需重點研究它們對棲息地的生理適應。由于氣候變化, 季節性水溫持續上升, 導致溫度變化和極端事件變得日益頻繁, 尤其是夏季溫度和極端熱浪事件的頻率正在增加(Sokolovaetal, 2012; Vasseuretal, 2014; Jacoxetal, 2020), 在貽貝和藤壺等物種中觀察到與熱相關的大規模死亡事件, 這些物種調節體溫和行為的能力有限。潮間帶貝類成為適應極端溫度的模式物種。對這些物種的研究可能對變溫動物應對全球變暖的機制提供重要啟示。因此, 由人類活動引起的氣候變化正在進一步加劇全球平均溫度和極端溫度事件的頻率, 導致生物多樣性和生物地理分布的變化, 溫度適應性問題變得越來越重要(Zippayetal, 2012; van de Poletal,2017; Zhangetal, 2020)。

代謝組研究是一種系統性的方法, 通過對生物樣本中的小分子化合物進行分析和比較, 可以揭示生物體在不同生理狀態下的代謝特征(Courantetal,2014; Zhaoetal, 2014)。生物代謝組學分析已被用于包括生態毒理學在內的許多領域, 用于評估暴露于不同污染物的生物體的亞致死變化, 揭示新的生態毒理學效應, 并假設暴露的生物標志物(Lankaduraiet al, 2013; Serra-Compteetal, 2019)。Costa 等(2008)的研究表明, 水溫等環境條件的變化或貽貝的繁殖周期可能會影響它們對化學污染的反應。代謝組學分析已經被廣泛應用在海洋無脊椎動物的檢測中, 例如,Gui 等(2016)在運用代謝組學發現綠唇貽貝(Perna canaliculus)采捕后和運輸后, 貽貝血淋巴和肝胰腺中大量代謝物與對照相比存在差異。這些代謝產物一般參與能量代謝、氨基酸代謝、蛋白質降解和脂肪酸代謝等過程(Guietal, 2016)。Yang 等(2019)基于代謝組學的分析, 探究馬氏珠母貝(Pinctadafucatamartensii)在不同飼料喂養下代謝物的變化, 綜合關鍵代謝途徑分析表明, C45P25 調節淀粉和蔗糖代謝、甘氨酸、谷氨酸代謝、天冬氨酸、丙氨酸以及絲氨酸和蘇氨酸代謝, 以滿足能量需求, 增加生糖氨基酸。Dumas 等(2020)應用代謝組學方法揭示了地中海貽貝暴露于污水處理廠廢水提取物的代謝途徑, 突出的代謝物主要是氨基酸代謝(如脯氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)與神經激素(多巴胺和5-羥色胺代謝物)等, 還有一種成分涉及氧化應激防御(氧化谷胱甘肽) (Dumasetal, 2020)。在厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)代謝組研究方面, 范孝俊等(2023)通過開展厚殼貽貝外套膜進行急性酸性環境下的我代謝組的分析, 推測厚殼貽貝通過促進尿素合成, 增強細胞膜流動性, 并加強滲透壓調節和鈣離子運輸等方式來應對海洋酸化威脅的代謝途徑。這些代謝產物的調節可以反映能量代謝、DNA 和RNA 合成、免疫系統、滲透調節、足絲形成和生殖等生物過程的變化, 這些變化可能會對生物體的適應性造成一些負面影響(G?tzeetal, 2020; 范孝俊等, 2023)。

厚殼貽貝隸屬于軟體動物門(Mollusca), 雙殼綱(Bivalvia), 貽貝目(Mytilida), 貽貝科(Mytilidae), 貽貝屬(Mytilus), 主要分布于東亞溫帶海域, 包括我國東海、黃海、渤海等, 主要集中在浙江省舟山市嵊泗縣養殖, 是我國具經濟價值的海洋養殖貝類之一(常抗美等, 2007; 袁文斌等, 2017; 劉碩博等, 2019)。溫度是影響水生動物生理過程的重要因素之一, 溫度變化對軟體動物生理代謝和基因表達有顯著影響(姚翠鸞等, 2015; 楊東敏等, 2017; 姜高偉等, 2021; 張元等, 2022)。在全球變暖的環境下, 海洋暖化、海洋熱浪事件也偶有發生, 由此造成的貝類大量死亡事件也越來越多, 給水產養殖業帶來巨大損失(江天棋等, 2020)。盡管許多研究表明高溫嚴重影響著海洋生物的各種生命過程, 但對于海洋雙殼貝類如何應對熱應激的研究仍然不足。基于此, 本研究選取厚殼貽貝作為研究對象, 對厚殼貽貝消化腺響應熱應激的代謝途徑進行研究, 為闡明厚殼貽貝消化腺應對熱應激的調節機制提供一定啟示, 也為其耐熱品種的選育提供豐富的遺傳材料和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品材料采集與處理

厚殼貽貝是由中國浙江舟山市嵊泗縣的養殖基地購買, 并在溫度為(18±0.5) °C 的100 L 充氣水箱中馴化。在馴化期間, 水箱內的海水用氣泵進行不間斷的充氣, 水箱內的海水每天更換一次, 以螺旋藻粉為飼料(1 g/m3), 定時投飼(18:30)。馴化時間為一周, 馴化期間光照與黑暗控制在12 h : 12 h, 海水鹽度為25,pH 8±0.2, 溶解氧(7±0.5) mg/L。將其從溫度為18 °C的暫養水箱隨機分到實驗水箱中, 一共三個實驗組,分別為: 熱應激組33 °C, 緩溫脅迫組26 °C 和對照組18 °C, 溫度設定是根據水產養殖經驗和自然環境實際情況得出的理想溫度范圍(15～25 °C, 26 °C 為緩慢應激溫度)。在特別低潮期間, 水溫接近于周圍空氣的溫度。在低潮與惡劣天氣條件同時出現的情況下, 貽貝棲息地的水溫有可能驟升至30 °C 甚至更高。每組三個水箱, 在熱應激12 h 取樣, 然后使用干冰將溫度處理然后使用干冰將溫度處理過的厚殼貽貝消化腺組織運輸至華大基因完成非靶向代謝組測序。

1.2 代謝物的提取

在提取厚殼貽貝消化腺組織的代謝物時, 需要進行預冷處理, 所有提取試劑將被置于-20 °C。首先,我們在組織樣本加入標簽為(L-2-氯苯丙氨酸, 濃度為0.06 mg/mL)的甲醇溶液中, 并加入比例為4∶1 的甲醇與混合水溶液。然后, 使用研磨器以60 Hz 的頻率進行研磨處理(持續 2 min), 之后將樣品離心(10 000×g, 4 °C, 持續10 min), 并取上清液進行冷凍干燥。隨后, 使用甲醇與混合水溶液將冷凍干燥后的樣品復溶。將復溶后的樣品在-20 °C 下靜置2 h, 然后再次離心(10 000×g, 4 °C, 持續10 min), 取其上清液。為了分析提取的代謝物, 使用0.22 μm 濾膜對上清液進行過濾, 然后將樣品進行超高液相色譜-串聯質譜分析。在分析過程中, 我們對兩種不同條件下的貽貝(對照組和實驗組)的消化腺組織進行了6 次獨立的重復實驗。每一組實驗代表了一次獨立的實驗, 共進行了6 次獨立的實驗, 并且使用了由全樣本混合制備的質控樣品。

1.3 LC-MS/MS 分析

LC-MS/MS (液相色譜與串聯質譜聯用)技術是一種分析化學技術。本實驗的樣品分離和檢測采用了UPLC 串聯QExactive 高分辨質譜儀。儀器每10 個樣本穿插一個QC 樣本。采用LECO 公司的ChromaTOF4.33x 軟件和 LECO-fiehnRtx5 數據庫進行對峰進行分析。具體的實驗步驟參考Zhang 等(2021)的研究方法。

1.4 數據處理與分析

LC-MS/MS 技術能夠獲得大量的質譜原始數據,這些數據需要經過數據處理才能得到有用的信息。本實驗使用了Thermo Fisher Scientific 公司的Compound Discoverer 3.1 軟件對實驗數據進行處理。在代謝物鑒定方面結合了BMDB 數據庫(華大代謝組數據庫)、mzCloud、HMDB、ChemSpider、LipidMaps 和KEGG等多個數據庫進行鑒定。篩選條件為母離子的質量偏差(Precursor Mass Tolerance) ＜ 5 ppm (Part Per Million, 質譜儀的精度單位), 碎片離子的質量偏差(Fragment Mass Tolerance) ＜ 10 ppm, 保留時間偏差(RT Tolerance) ＜0.2 min, 確保鑒定結果的準確性和可靠性。將Compound Discoverer 3.1 導出的結果, 導入metaX 進行數據預處理。本實驗采用了log2對數轉換和 Pareto scaling 的方法進行數據處理, 應用Pareto scaling 的方法對數據進行比例調整。PCA (主成分分析)和OPLS-DA (潛在結構鑒別分析的正交投影)由SIMCA14 軟件包(Umetrics, Umea, 瑞典)執行。運用OPLS-DA 對分組進行有效分離, 采用PCA 對原始數據進行分布。本文通過構建代謝產物變化的熱圖,運用直觀的可視化來獲取這些代謝產物的豐度(低/高)。PLS-DA 模型第一主成分的 VIP 值(Variable Importance in the Projection, VIP＞1)被認為是篩選差異代謝物的第一參數。對剩余變量的評價采用T 檢驗(Student’s T 檢驗), FC (fold change)值為兩組之間的差異倍數, 去掉兩組之間P＞0.05 的差異代謝物。研究使用KEGG 數據庫對差異代謝物進行信號通路的富集分析, 篩選代謝通路為顯著富集的代謝通路的標準為P＜0.05。

2 結果

2.1 多元統計分析結果

對所有組的消化腺組織樣本進行PCA 分析, 置信區間為95%。在正離子檢測模式下, 研究結果表明CT-18 VS ST-26、CT-18 VS HT-33 和ST-26 VS HT-33的第一主成分和第二主成分呈顯著分離, 每個主成分分別解釋了26.17%和17.28%、26.26%和13.73%、22.61%和18.26%的變異(圖1a); 在負離子檢測模式下, 研究結果表明CT-18 VS ST-26、CT-18 VS HT-33和ST-26 VS HT-33 的第一主成分和第二主成分呈顯著分離, 每個主成分分別解釋了27.04%和16.93%、27.25%和14.28%、23.94%和17.31%的變異(圖1b), 表明對照組和實驗組樣品中的代謝物存在顯著變化。

圖1 經過熱脅迫處理后, 實驗組和對照組厚殼貽貝消化腺組織的代謝物在正負離子模式下PCA 得分圖Fig.1 PCA score plots of metabolites from digestive gland tissues of M. coruscus in experimental and control groups in positive and negative ion mode after heat stress treatment

PLS-DA 是一種有監督的統計方法, 它是根據樣品中代謝物的表達量來進行分類預測。通過這種方法可以有效地將不同樣品分到不同的組別中, 從而更好地理解樣品之間的差異和分類情況。PLS-DA 模型分析進一步顯示, 在正負兩種離子模式下, 不同的組別間均存在顯著差異, 說明熱應激引起了厚殼貽貝消化腺代謝表型的改變。在正離子檢測和鑒定下, CT-18 VS ST-26、CT-18 VS HT-33 和ST-26 VS HT-33 的R2和Q2 的截距值分別為0.98 和-0.77, 0.98 和-0.69, 0.98和-0.67 (圖2a); 在負離子檢測和鑒定下, CT-18 VS ST-26、CT-18 VS HT-33 和ST-26 VS HT-33 的R2 和Q2 的截距值分別為0.98 和-0.810.99 和-0.74、0.98 和-0.80 (圖2b), 表明模型可靠穩定, 且沒有過擬合。

圖2 厚殼貽貝消化腺中的代謝物在正、負離子模式下對照組和實驗組兩兩比較的PLS-DA 分析模型的得分圖Fig.2 Score plots of PLS-DA analytical model for two-by-two comparison of metabolites in digestive glands of thick-shelled mussels in positive and negative ion modes for control and experimental groups

2.2 差異代謝物篩選與注釋

與熱刺激過實驗組貽貝和對照組貽貝相比, 熱刺激導致了厚殼貽貝機體內許多代謝物的改變。在正離子和負離子檢測模式下, 對CT-18、ST-26、HT-33以及CT-18、HT-26、ST-26、HT-33 等不同溫度組合進行了代謝物分析。結果顯示, 在正離子模式下,CT-18 VS ST-26 產生了732 種代謝物的變化; CT-18 VS HT-33 有539 種代謝物的變化; ST-26 VS HT-33產生了496 種代謝物的變化。在負離子模式下, CT-18 VS ST-26 有274 種代謝物的變化, 166 種減少; CT-18 VS HT-26 產生了263 種代謝物的變化; ST-26 VS HT-33 產生了174 種代謝物的變化。這些結果揭示了不同貽貝組合之間的代謝物變化情況(表1)。因此, 該方法和結果是可靠的, 雙離子模式下, 各實驗組與對照組之間具有顯著差異的代謝物數量如火山圖所示(圖3a, 3b)。

表1 厚殼貽貝消化腺代謝組學測序差異代謝物的統計表Tab.1 Differential metabolites of metabolomics sequencing in digestive glands of M. coruscus

圖3 熱脅迫處理后, 實驗組和對照組厚殼貽貝消化腺差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano plot of differential metabolites in digestive glands of M. coruscus in the experimental and control groups after heat stress treatment

2.3 代謝通路富集與聚類

在雙離子模式下, 我們對獲得的差異顯著的代謝物進行了層次聚類分析, 如圖4a 和圖4b 所示。研究結果顯示, 在對照組和實驗組之間存在著代謝物含量方面的顯著差異。高溫脅迫處理組與對照組相比,高溫脅迫實驗組聚類關聯性良好。

圖4 經熱脅迫處理后, 厚殼貽貝消化腺的差異代謝物層次聚類熱圖Fig.4 The heat map of hierarchical clustering analysis of significantly different metabolites in outer coat membrane of M. coruscus after heat stress treatment

KEGG 富集分析用于探索差異代謝物的潛在代謝途徑。在正離子模式下, 共發現73 條信號通路, 其中有12 條顯著(P＜0.05)。具體來說, CT-18 對比ST-26顯示出鞘脂類代謝和視黃醇新陳代謝, CT-18 對比HT-33 中有酪氨酸、亞油酸和丙氨酸新陳代謝的變化,ST-26 對比HT-33 中有多個代謝通路發生變化(圖5a)。在負離子模式下, 共發現71 條信號通路, 其中有17 條顯著(P＜0.05)。具體來看, CT-18 對比ST-26表現出牛磺酸和次牛磺酸代謝、神經活性配體-受體相互作用、不飽和脂肪酸的生物合成的顯著變化;CT-18 對比HT-26 中, 酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸代謝有顯著差異; ST-26 對比HT-33 中則有咖啡因代謝等代謝通路的顯著差異(圖5b)。

圖5 經熱脅迫處理后, 厚殼貽貝消化腺差異代謝物的代謝通路富集分析氣泡圖Fig.5 The bubble plot of metabolic pathway enrichment analysis of differential metabolites in digestive gland of M. coruscus after heat stress treatment

3 討論

在全球變暖的情況下, 不斷上升的溫度可能構成熱應激, 進而導致生物機體做出不同的反應(Paraskevopoulouetal, 2018)。對于水生動物來說, 調節代謝水平是適應溫度變化的重要機制之一。這是因為代謝水平的調節能夠影響細胞產生能量和生成關鍵代謝物, 從而幫助維持身體內部環境的穩定狀態(Liangetal, 2021)。潮間帶軟體動物適應溫度升高的機制在水生生物研究中越來越受到關注, 其對水溫的適應范圍十分有限, 超過一定水溫限度會對其生理功能造成紊亂, 也會導致貝類的生長代謝速率和免疫功能被抑制, 影響其生存能力和地理分布(Weigeletal, 2016)。而東海潮間帶的海表溫度每年變化在8～27 °C 之間(鞠霞等, 2013), 本研究在前期通過查閱相關文獻資料和做與溫度有關的預實驗, 實驗結果顯示20～26 °C 比較適合厚殼貽貝生存。18 °C 是在厚殼貽貝被帶進實驗室時的海表溫度, 因此, 18 °C 作為對照組溫度。之所以選擇26 °C, 是因為其代表了厚殼貽貝在該地區夏季可能經歷的最高溫度。最后, 33 °C 則是該地區可能經歷的極端溫度(Liaoetal, 2019)。

基于代謝組學研究結果發現, 在對照組和實驗組之間存在著代謝物含量方面的顯著差異, 這意味著不同溫度對厚殼貽貝消化腺中的代謝產物具有明顯的調控作用。具體來說, 經過層次聚類分析, 我們觀察到代謝物在樣本之間的聚類模式呈現出明確的趨勢, 揭示了它們在不同條件下的表達變化。尤其值得注意的是, 與對照組相比, 高溫脅迫實驗組的代謝物差異聚類表現出良好的關聯性, 這表明高溫脅迫處理對厚殼貽貝消化腺的代謝網絡產生了顯著影響,并導致了一系列代謝物水平上的變化。

KEGG 富集在以下代謝通路中, 例如在ST-26 VS HT-33 中發現“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(map00400)”, CT-18 VS ST-26 中發現“鞘脂類代謝(map00600)”, CT-18 VS HT-33 中發現“酪氨酸代謝(map00350)”。基于前期所研究轉錄組與代謝組學聯合分析(Wangetal, 2023), 發現色氨酸代謝通路代謝物和差異基因上調明顯, 這些基因參與的通路也包括能量代謝, 而TCA 循環作為生物機體重要的能量代謝組成成分, 其代謝產物的高表達可能說明了熱應激使厚殼貽貝消化腺具有比較強的能量代謝水平。

色氨酸是生物體的必需氨基酸, 它的功能具有多樣性, 主要參與蛋白質的合成。其代謝功能具有復雜性, 能直接或間接參與多種代謝通路反應(Chenet al, 2019; Agostinietal, 2020)。厚殼貽貝的消化腺是色氨酸代謝的主要器官, 消化腺的細胞組織破損導致L-色氨酸代謝物和犬尿氨酸產物的表達量發生改變, 也可能通過色氨酸代謝調節紊亂的免疫反應, 保護消化腺組織細胞免受損傷。這種氨基酸是合成神經遞質、神經調節因子5-羥色胺、褪黑激素、狗嘌呤以及相關化合物如狗嘌呤酸、喹啉酸或煙酸的前體。因此, 它在脊椎動物體內從免疫系統到神經內分泌的調節過程中都發揮著關鍵作用(Machadoetal, 2022)。在水產養殖中, 色氨酸的作用得到了廣泛的研究, 特別是在調節魚類的行為、應激反應、抗氧化和免疫系統方面(Hoseinietal, 2019; Herreraetal, 2020)。脂質是水不溶性分子, 其中磷酸甘油酯、鞘脂和固醇是構建細胞膜的主要成分(Yangetal, 2018)。更重要的是,脂質在能量穩態和細胞內信號轉導中發揮著關鍵作用(Bianetal, 2021), 細胞脂質代謝與細胞凋亡密切相關(Zhangetal, 2022)。

在ST (26 °C)組和HT (33 °C)組中, 除其他與脂質相關的代謝過程外, 分別檢測到甘油磷脂代謝和鞘脂代謝的變化。CDP-膽堿是一種熱保護劑, 能對抗高溫對蛋白質穩定性的影響(Chenetal, 2021)。磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺是細胞膜的重要組成部分,受高溫損傷(Nguyenetal, 2020), 而CDP-膽堿途徑是合成磷脂酰膽堿的主要途徑(H?rletal, 2011)。CDP-膽堿含量的減少無疑削弱了磷脂酰膽堿(PC)的合成,從而影響了細胞膜的穩定性。被認為是耐高溫的物種之一的塔結節濱螺(Echinolittorinamalaccana), 在遭受極端高溫時通過增加熱保護性滲透物和上調甘油磷脂代謝來適應極端高溫(Chenetal, 2021), 并且珍珠貝(Pinctadamaxima)的耐熱性不及塔結節濱螺, 即使中等強度的高溫熱浪對珍珠貝也會產生顯著的負面影響(Liuetal, 2023)。鞘脂是真核細胞膜的主要組成部分, 對穩定脂質雙層的結構很重要。3-去氫鞘脂堿是鞘脂和鞘脂激酶1-磷酸酶的前體, 它們在細胞生長和死亡的調控中起著重要作用(Leónetal, 2021;Tianetal, 2022)。在不同細胞類型中, 鞘脂酰胺促進細胞死亡, 但鞘脂醇1-磷酸酶調節信號通路, 刺激細胞生長并抑制程序性細胞死亡。鞘脂酰胺和鞘脂醇1-磷酸酶之間的平衡稱為鞘脂醇1-磷酸酶鞘脂醇1-磷酸酶平衡器, 并在細胞生長和死亡中保持長期平衡(Laychocketal, 2003)。3-去氫鞘脂堿的減少不能確定鞘脂酰胺鞘脂醇1-磷酸酶平衡器的平衡是否被破壞, 但我們從結果中可知, 高溫脅迫對厚殼貽貝鞘脂代謝的合成、細胞生長能力和死亡調節機制產生了重大的影響。

4 結論

通過厚殼貽貝熱應激前后消化腺代謝組學分析,兩種離子模式下, 鑒定得到了1 821 個和711 個差異表達代謝物, 通過對其進行KEGG 注釋及富集分析,最終確定了包括色氨酸(Tryptophol)、L-色氨酸(Ltryptophan)、L-犬尿氨酸(L-kynurenine)、8-甲氧基犬尿酸(8-methoxykynurenic acid)、5'-甲基硫腺苷(5'-methylthioadenosine)、次牛磺酸(Hypotaurine)、5-羥基吲哚-3-乙酸(5-hydroxyindole-3-acetic acid)、2-氨基己二酸(2-aminoadipic acid)和L-纈氨酸(L-(+)-valine)等差異表達的標志代謝物, 并且還顯著地富集到厚殼貽貝消化腺主要通過調節色氨酸代謝、酪氨酸代謝、鞘脂代謝、代謝通路和苯丙氨酸代謝等代謝信號通路。這些研究結果提示, 熱應激對厚殼貽貝的能量代謝和免疫機能產生不利影響, 影響厚殼貽貝消化腺脂肪代謝吸收從而導致消化腺功能受損。本研究在代謝水平上揭示了厚殼貽貝消化腺對熱應激的適應機制, 并強調了相關差異基因和代謝物的作用, 為后續針對特定代謝通路的厚殼貽貝耐高溫靶向調控研究提供了理論基礎。