circ0000799經miR-1287-5p/GPX4軸調控鐵死亡促進三陰乳腺癌腦轉移

劉慶, 宋彩露, 劉凌蕊, 許嬡淇, 莫運仙

中山大學腫瘤防治中心,廣東廣州510060

三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)及人表皮生長因子受體表達均為陰性的乳腺癌,其主要特點為發病年齡早、侵襲性強、治療效果差、復發轉移率高、生存預后差[1-2],常見轉移部位包括骨、肺、肝和腦,其中腦轉移發生率最高[3]。由于缺乏有效治療靶點及預后指標,目前三陰乳腺癌腦轉移仍缺乏有效治療手段。環狀RNA(circRNA)為共價閉合結構的單鏈非編碼RNA,circRNA在多種惡性腫瘤中表達異常,是潛在的腫瘤治療靶點[4-5]。有研究顯示,circ0000799在膀胱癌中表達上調且與預后密切相關[6]。因此,本研究探究circ0000799經miR-1287-5p/GPX4軸對鐵死亡促進三陰乳腺癌腦轉移的影響,為三陰乳腺癌腦轉移研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)及GAPDH抗體(CST,美國),DMEM、RPMI 1640及DMEM/F12培養基、馬血清、胎牛血清(Gibco,美國),慢病毒質粒(sh-circ0000799)及其對照(sh-circCTR)、miR-1287-5p模擬物(miR-1287-5p)及其對照(miR-CTR)、(1S,3R)-RSL3(翌圣,中國),RNase R酶、細胞核/胞質細胞組分提取試劑盒(碧云天,中國),TaqMan反轉錄及熒光定量PCR試劑盒(Takara,日本),0.8 nm Transwell小室及基質膠(BD,美國),谷胱甘肽(glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)定量分析試劑盒(ab138881,美國)。

1.2 臨床標本

收集本院2018年5月15日—2023年5月15日三陰乳腺癌腦轉移患者10例,年齡(39.5±8.9)歲。取術中新鮮樣本,按病理號分別保存患者原發灶、腦轉移灶和癌旁組織,提取組織RNA -80 ℃備用。本研究經本院倫理委員會批準,所有患者或家屬知情同意。

1.3 細胞培養及穩定轉染細胞株構建

人正常乳腺上皮細胞MCF-10A、非三陰乳腺癌細胞系(MCF-7、T47D、BT-474、SKBR-3、HCC-38)、親代三陰乳腺癌細胞系(MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-468)、子代腦轉移三陰乳腺癌細胞系(MDA-MB-231-BM、BT-549-BM)[7-8]來源于ATCC組織。MCF-10A細胞培養于含1%馬血清、20 ng表皮生長因子、0.5 μg氫化可的松、10 mg/L胰島素及1%雙抗的DMEM/F12培養基中;其他細胞均培養于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM或RPMI 1640培養基中。根據轉染敲低RNA(short hairpin RNA,shRNA)不同,細胞分為sh-circCTR組和sh-circ0000799組。分別轉染sh-circCTR和sh-circ0000799至MDA-MB-231和MDA-MB-231-BM細胞中,qRT-PCR驗證circ0000799敲低效率。

1.4 qRT-PCR

提取細胞及組織總RNA,以RNA為模板,根據Takara提供的反轉錄、熒光定量PCR試劑盒說明書,分析circ0000799表達量(使用IQTM5 Multicolor實時熒光定量系統,美國BioRad)。circ0000799及其對照引物分別用于qRT-PCR,反應體系為20 μL,以U6為內參,引物序列hsa_circ_0000799(circ-BPTF):F5′-CCCCATTTTACCAGTGTGCAG-3′,R5′-GCTGGACCCACACTTGATGA-3′;U6:F5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用2-ΔΔCT公式計算circ0000799表達量,每組含3個復孔。

1.5 Transwell實驗

將穩定轉染sh-circCTR和sh-circ0000799慢病毒質粒的MDA-MB-231和MDA-MB-231-BM細胞分別制成2×105個/mL單細胞懸液。在Transwell上腔層中鋪加基質膠,培養箱內靜置6 h成膜后取出。每個小室上腔層加入150 μL單細胞懸液,下腔層加入350 μL含20%FBS培養基,培養24 h后取出小室,結晶紫染色,去除、清洗并晾干小室后,鏡下計數染色細胞。

1.6 RNase R酶消化實驗

提取MDA-MB-231細胞總RNA,分為RNase R組(加RNase R消化)和對照組(不加RNase R消化)。于PCR儀中分別經37 ℃、70 ℃反應30 min及10 min使酶滅活,并進行反轉錄反應,分別使用根據環狀RNA circ0000799接口處設計的引物、其線性親本基因BPTF設計的引物,進行qRT-PCR檢測,比較環狀circ0000799及其線性親本基因BPTF分別經30 min RNase R處理后的mRNA表達水平,明確circ0000799在MDA-MA-231細胞中的結構穩定性。

1.7 circ0000799亞細胞定位實驗

按照細胞核/細胞質細胞組分提取試劑盒的說明書進行操作,提取MDA-MA-231細胞的胞質及胞核RNA,qRT-PCR分別檢測circ0000799、細胞質對照β-actin、細胞核對照18S在細胞質和細胞核中的表達量,根據兩者比例作圖。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

將2×104個MDA-MB-231細胞接種到6孔板培養24 h。使用Lipo 3000分別共轉染野生型circ0000799、突變型circ0000799,或野生型GPX4、突變型GPX4,或miR-1287-5p、miR-CTR,按試劑盒說明書進行操作[9],分別驗證circ0000799與miR-1287-5p,以及miR-1287-5p與GPX4之間的結合關系。

1.9 GSH和GSSG定量分析

細胞分為sh-circ0000799組和sh-circCTR組。據說明書操作,將脫蛋白樣品和標準品分別加入孔中,并在測定緩沖液中加入Thiol Green用于GSH檢測,或加入GSSG探針用于總谷胱甘肽(GSH+GSSG)檢測。將混合物室溫孵育30 min后,使用酶標儀分析樣品。計算總GSH/GSSG比值。

1.10 蛋白質印跡分析

細胞分為sh-circ0000799組和sh-circCTR組。RIPA裂解法從MDA-MB-231細胞提取分離總蛋白,進行SDS-PAGE凝膠分離蛋白,300 mA轉PVDF膜2 h。4 ℃ 1∶1 000 GPX4和GAPDH一抗分別孵育過夜,室溫下采用特異性二抗孵育2 h,顯影成像,使用Image J進行定量分析。

1.11 小鼠體內腦轉移模型構建

15只4周齡BALB/c裸鼠隨機分為3組,每組5只,分別為sh-circCTR組、sh-circ0000799組、sh-circ0000799+RSL3組。將穩定轉染細胞株經左心室注射到裸鼠體內以構建腦轉移模型,其中sh-circ0000799+RSL3組在注射sh-circ0000799穩定轉染細胞株后的第7周開始進行鐵死亡誘導劑100 mg/kg RSL3皮下注射治療,每周2次,持續2周。第8周后結束實驗,處死小鼠,取腦組織進行HE染色,鏡下統計腦轉移結節數目并記錄。

1.12 統計學分析

2 結 果

2.1 circ0000799在乳腺癌細胞系及組織中的表達

與MCF-10A和癌旁組織比較,circ0000799在三陰乳腺癌細胞系及乳腺癌組織中上調,且在子代三陰乳腺癌細胞系及腦轉移灶中上調最為顯著(P<0.05;圖1)。

圖1 circ0000799在乳腺癌細胞系及乳腺癌組織中的表達a為P<0.05,與MCF-10A比較;b為P<0.05,與非三陰乳腺癌細胞系(MCF-7、T47D、BT-474、SKBR-3、HCC-38)比較;c為P<0.05,與親代三陰乳腺癌細胞系(MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-468)比較;d為P<0.05,與癌旁組織比較;e為P<0.05,與原發灶組織比較。

2.2 circ0000799對細胞生長的影響

sh-circ0000799敲除效率在MDA-MB-231、MDA-MB-231-BM中得到驗證(P<0.05;圖2A)。與sh-circCTR組比較,sh-circ0000799組MDA-MB-231、MDA-MB-231-BM細胞生長能力顯著降低(P<0.05;圖2B)。即外源性沉默circ0000799可降低親代MDA-MB-231和子代腦轉移性MDA-MB-231-BM細胞生長能力。

圖2 circ0000799對乳腺癌細胞生長的影響A為MDA-MB-231和MDA-MB-231-BM中circ0000799敲低效率;B為細胞生長曲線。a為P<0.05,與sh-circCTR組比較。

2.3 circ0000799對細胞侵襲能力的影響

與sh-circCTR組比較,sh-circ0000799組MDA-MB-231、MDA-MB-231-BM細胞侵襲細胞數降低(P<0.05;圖3),即外源性沉默circ0000799可降低親代MDA-MB-231和子代腦轉移性MDA-MB-231-BM細胞侵襲能力。

圖3 circ0000799對乳腺癌細胞侵襲能力的影響(結晶紫染色,100×)a為P<0.05,與sh-circCTR組比較。

2.4 circ0000799對三陰乳腺癌細胞腦轉移的影響

sh-circCTR組、sh-circ0000799組、sh-circ0000799+RSL3組腦轉移結節數量依次降低[(2.4±0.49)個比(1.2±0.4)個比(0.2±0.4)個,P<0.05;圖4]。

圖4 circ0000799對三陰乳腺癌細胞腦轉移的影響(HE染色)

2.5 circ0000799結構穩定性鑒定及定位

與對照組比較,RNase R酶處理后環狀RNA circ0000799表達無顯著變化(P>0.05),而其線性BPTF表達降低(P<0.05;圖5)。胞質circ0000799表達高于胞核(P<0.05;圖5),即circ0000799亞細胞定位主要為細胞質。

圖5 circ0000799結構穩定性鑒定及定位A為circ0000799和BPTF的表達;B為circ0000799的亞細胞定位。a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.05,與同組細胞核比較。

2.6 circ0000799可能通過miR-1287-5p/GPX4調控鐵死亡促進乳腺癌腦轉移

生物信息學軟件circInteractome和TargetScan預測,且雙熒光素酶報告基因實驗顯示,circ0000799可與miR-1287-5p相互作用,miR-1287-5p可與GPX4相互作用(圖6A)。與sh-circCTR組比較,sh-circ0000799組miR-1287-5表達增加;與miR-CTR組比較,miR-1287-5p組GPX4 mRNA表達降低(P<0.05;圖6B)。敲除circ0000799后,細胞內總GSH/GSSG比(圖6C)和GPX4表達降低(P<0.05;圖6D)。

圖6 circ0000799可能通過miR-1287-5p/GPX4調控鐵死亡促進乳腺癌腦轉移A為生物信息學軟件和雙熒光素酶報告基因實驗;B為qRT-PCR;C為總GSH/GSSG定量分析柱狀圖;D為Western blotting(1為sh-circCTR組;2為sh-circ0000799組)。a為P<0.05,與miR-CTR組比較;b為P<0.05,與sh-circCTR組比較。

3 討 論

circRNA在多種組織和細胞中均有廣泛分布,具有一定的特異性[10]。具有共價閉環結構的circRNA在多種生物學過程中發揮著不可替代的作用[11]。隨著高通量技術不斷完善,不斷有新的circRNA被發現并探究其與腫瘤進展之間的相關性[12]。circRNA已被證實為潛在的腫瘤治療靶點。環狀RNA circ0000799(hsa_circRNA_0000799,chr17:65941524-65972074)為一種來源于BPTF基因外顯子的新型circRNA(circBPTF)。研究顯示,circ0000799在膀胱癌中表達上調且與患者腫瘤分級呈正相關,與患者預后呈負相關,且該過程可能是通過海綿吸附miR-31-5p靶向上調RAB27A表達而實現的,是膀胱癌治療的一個潛在靶點[6]。本研究通過檢測circ0000799在乳腺癌細胞系及乳腺癌組織中的表達發現,circ0000799在所有乳腺癌細胞系中均表達上調,且相對于親代三陰乳腺癌細胞系,子代腦轉移細胞系中上調最為顯著;而在10例乳腺癌原發灶、腦轉移灶及癌旁組織中的表達結果也一致,即在三陰乳腺癌腦轉移灶組織中的表達上調最為顯著。該結果與膀胱癌[6]結果較為一致,同時也說明circ0000799可能是三陰乳腺癌腦轉移密切相關的一個circRNA。隨后通過shRNA敲低circ0000799在親代和子代腦轉移性三陰乳腺癌細胞系中的表達,發現敲低circ0000799可顯著抑制細胞生長、侵襲及腦轉移能力。

鐵死亡是一種鐵離子依賴型的脂質過氧化物損傷所引起的細胞程序性死亡的現象,其遺傳學背景、生化調節模式及形態學特征均不同于以往的凋亡、自噬、焦亡和壞死等經典細胞死亡模式,是近年來新發現的一種細胞死亡模式,以鐵離子、活性氧和脂質過氧化物堆積、胱氨酸/谷氨酸反向轉運體抑制、谷胱甘肽合成減少、還原型輔酶Ⅱ被氧化等為其典型的生化特征[13]。鐵死亡發生的機制為細胞內游離鐵離子與過氧化物發生芬頓反應,從而使生物膜上的多不飽和脂肪酸進一步過氧化,該過程受多種基因調控,如調控鐵代謝相關的血紅素加氧酶1、抗氧化代謝相關的胞質接頭蛋白、能量代謝相關的谷氨酰胺酶2,以及脂質代謝相關的GPX4[14]。GPX4可特異性清除脂質過氧化物,并有效抑制鐵死亡發生[15]。研究顯示,抑制GPX4的表達或活性,可促進腫瘤細胞鐵死亡的發生,從而抑制腫瘤的生長和轉移[16-17]。本研究發現,由子代腦轉移性三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231-BM通過左心室注射構建的腦轉移模型中,在敲低circ0000799后腦轉移結節數顯著降低,且在與鐵死亡誘導劑RSL3連用后,腦轉移結節數接近消失。同時MDA-MB-231細胞中總GSH/GSSG隨circ0000799的抑制而顯著降低,同時鐵死亡相關標志物GPX4蛋白的表達也顯著降低,上述結果均表明三陰乳腺癌腦轉移與鐵死亡密切相關。已有研究顯示,鐵死亡可能通過破壞鐵離子穩態而參與乳腺癌的腦轉移。鐵代謝與鐵的吸收、利用、儲存和輸出密切相關,高鐵水平會產生活性氧,并決定細胞對鐵死亡的敏感性,容易轉移的癌癥細胞通常非常容易發生鐵死亡[14]。本研究與文獻[14]結果一致,circ0000799調控三陰乳腺癌的腦轉移可能是通過鐵死亡實現的。

本研究通過結構穩定性鑒定及亞細胞定位,確定了circ0000799的結構穩定性及其發揮生物學活性的主要位置為細胞質。隨后通過生物信息學軟件預測,發現circ0000799可與miR-1287-5p結合,而GPX4是miR-1287-5p的下游靶基因。研究顯示,circRNA通過海綿吸附miRNA,競爭性結合miRNAs以調節miRNAs下游基因表達[18]。本研究通過雙熒光素酶報告基因和qRT-PCR實驗,證實了circ0000799與miR-1287-5p、GPX4與miR-1287-5p之間的相互結合關系,即circ0000799-miR-1287-5p-GPX4軸在三陰乳腺癌腦轉移中發揮重要作用,該作用最終通過促進GPX4表達抑制鐵死亡而促進腦轉移,且Western blotting實驗也證實了抑制circ0000799可顯著抑制GPX4蛋白表達,進一步證實了三者間的調控關系。而在膀胱癌中也證實circ0000799可通過miR-31-5p/RAB27A軸而促進膀胱癌的惡性進展[6]。該結果與胞質circRNA可作為miRNA海綿調控下游關鍵基因的結果一致[19]。

目前該機制的嚴謹性仍待完善,后續將納入多株親代及子代轉移性三陰乳腺癌細胞系、臨床腦轉移樣本,并進行RIP、qRT-PCR、體內實驗活體成像等實驗進一步驗證。本研究初步證實circ0000799與三陰乳腺癌腦轉移的密切關聯,該過程可能是通過調控miR-1287-5p/GPX4軸而實現的,該結果可能為提高三陰乳腺癌腦轉移患者的預后提供新思路。