基于網絡藥理學研究丹梔逍遙散治療便秘的作用機制

林銘釤, 林建國, 林明瑩, 張笑霄, 張晴, 朱婷婷, 姚魁武,4

1.中國中醫科學院廣安門醫院,北京 100053;2.北京中醫藥大學,北京 100029;3.西安理工大學,陜西西安 710048;4.中國中醫科學院眼科醫院,北京 100040

便秘(constipation)是一種常見的消化系統癥狀,表現為排便困難、排便次數減少、糞便干硬癥狀中的至少一種。研究表明,便秘會增加冠心病和缺血性卒中的發病風險,相較于非便秘人群,有基礎性疾病便秘人群的死亡風險更高[1-2]。

中醫認為,邪滯腸胃,糟粕內停,大腸傳導失司為便秘的主要病理機制,其中氣機郁滯、陰虧血少是其主要證候,患者多有情志不調,肝氣郁結,導致腑氣郁滯;或素體陰虛,陰血虧少不足以榮養。臨床相關研究顯示,以逍遙散為基礎方治療便秘能夠增強結腸動力,提高傳輸功能和胃腸排空率,從而改善臨床癥狀[3-4]。本文基于網絡藥理學研究丹梔逍遙散治療便秘的作用機制。

1 材料和方法

1.1 丹梔逍遙散中活性成分和靶點的篩選

通過TCMSP(http:tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php)分別查找柴胡(CH)、白芍(BS)、甘草(GC)、當歸(DG)、茯苓(FL)、白術(BZ)、牡丹皮(DP)、梔子(ZZ)的化學組成成分。TCMSP篩選條件為口服利用度≥30%,且藥性≥0.18;BATMAN-TCM篩選條件為靶點預測得分值≥50,初步篩選丹梔逍遙散的有效活性成分,并根據文獻中中藥的主要有效成分進行補充完善[5-7]。用化學成分對應的靶蛋白在Uniprot蛋白質數據庫(http://www.uniprot.org/)中規范蛋白靶點且匹配標準基因名稱,查重后刪除重復值和無靶點的化學成分。

1.2 便秘相關靶點檢索和篩選

在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https://omim.org/)、DisGeNET數據庫(http://www.disgenet.org/home/)、治療靶點數據庫(therapeutic target database,TTD)(http://db.idrblab.net/ttd)的疾病基因數據庫中,以“constipation”為關鍵詞檢索便秘的相關靶點,匯總后去重得到疾病靶點。

1.3 構建藥物-化合物-靶點-疾病網絡和蛋白互作網絡

在微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)對藥物與疾病靶點取交集,繪制文氏圖,并在Cytoscape3.8.0構建藥物-化合物-靶點-疾病網絡,利用內置Network Analyzer和cytoHubba功能分析網絡,推測丹梔逍遙散的有效活性成分。用丹梔逍遙散與便秘的交集靶點,在STRING(http://stringdb.org/)數據庫上構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡并導出數據,篩選核心蛋白。

1.4 富集分析

將丹梔逍遙散和便秘篩選去重后的交集靶點導入Metascape平臺(http://metascape.org/),對交集靶點進行基因本體(gene ontology,GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,在微生信平臺繪制氣泡圖;在BioGPS平臺(http://biogps.org/)檢索關鍵靶點并對其組織、器官特異性表達程度進行分析。

1.5 分子對接驗證

在蛋白質結構數據庫(protein data bank,PDB)(http://www.pdbus.org)檢索篩選出關鍵靶點合適的PDB ID并下載其pdb結構,在TCMSP平臺上下載篩選出有效活性成分化合物的mol2結構。使用SwissDock平臺(http://www.swissdock.ch/)進行在線分子對接,根據其結合能評價靶點和有效成分的結合強度。對接能量<0 kcal/mol為小分子配體與大分子蛋白能夠自發結合,并且對接能量越低,結合效果越好;當對接結合能量<-5 kcal/mol,為具有較好的結合效果;對接結合能量<-7 kcal/mol為具有較強的結合效果[8]。

2 結 果

2.1 丹梔逍遙散的有效成分和靶點

篩選整合后得到丹梔逍遙散的有效活性成分250個(其中柴胡20個、當歸49個、白芍13個、茯苓16個、白術8個、甘草118個、牡丹皮11個、梔子15個),剔除重復后共獲得225個有效活性成分,746個藥物靶點,其中度值前五的有效活性成分見表1。

表1 丹梔逍遙散的有效活性成分

2.2 便秘相關靶點檢索

檢索GeneCards、OMIM、DisGeNET、TTD疾病數據庫,得到便秘靶點個數分別為5 365(篩選后1 430個)、647、424、9個,篩選并去重后得到便秘靶點1 620個。丹桅逍遙散與便秘的交集靶點為153個(圖1)。

圖1 丹桅逍遙散-便秘交集靶點文氏圖

2.3 丹梔逍遙散治療便秘的PPI網絡與關鍵靶點

丹梔逍遙散和便秘靶點交集共153個,STRING數據庫構建PPI網絡見圖2。根據度值篩選前4位的關鍵靶點,分別為VEGFA、CASP3、TNF、JUN。

圖2 PPI網絡圖

2.4 丹梔逍遙散-化合物-靶點-便秘網絡結果

共獲得351個節點(包含153個靶點和189個有效活性成分)與1 574條關系(圖3)。根據cytoHubba篩選前4位的關鍵成分為槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇。

圖3 丹梔逍遙散-化合物-靶點-便秘網絡圖

2.5 GO富集及KEGG通路結果

GO富集分析包含生物過程、分子過程以及細胞過程。其生物過程主要為對無機物的反應、對外來刺激的反應等;分子過程主要為氧化還原酶活性、信號受體激活劑活性、泛素樣蛋白連接酶結合等;細胞過程主要涉及膜筏、線粒體包膜、細胞體等(圖4)。KEGG主要通路涉及癌癥的通路、血脂和動脈粥樣硬化、NF-κB信號通路、AMPK信號通路、炎性腸病等(圖4)。

圖4 GO富集和KEGG通路氣泡圖

2.6 組織、器官富集分析

對檢索結果進行數據分析,發現關鍵靶點組織特異性表達主要分布在淋巴細胞、平滑肌、肺、結腸、結直腸腺癌、小腸(表2)。

表2 組織、器官富集

2.7 分子對接結果

分別將槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇與VEGFA、CASP3、TNF、JUN進行分子對接。結果顯示,β-谷甾醇和TNF以及豆甾醇和CASP3具有較強的結合效果(圖5、圖6)。

圖5 分子對接結合能

圖6 分子對接結果

3 討 論

便秘的病因較為復雜,最常見于藥物治療所引起的癥狀,也可由多種疾病引起,包括代謝性疾病、肌病、神經系統疾病等,其病理生理學機制尚未完全明確。研究表明[3,9],便秘與多種胃腸道神經肌肉病變、神經內分泌功能紊亂,以及腸道炎癥、腸道微生物菌群改變相關。便秘與肛門直腸疾病密切相關,是結直腸癌發生的重要影響因素[10]。

丹梔逍遙散的主要化學成分多為黃酮類、甾醇類,包括槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇等。槲皮素是廣泛存在于多種植物中的黃酮醇類化合物,具有抗氧化、抗炎的作用。Kim等[11]發現,槲皮素可刺激便秘大鼠排便,這可能與恢復其mAChRs表達下調及其下游信號,降低Gα、PI3K磷酸化水平,調節胃腸平滑肌,增加腸蠕動功能相關;誘導橫結腸分泌黏蛋白,且誘導功能的強弱與膜水通道表達相關;病理組織分析發現其可恢復橫結腸的異常結構改變。Liu等[12]發現,槲皮素能抑制便秘模型大鼠的腸桿菌及腸球菌生長,減少乙酸合成為丁酸,保護腸上皮細胞的屏障功能。研究表明,槲皮素可以調節細胞的自噬能力,通過調節P53、AMPK信號通路,滅活HIF-1信號通路抑制細胞增殖,誘導保護性自噬能力,另可通過調節Wnt信號轉導途徑讓細胞失活,失去自噬能力[13]。曲一帆[14]發現,山奈酚可以降低腸道中脂多糖含量,改善潰瘍性結腸炎小鼠的臨床癥狀,保護腸黏膜,調節菌群平衡,減輕病理損傷。同時,山奈酚可誘導細胞凋亡,抑制VEGF表達,調節HIF-1α,誘導CASP3依賴性細胞凋亡[15]。Chen等[16]認為,山奈酚可以增加腸道緊密蛋白表達保護腸道物理屏障,增加丁酸鹽受體,增強腸上皮屏障功能。β-谷甾醇、豆甾醇均可減少結腸炎小鼠的高炎癥表達[17]。Ding等[18]發現,β-谷甾醇可以減緩結腸炎小鼠體質量下降,縮短結腸長度,降低髓過氧化物酶活性,減少結腸TNF-α,改善組織學炎癥變化,此外腸上皮抗菌肽的表達顯著增加,對致病菌有多重作用。嚴海冬等[19]發現,β-谷甾醇抑制炎癥因子,豆甾醇抑制結腸縮短,降低炎癥因子表達,緩解結腸炎的癥狀,且豆甾醇的抗炎性高于β-谷甾醇。

根據PPI網絡篩選的關鍵靶點有VEGFA、CASP3、TNF、JUN。CASP3作為關鍵角色參與細胞凋亡、壞死和炎癥的信號轉導[19]。VEGFA是血管新生和血管生成的關鍵調節因子。研究發現,在中國漢族人群中,壞死性結腸炎患者的血液中VEGFA水平較普通人低[20]。Frysz-Naglak等[21]發現,腸道上皮細胞如果VEGF產生過多,可能會損傷腸道的屏障,使腸道菌群侵犯腸壁。JUN與癌癥的發生密切相關,當積累到一定程度時可促進細胞增殖,但在結腸癌中可被E3泛素連接酶泛素化,繼而降解,發揮抑癌作用[22]。TNF-α是重要的促炎因子,改變腸黏膜通透性,破壞腸道[23]。

綜上所述,丹梔逍遙散治療便秘主要涉及槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等189個有效活性成分,可能通過VEGFA、CASP3、TNF、JUN等關鍵靶點,調節細胞衰老、炎性腸病、NF-kappa B信號通路等相關通路,從而參與抗炎、保護腸黏膜屏障、調節腸道菌群,改善便秘癥狀。