限制性內切酶酶切后去磷酸化聯合藍白斑篩選檢測KRAS基因第12位稀有突變

周翠蘭, 陳婕, 許云思, 付乙人, 彭翠英

南華大學衡陽醫學院 1.基礎醫學院應用解剖學與生殖醫學研究所, 2.生態健康與人類重要疾病防控湖南省高校重點實驗室,3.生物毒理與生態修復衡陽市重點實驗室, 4.有色金屬礦區耕地重金屬污染生態阻抗技術研究所衡陽市重點實驗室,湖南衡陽 421001

KRAS基因突變與多種腫瘤的發生發展相關,據COSMIC體細胞突變數據庫,絕大多數的KRAS基因突變為點突變,較常見的為第12位、第13位密碼子突變,其野生型序列為TGGTGG,其中第12位突變具有較高的發病頻率,最常見的突變類型為TGATGG與TGGTGA[1-2]。藍白斑篩選原理為,外源性DNA片段與含lacZ的載體連接,插入到其多克隆位點,破壞lacZ的閱讀框架,導入宿主為缺陷菌株,致β-半乳糖苷酶基因斷裂而不能產生分解培養基中的X-gal的β-半乳糖苷酶,所以克隆顏色呈白色[3-4]。研究發現,含終止密碼子的外源性DNA片段(長度為3的倍數)插入到含lacZ的載體中,克隆顏色呈白色;不含終止密碼子的外源性核苷酸片段(長度為3的倍數)插入到含lacZ的載體中,呈藍色克隆[4]。

本課題組利用藍白斑篩選技術已完成了KRAS基因第12位密碼子突變檢測,可檢測出千分之一的稀有突變[5],但不能滿足腫瘤早期臨床診斷的需要。為降低突變檢測的下限,本研究采用限制性內切酶酶切后去磷酸化聯合藍白斑篩選對KRAS基因第12位密碼子突變進行檢測,為臨床腫瘤早期篩查提供理論與技術支持。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

PCR儀(A200型)購自中國杭州朗基公司,E Coli.DH5α菌株、100 bp DNA Ladder、PMD-19T購自中國北京天根公司。dNTP、BstNI、EcoRI、KpnI、T4連接酶購自美國NEB公司。質粒DNA提取試劑盒購自中國大連TaKaLa公司。MixTaq與DNA Polymerase購自美國Thermo Scientific公司。IPTG、X-gal、Amp、Tris-base試劑購自中國長沙宏宇生物公司。人工模板KRAS基因第12位密碼子突變型(mutant type,MUT)與野生型(wild type,WT)質粒為本實驗室構建,插入長度為102 bp(3的倍數)的核苷酸片段,第12位密碼子MUT 12質粒其TGG突變成TGA。

1.2 引物設計與合成

根據COSMIC體細胞突變數據庫顯示的KRAS基因第12位密碼子熱點突變,NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)顯示的KRAS基因序列,利用引物設計軟件Premier 5.0設計引物,設計引物主要考慮成功引入酶切位點,將引入突變的堿基置于引物的3′末端。設計一對引物:FS(正向引物)、AS(反向引物)。FS中3′的C堿基為引入BstNI酶切序列的C堿基。FS與AS擴增得到的產物雙酶切后用于亞克隆,雙酶切后獲得的插入片段長度為102 bp,插入片段的長度為3的倍數。AS的序列為5′-CTACGGAATTCTTGGACCATATTCGTCCACA-3′,FS的序列為5′-ATACGAGGGTACCTGACTGCATACAAACTTGTGGTAGTTGGAC-3′,引物序列由蘇州金唯智公司合成。

1.3 PCR擴增引入酶切位點

測定第12位密碼子MUT與WT質粒光密度(optical density,OD)值。依據OD值將MUT/WT 12按0∶1、1∶3 000、1∶10 000、1∶30 000的比例混合以模擬人體循環血液中游離DNA作為實驗組模板,將MUT/WT 12質粒按0∶1、1∶300、1∶1 000、1∶3 000的比例混合作為對照組模板,WT質粒終質量濃度為0.02 μg/L[6]。以混合的人工模板進行PCR擴增,PCR反應體系為50 μL,5 μL 10×Tag buffer,0.4 mmol/L dNTP,引物FS、AS各20 mmol/L,Tag酶0.25 U,模板40 ng。PCR擴增條件:預變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 22 s,退火58 ℃ 22 s,延伸72 ℃ 22 s,38個循環;終延伸72 ℃ 8 min。

1.4 限制性內切酶酶切

PCR產物純化試劑盒純化回收引入酶切位點的PCR產物,反應體系150 μL,PCR產物2 μg,12 μL 10×Cut Smart Buffer,5 μL BstNI,85 ℃反應2 h。PCR產物純化試劑盒純化回收酶切產物。野生型片段含酶切位點,被酶切成兩個小片段,去磷酸化使5′端去磷酸根,與線性化載體的連接被阻斷。突變型片段不含酶切位點,不能被酶切,去磷酸化處理不影響突變型片段與線性化載體的連接。因此,酶切后PCR產物去磷酸化。

1.5 酶切產物去磷酸化

純化回收PCR酶切產物,反應體系60 μL,6 μL 10×堿性磷酸酶緩沖液,3 μL堿性磷酸酶,37 ℃ 1 h,80 ℃ 20 min以滅活堿性磷酸酶。PCR產物純化試劑盒純化回收去磷酸化產物。EcoRI與KpnI雙酶切PMD-19T載體與PCR產物,純化回收線性化載體與PCR酶切產物。紫外分光光度計測定OD值。

1.6 藍白斑篩選檢測稀有突變及藍白斑菌落計數

測定PCR酶切產物的OD值,PCR酶切產物與載體連接。將連接后的產物導入E Coli.DH5α菌株。培養物涂抹于含X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上,瓊脂平板置于5%二氧化碳培養箱,37 ℃培養16 h。將培養皿平分為4個部分,肉眼計數1個部分的白色克隆與藍色克隆,將所得計數的克隆數乘以4既為培養皿上的白色克隆或藍色克隆的個數。

1.7 菌液PCR酶切鑒定插入片段

在突變與野生為1∶30 000瓊脂培養皿上挑取5個白色克隆,進行菌液PCR酶切鑒定。引物AS與FS進行菌液PCR擴增以引入酶切位點,BstNI酶切,酶切產物瓊脂糖凝膠電泳,將酶切鑒定為陽性的克隆一代測序,驗證其插入片段的序列。

1.8 肺癌患者游離DNA驗證

于南華大學附屬第一醫院采集26例肺癌患者外周血8 mL,血液置于EDTA抗凝管中。參照凱杰游離DNA提取試劑盒提取血中游離DNA[7]。利用限制性內切酶酶切聯合去磷酸化與藍白斑技術對26例肺癌患者游離DNA進行檢測。

2 結 果

2.1 質粒引入酶切位點

BstNI酶切PCR產物,其電泳圖見圖1。野生型片段PCR擴增產物含CCWGG(W為A、C、T、G中任何一個堿基),為BstNI的酶切位點;突變型片段的PCR擴增產物不含CCWGG,不含酶切位點。PCR產物送金唯智公司測序,其序列圖見圖2。

圖1 質粒引入酶切位點酶切電泳圖M為100 bp的Marker;1為PCR產物未酶切;2～5為MUT/WT 12分別為0∶1、1∶3 000、1∶10 000、1∶30 000酶切產物。

圖2 人工模板引入酶切位點測序圖A為野生型片段引入酶切位點;B為突變型片段引入酶切位點。

2.2 兩組不同比例混合模板克隆結果

兩組培養皿上均可見白色克隆與藍色克隆。實驗組酶切產物去磷酸化,被酶切成兩個小片段的野生型片段與線性化載體的連接受到阻礙,突變片段為一完整片段,去磷酸化不影響突變片段與線性化載體的連接,與對照組相比較,白色/藍色克隆大幅提升(圖3)。

圖3 不同比例混合模板的克隆形成圖A從左到右依次為MUT/WT 12質粒比例分別為0∶1、1∶300、1∶1 000、1∶3 000克隆形成圖;B從左至右依次為MUT/WT 12質粒比例分別為0∶1、1∶3 000、1∶10 000、1∶30 000克隆形成圖。

2.3 藍白斑菌落計數

對照組1∶3 000培養皿上白色克隆17個,藍色克隆2 329個,白色/藍色克隆為1/137;而實驗組1∶30 000的培養皿上白色克隆23個,藍色克隆394個,白色/藍色克隆為1/17;1∶30 000實驗組白色/藍色克隆比例明顯高于1∶3 000 對照組(表1)。

表1 藍白斑菌落計數

2.4 菌液PCR酶切鑒定結果

實驗組1∶30 000培養皿上的5個陽性克隆酶切鑒定出3個陽性克隆(圖4A)。一代測序進一步驗證插入片段的序列,其序列見圖4B。野生型擴增片段為BstNI的酶切位點,被BstNI消化為80 bp與50 bp的兩個DNA片段,這兩個片段不能被瓊脂糖電泳檢測(可以用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測)。

圖4 菌液PCR酶切電泳圖A為菌液PCR酶切電泳圖(箭頭所指為陽性克隆);B為陽性克隆插入片段序列圖。a為80 bp片段;b為50 bp片段。

2.5 肺癌患者游離DNA驗證結果

26例肺癌患者游離DNA檢測出2例游離DNA為KRAS基因第12位密碼子突變,其克隆形成圖如圖5A,測序驗證其插入序列如圖5B。

圖5 肺癌患者游離DNA驗證結果A為酶切聯合去磷酸化與藍白斑篩選對游離DNA檢測的克隆形成圖;B為酶切鑒定為陽性克隆插入片段的序列圖。

3 討 論

利用游離DNA進行腫瘤早期診斷與腫瘤切除術后復發監測時,富集低豐度突變DNA片段至關重要。微滴數字PCR檢測熱點突變能夠在一萬野生拷貝中檢測出單一拷貝[8-9],但成本高,操作系統繁瑣,現無法在基層醫院推廣為普通的體檢項目。二代測序不能對腫瘤進行早期或超早期診斷,且測序費用高,不易被普通百姓接受[10-13]。Zhang等[14-15]發明的高保真聚合酶介導的引物3′末端硫化修飾技術雖檢測下限可達到千分之一甚至更低,但具有假陽性并存的缺點。

藍白斑篩選聯合一代測序可檢測千分之一的稀有突變,更適合于腫瘤切除術后復發監控[5]。對于一些體細胞突變,其野生型片段含酶切位點,突變引起酶切位點消失;或其野生型片段可經PCR擴增引入酶切位點,而突變型片段不能被引入酶切位點,可利用限制性內切酶酶切PCR擴增產物,去磷酸化,再與線性化載體連接,一代測序對陽性克隆的插入片段序列進行確定。野生型片段被酶切成兩個小片段,去磷酸化處理,5′末端去磷酸基團的產物不能與線性化載體連接。對涉及終止密碼子的突變,可通過克隆顏色對稀有突變進行初步區分。實驗組MUT/WT 12為1∶30 000的培養皿上白色/藍色克隆為1/17,而對照組MUT/WT 12為1∶3 000的培養皿上其白色/藍色克隆為1/137,1∶30 000實驗組白色/藍色克隆比例明顯高于1∶3 000對照組。野生型片段的PCR產物經限制性內切酶酶切,在T4連接酶的作用下,與線性化載體連接。藍白斑篩選高效率與假陽性并存,對照組的培養皿上白色/藍色克隆的比例高于實質模板比例,考慮為載體的自連。將實驗組培養皿上的陽性克隆進行酶切鑒定,再將酶切鑒定為陽性克隆的一代測序以確定插入片段的序列可避免假陽性。本研究結果顯示,限制性內切酶酶切后去磷酸化聯合藍白斑篩選可檢測出1∶30 000 KRAS基因稀有突變,證明了限制性內切酶酶切后去磷酸化聯合藍白斑篩選可提高對稀有突變的檢測能力。本實驗結果表明限制性內切酶酶切后去磷酸化聯合藍白斑篩選在惡性腫瘤的早期或超早期診斷具有較大的應用潛力。

KRAS熱點突變見于多種惡性腫瘤,其中,突變率最高的為胰腺癌,其次為直結腸癌、膽管癌及肺癌[7]。本課題組利用限制性內切酶酶切后去磷酸化聯合藍白斑篩選對KRAS基因第12密碼子突變的人工模板進行檢測,同時對26例肺癌患者游離DNA進行稀有突變檢測以驗證此技術的可行性。游離DNA檢測為無創性檢測,患者接受的意愿高。這一研究對涉及終止密碼子的其他熱點突變的檢測具有潛在的臨床應用價值,可為臨床惡性腫瘤的診斷提供一種快速、準確的檢測方法,對臨床早期及超早期診斷腫瘤、確定治療方案以及腫瘤的預后具有較重要的臨床應用價值。此外,本方法操作簡單,所需要的分子生物學試劑成本低廉,所需的儀器PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳等,均為分子生物學基本儀器,對操作人員的技術要求不高,有利于在基層醫院普及。此項檢測可納入為常規的體檢項目,為腫瘤的早期和超早期診斷提供一種低廉、低檢測下限的檢測方法,可以作為早期腫瘤篩查的檢測技術。