呼吸道感染細菌聯合疫苗制備及其免疫效果評價

張敬, 劉殿卿, 黃菲, 李欣, 盧東

1.唐山市中心血站檢驗科,河北唐山063000;2.唐山市婦幼保健院檢驗科,河北唐山063000;3.唐山市工人醫院檢驗科,河北唐山063000

呼吸道感染包含細菌感染及病毒感染,病毒感染占比較高,經病毒感染后的患兒繼發細菌感染風險也較高[1-2]。蘭菌凈、泛福舒及必思添等細菌溶解產物為臨床常用疫苗,但這類疫苗菌種均來自國外,并非中國呼吸道感染的常見菌種,因此可能并不完全適用于中國人群[3-4]。另外,進口疫苗價格較為昂貴,不利于普及,從而對疫苗接種率造成影響,因此制備適用于中國小兒呼吸道感染疾病的疫苗具有重要意義。研究表明,溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌B型、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌均為中國呼吸道感染的常見病菌[5-6]。本研究采用以上6種常見病菌制成聯合疫苗,并探討其對免疫效果的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

CCK-8試劑(上海經科化學科技有限公司),RPMI-1640培養基(美國賽默飛世爾科技有限公司),細胞分離液(北京金克隆生物技術有限公司),多聚甲醛(北京金克隆生物技術有限公司),γ干擾素(interferon-γ,INF-γ)及白細胞介素(interleukin,IL)-2試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司),氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司),蛋白胨溶液(上海源葉生物科技有限公司),75%乙醇(蘇州嘉鼎化學科技有限公司),10%雞紅細胞懸液(南京澤維爾生物科技有限公司),磷酸鹽緩沖液(上海之禮生物科技有限公司),2,4-二硝基氟苯(山東西亞化學科技有限公司)。超聲波破碎儀(北京星越天成科技有限公司),生物安全柜(青島海爾醫用低溫科技有限公司),高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠),平板離心機(蘇州盛斯爾機械制造有限公司),高壓消毒器(上海三申醫療器械有限公司),二氧化碳(CO2)孵孕箱(天津開關照明廠),全自動酶標儀(美國Molecular Devices公司),分光光度計(南京菲勒儀器有限公司),光學顯微鏡(日本奧林帕斯公司),流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2 血液、菌種及動物

血液及菌種均由本院提供,其中血液標本為健康兒童外周血,菌種標本為痰液樣本,取自反復呼吸道感染的患兒。40只SPF級小鼠購自北京華阜康公司,雌雄各20只,6～8周齡,體質量18～22 g。納入標準:①患兒滿足《反復呼吸道感染的臨床概念和處理原則》[7]診斷標準;②患兒存有反復呼吸道感染的既往史;③患兒年齡5～13歲。

1.3 細菌聯合疫苗制備

從痰液樣本中將菌種分離培養,生理鹽水沖洗所獲菌種(溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌B型、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌);采用超聲波破碎儀分別將不同細菌破碎;將蛋白質沉淀后透析,采用分光光度計測量蛋白水平,并以細菌蛋白作為抗原;將所獲細菌蛋白與0.9%生理鹽水混合,制備成聯合疫苗。根據聯合疫苗質量濃度分為對照組(生理鹽水)、低水平組(0.1 g/L疫苗)、中水平組(0.3 g/L疫苗)及高水平組(0.5 g/L疫苗)[8]。

1.4 體外實驗

1.4.1 單個核細胞懸液制備 取20 mL外周血樣本,抗凝,20 mL磷酸鹽緩沖液混勻;將混勻液均勻置于細胞分離液表面;梯度離心20 min,2 000 r/min;收集白膜層,采用RPMI-1640培養基洗滌3次,每次離心10 min,2 000 r/min;去除上清液,經RPMI-1640培養基吹打,制成所需單個核細胞懸液。

1.4.2 單個核細胞增殖活性測定 取96孔平板培養板,采用RPMI-1640培養基將單個核細胞懸液調至1×106個/mL,并依次每孔接種100 μL;加入相應質量濃度(0.1、0.3、0.5 g/L)聯合疫苗,同時設置等體積陰性對照孔;完成后置于37 ℃及5%CO2的孵孕箱中,分別在培養24、48、72 h時,向每孔內加入10 μL CCK-8試劑,繼續培養4 h;采用全自動酶標儀檢測450 nm處光密度值,反映細胞增殖活性。

1.4.3 單個核細胞淋巴細胞表型變化測定 取24孔平板培養板及單個核細胞懸液,采用RPMI-1640培養基將單個核細胞懸液調至5×106個/mL,依次每孔接種2.0 mL;每孔標號,依次為1～48號,將1～12號設置為對照組,13～24號設置為低水平組,24～36號設置為中水平組,37～48號設置為高水平組。低、中、高水平組每孔滴加0.1 mL的0.1、0.3、0.5 g/L聯合疫苗,對照組每孔加入0.1 mL的RPMI-1640培養基。連續培養6天,將細胞懸液取出,離心5 min,1 500 r/min;采用磷酸鹽緩沖液洗滌;加入相應熒光素標記的抗CD4、抗CD8及抗CD19抗體,隨后在避光環境下孵育30 min;孵育結束后以磷酸鹽緩沖液洗滌2次;采用1%多聚甲醛固定,流式細胞儀檢測CD4+、CD8+及CD19+。

1.4.4 細胞因子測定 在測定單個核細胞增殖活性前,取上清液50 μL,隨后繼續培養,并在第2、第4、第8天采用INF-γ及IL-2試劑盒測定INF-γ及IL-2含量。

1.5 體內實驗

1.5.1 造模處理 將40只SPF級小鼠分為4組,每組10只,且雌雄各一半,根據所用聯合疫苗質量濃度分為對照組、低水平組、中水平組及高水平組[8];全部小鼠適應性喂養10天,隨后低水平組、中水平組及高水平組小鼠每天上午灌服0.2 mL對應質量濃度的聯合疫苗,對照組則在相同時間灌服0.2 mL生理鹽水;灌服10天后處死全部小鼠。

1.5.2 遲發型超敏反應測定 各組小鼠處理9天后,取50 μL 1%的2,4-二硝基氟苯涂抹于小鼠右耳前后兩面,隨后左耳涂抹等量丙酮-橄欖油;24 h后處死小鼠,采用8 nm打孔器分別在左右耳同一部位打下圓耳片,并進行稱重;腫脹度=右耳質量-左耳質量。

1.5.3 脾臟指數及胸腺指數測定 對處死小鼠稱重,完成后取出脾臟及胸腺,清理表面血液后,對脾臟及胸腺進行稱重;脾臟(胸腺)指數=脾臟(胸腺)質量/小鼠體質量。

1.5.4 巨噬細胞吞噬功能測定 各組小鼠處理7天后,將1%蛋白胨溶液注射至小鼠腹腔,1次/天,3天。第3天注射結束后,間隔24 h,并將10%的雞紅細胞懸液1 mL注射至小鼠腹部,30 min后處死小鼠,并再次向小鼠腹腔注射2 mL生理鹽水;揉按小鼠腹腔1 min,將腹腔內液體混勻;混勻后取1 mL腹腔液;將所取腹腔液均勻涂抹于載玻片,置于37 ℃恒溫箱孵育30 min,固定,染色,沖洗,晾干后于顯微鏡下觀察。吞噬指數=雞紅細胞被吞噬數/巨噬細胞數。

1.5.5 血清溶血素含量測定 各組小鼠灌注聯合疫苗3天后,小鼠腹部注射1 mL 10%雞紅細胞懸液。免疫結束后,處死小鼠并摘取其眼球取血;離心,取血清,生理鹽水稀釋500倍;將10%雞紅細胞懸液、1 mL稀釋血清在同一試管內混勻;將混勻液作為對照;取混勻液,放置于37 ℃恒溫水浴下30 min,冰浴;離心后取上清液,采用酶標儀在波長為540 nm處測量光密度(optical density,OD)值。

1.6 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行數據處理與分析。計量資料采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,計數資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 聯合疫苗對人外周血單個核細胞增殖活性的影響

各組單個核細胞增殖活性均隨時間延長而升高,并且在相同時間內,聯合疫苗質量濃度越高,單個核細胞增殖活性越高(P<0.05;表1)。

表1 聯合疫苗對人外周血單個核細胞增殖活性OD值的影響

2.2 聯合疫苗對單個核細胞淋巴細胞表型的影響

與對照組比較,低、中、高水平組單個核細胞CD4+、CD19+水平升高,CD8+水平降低,且隨著聯合疫苗質量濃度升高,各指標水平變化越明顯(P<0.05;表2)。

表2 聯合疫苗對單個核細胞淋巴細胞表型的影響 %

2.3 聯合疫苗對細胞因子的影響

各組INF-γ及IL-2水平均隨時間延長而升高,并且在相同時間內,聯合疫苗質量濃度越高,INF-γ及IL-2水平越高(P<0.05;表3)。

表3 聯合疫苗對細胞因子的影響 ng/L

2.4 聯合疫苗對小鼠各免疫性指標水平影響

與對照組比較,低、中、高水平組腫脹度、脾臟指數、胸腺指數、吞噬指數及血清溶血素水平均升高,且隨著聯合疫苗質量濃度升高而升高(P<0.05;表4)。

表4 聯合疫苗對小鼠各免疫性指標水平的影響

3 討 論

中國呼吸道感染發病率較高,且兒童發病率高于成人,臨床上常采用抗菌藥物進行治療,但導致各類致病菌耐藥性均有所升高[9-10]。因此需采用有效的預防措施以降低呼吸道感染發病率。接種疫苗為預防疾病的重要措施,但目前中國所接種疫苗主要為進口疫苗,因其價格較為昂貴,從而影響接種率,同時預防效果亦需經過大量實驗研究[11-12]。

本次研究采用溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌B型、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌等中國呼吸道感染常見的6種病菌制成聯合疫苗,從而對預防中國呼吸道感染疾病更具有針對性。本研究結果顯示,單個核細胞增殖活性隨聯合疫苗質量濃度與培養時間的增加而升高,說明在本次實驗所用質量濃度區間,質量濃度升高可提高單個核細胞增殖活性。由于單個核細胞可通過吞噬病原體及產生細胞因子等方式參與免疫反應,故當單個核細胞增殖活性越高則反映機體對免疫刺激具有較強應答功能[13-14]。王國征等[15]研究表明,單個核細胞增殖活性越高,則利于促進細胞因子分泌,而本研究亦發現各組INF-γ及IL-2水平均隨時間延長而升高,并且在相同時間內,聯合疫苗質量濃度越高,INF-γ及IL-2水平越高。INF-γ具有調節免疫反應、增強抗菌能力和促進細胞毒性的功能,并且其不僅可以調節細胞免疫,亦參與體液免疫調節過程中[16]。IL-2可促進T細胞的增殖、分化及生存,同時亦可刺激B細胞增殖及抗體產生,從而增強體液免疫效應[17]。因此,當INF-γ及IL-2水平升高時,則提示聯合疫苗能增強淋巴細胞活性,利于調動免疫功能,并起到預防呼吸道感染作用。另外,CD4+及CD8+均為T細胞表面產物,CD19+為B細胞表面產物,三者均參與了細胞及體液免疫,當CD4+及CD19+水平升高及CD8+水平降低,則可表明機體免疫功能越高[18-19]。本研究結果顯示,隨著聯合疫苗質量濃度的增加,小鼠體內CD4+及CD19+水平均增加,CD8+水平降低;提示接種聯合疫苗質量濃度越高,對細胞及體液免疫調節能力越強,小鼠免疫功能越高。

遲發型超敏反應由T細胞介導,可對免疫功能進行衡量,因此當腫脹度越高,則提示遲發型超敏反應程度越高,免疫功能越強[20]。脾臟及胸腺可調節免疫細胞以應對感染等,當脾臟指數及胸腺指數升高,則提示免疫反應增強[21]。吞噬指數可反映巨噬細胞等免疫細胞對外來病菌吞噬及清除能力。溶血素參與了機體對抗感染及清除病菌的免疫反應[22],因此當血清溶血素水平升高,則代表機體的免疫反應越高。本研究結果顯示,隨著接種聯合疫苗質量濃度的增加,小鼠的腫脹度、脾臟指數、胸腺指數、吞噬指數、血清溶血素水平均升高;提示接種聯合疫苗質量濃度越高,小鼠的體液免疫功能越強。

綜上,呼吸道感染細菌聯合疫苗有利于提高細胞及體液免疫能力,且在呼吸道感染細菌聯合疫苗質量濃度為0.5 g/L時,可獲得的免疫效果最佳。