FBXO22表達對HPV陽性宮頸癌細胞生物學行為的影響

白雪, 高福賢, 王春曉, 黃新瑞

滄州市人民醫院婦科一區,河北滄州061000

宮頸癌(cervical cancer,CC)是女性常見婦科惡性腫瘤,人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)尤其是HPV-16和HPV-18的持續感染在宮頸癌發生中起著重要作用[1]。盡管隨著宮頸癌篩查和HPV疫苗普及,宮頸癌發病率略有下降,但近年宮頸癌發病有年輕化趨勢,尤其對于無手術機會的晚期宮頸癌尚需要更有效的治療方案。近年來,免疫治療的興起給晚期宮頸癌患者帶來了新的希望。F-box蛋白22(FBXO22)是F-box蛋白家族中的一員,FBXO22在多種腫瘤的發生發展中起重要的作用,FBXO22可通過泛素化降解抑癌基因及其產物從而促進腫瘤惡性進程[2],如FBXO22通過泛素化降解核PTEN促結腸癌進程[3];FBXO22通過多聚泛素化降解P21促進肝癌細胞增殖,并引起肝癌患者不良預后[4];FBXO22還可促進抑癌基因LKB1降解,下調其表達水平,促進肺癌惡性進程[5];FBXO22通過調控不同底物,促進乳腺癌生長,增強[6]或抑制[7]其遷移和侵襲能力等。本研究初步通過TCGA數據庫分析發現,FBXO22在宮頸癌患者中表達上調,提示FBXO22可能與宮頸癌密切相關,因此本研究旨在探討FBXO22表達對HPV陽性宮頸癌細胞生物學行為的影響,進一步挖掘宮頸癌免疫治療的新靶點,為臨床研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

H8細胞(人宮頸上皮永生化細胞)、宮頸癌細胞株Hela(HPV-18+)、CaSki(HPV-16+)、SiHa(HPV-)(購自中國科學院細胞庫);FBXO22抗體(購自美國Proteintech Group);辣根過氧化物酶標記的鼠源或兔源免疫球蛋白抗體(美國CST公司);Lipo2000(Life Technologies);DNA聚合酶(北京NEB生物技術有限公司);T4連接酶(Takara);Transwell小室(美國Corning);電泳儀(美國Bio-rad公司);PCR儀(瑞士Roche公司);流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞培養及分組

H8細胞和CaSki細胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,Hela細胞和SiHa細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養基,置于37 ℃ 5%CO2恒濕培養箱中傳代培養。Hela細胞和CaSki細胞均被分為空載體組(sh-NC組)和FBXO22敲低組(敲低組),或對照組和FBXO22過表達組(過表達組)。

1.3 真核過表達質粒和shRNA質粒的構建

真核過表達質粒構建:設計FBXO22引物序列(F:5′-CGGAGCACCTTCGTGTTGA-3′;R:5′-CACACACTCCCTCCATAAGCG-3′)并合成,進行PCR擴增。將FBXO22序列和過表達真核PBABE-Flag載體用T4 DNA ligase連接,轉化入感受態細胞DH5α,加入抗性LB培養基,均勻涂布平板,倒置后37 ℃過夜。從每個轉化平板上分別挑取4個克隆,搖菌并提取質粒,37 ℃酶切2 h。電泳并回收酶切的FBXO22片段,同時進行質粒測序驗證正確性。FBXO22敲除shRNA質粒構建:將特異靶向FBXO22的shRNA片段與線性化pSIREN Retro-Q載體連接,構建特定基因的敲除質粒。靶向shRNA片段的序列為shFBXO22-1(sh-1,GTGTGGTCCTTGTCTTTGGTT)和shFBXO22-2(sh-2,CGCATCTTACCACATACAGTT)。同時,使用無靶向效應的序列插入到pSIREN Retro-Q載體構建空載體sh-NC組。

1.4 Hela、CaSki細胞過表達和沉默FBXO22基因的轉染

取對數生長期細胞經胰酶消化后,調整細胞為1×105個/mL,分別將Hela和CaSki細胞接種于6孔板24 h后取出,分別用無血清培養基洗滌3次,放回培養箱培養至60%～70%匯合時開始轉染。取200 μL無血清培養基,加入12 μL質粒和12 μL轉染試劑,渦旋10 s后于室溫靜置15 min,緩慢滴入6孔板,輕柔搖晃混勻;6 h后細胞換液,繼續正常培養備用。

1.5 qRT-PCR檢測

用TRIzol試劑提取總RNA,反轉錄合成cDNA。PCR引物序列GAPDH:上游5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′,下游5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′;FBXO22:上游5′-CGGAGCACCTTCGTGTTGA-3′,下游5′-CACACACTCCCTCCATAAGCG-3′。PCR反應條件:94 ℃5 min,94 ℃40 s,53 ℃45 s,72 ℃80 s,28個循環;72 ℃ 10 min。采用2-ΔΔCT公式計算表達量。

1.6 Western blotting檢測

收集細胞后提取總蛋白,進行BCA法蛋白定量,凝膠電泳并轉膜3 h,封閉1 h。加入一抗,4 ℃過夜孵育,TBST洗膜3次,每次10 min。加入二抗孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min。使用ECL發光試劑,進行X片曝光、顯影、定影,檢測FBXO22表達。

1.7 MTT檢測

收集細胞懸液,每組設置6個復孔,混勻后的細胞懸液每孔加入100 μL到96孔板。細胞貼壁5 h后更換為150 μL完全培養基,再加入20 μL 5 g/L MTT溶液,培養4 h;棄去上清,每孔加入150 μL DMSO溶液;常溫搖床搖晃10～15 min。選擇490 nm波長,在酶聯免疫監測儀上測定各孔光密度值。重復檢測10天,繪制細胞生長曲線。

1.8 細胞克隆形成實驗

收集細胞,使用含10%胎牛血清的完全培養基重懸并計數。各實驗組接種細胞700個/孔于6孔板中,每3天換液并觀察細胞狀態,培養14天。鏡下拍照,每孔用PBS洗滌1次,加入1 mL 4%多聚甲醛固定40 min,再用PBS洗滌1次,加入結晶紫染液1 mL,染色15 min。PBS洗滌細胞,晾干后對整板及每孔拍照,觀察克隆形成情況。

1.9 流式細胞術

取對數生長期的細胞經胰酶消化后,用4 ℃預冷PBS洗滌并重懸,1 500 r/min離心5 min,加入4 ℃預冷的70%乙醇吹打混勻,用封口膜封口后4 ℃冰箱過夜固定。檢測前將固定的細胞2 000 r/min離心4 min,用4 ℃預冷的PBS洗滌2次,100 μL 100 mg/L RNase A和0.2% Triton X-100重懸細胞,37 ℃水浴30 min,加入1 g/L碘化丙啶50 μL混勻,室溫避光孵育30 min。在流式細胞儀檢測前用300目尼龍網過濾,上機結束后用FlowJo軟件分析細胞周期時相分布。

1.10 劃痕實驗

在6孔板中用間距0.5 cm橫線作標記,取對數生長期的細胞經胰酶消化后接種入6孔板培養過夜,直至單層細胞覆蓋6孔板。用移液槍頭在6孔板上垂直畫一條直線,用PBS洗滌3次,使用無血清培養基在培養箱中培養;在顯微鏡下定期觀察0、24 h,隨機采集3張以上視野圖像進行觀察并測量劃痕寬度。

1.11 Transwell侵襲實驗

在Transwell小室涂布稀釋后的基質膠,靜置成膜。每組細胞設置3個復孔,在小室上腔中接種100 μL細胞稀釋液,下腔中加入500 μL含有10%胎牛血清的培養液。Transwell小室置于培養箱中36 h。擦去小室中上層細胞,加入4%多聚甲醛固定10 min后用0.1%結晶紫溶液染色。鏡下隨機選取4個高倍視野計數,取4個視野均值作為穿膜細胞數。

1.12 統計學分析

2 結 果

2.1 各組細胞FBXO22表達水平的比較

FBXO22 mRNA和蛋白表達水平Hela、CaSki、SiHa細胞高于H8細胞,HPV陽性的Hela和CaSki細胞高于HPV陰性的SiHa細胞(P<0.05;圖1)。提示FBXO22在宮頸癌細胞中呈現過表達,且在HPV陽性的宮頸癌細胞中過表達更為顯著,因此Hela和CaSki被選定用于后續實驗。

圖1 各組細胞FBXO22表達水平的比較A為Western blotting;B為qRT-PCR。a為P<0.05,與H8細胞比較;b為P<0.05,與SiHa細胞比較。

2.2 FBXO22穩定敲低和過表達細胞系的構建

與sh-NC組比較,敲除質粒(sh-1和sh-2)轉染細胞后FBXO22 mRNA和蛋白表達均降低(P<0.05;圖2A),提示成功構建穩定敲低FBXO22基因的Hela和CaSki細胞,其中sh-1轉染效率較高,因此sh-1被選定為敲低組進行后續實驗。與對照組比較,過表達質粒轉染細胞后FBXO22 mRNA和蛋白表達均增加(P<0.05;圖2B),提示成功構建穩定過表達FBXO22基因的Hela和CaSki細胞。

圖2 FBXO22穩定敲低和過表達細胞系的構建A為敲低FBXO22時的Western blotting和qRT-PCR;B為過表達時的Western blotting和qRT-PCR。a為P<0.05,與sh-NC組比較;b為P<0.05,與對照組比較。

2.3 FBXO22穩定敲低和過表達對細胞增殖的影響

細胞生長曲線和細胞克隆形成實驗發現,在Hela細胞和CaSki細胞中,敲低組細胞增殖能力低于sh-NC組,過表達組細胞增殖能力高于對照組(P<0.05;圖3),提示FBXO22對Hela、CaSki細胞增殖具有促進作用。

圖3 FBXO22穩定敲低和過表達對細胞增殖的影響a為P<0.05,與sh-NC組比較;b為P<0.05,與對照組比較。

2.4 FBXO22穩定敲低和過表達對細胞周期的影響

流式細胞術分析發現,敲低組G2/M細胞百分率高于sh-NC組,過表達組G2/M細胞百分率低于對照組(P<0.05;圖4),提示FBXO22能抑制Hela、CaSki細胞G2/M期阻滯,促進細胞異常增殖。

圖4 FBXO22穩定敲低和過表達對細胞周期的影響

2.5 FBXO22穩定敲低和過表達對細胞遷移的影響

24 h后劃痕寬度Hela細胞敲低組(59.2±0.68)μm大于sh-NC組(37.1±0.54)μm,CaSki細胞敲低組(57.6±0.64)μm大于sh-NC組(37.6±0.59)μm(P<0.05);Hela細胞過表達組(12.4±0.37)μm小于對照組(36.9±0.43)μm,CaSki細胞過表達組(14.5±0.67)μm小于對照組(35.2±0.68)μm(P<0.05;圖5),表明FBXO22可增強Hela、CaSki細胞的遷移能力。

圖5 FBXO22穩定敲低和過表達對細胞遷移的影響(100×)

2.6 FBXO22穩定敲低和過表達對細胞侵襲的影響

穿膜細胞數Hela細胞敲低組(69±7.23)個低于sh-NC組(102±5.64)個,CaSki細胞敲低組(65±6.44)個低于sh-NC組(101±4.59)個(P<0.05);Hela細胞過表達組(183±6.63)個高于對照組(102±5.64)個,CaSki細胞過表達組(178±3.47)個高于對照組(101±4.59)個(P<0.05;圖6),提示FBXO22可增強Hela、CaSki細胞的侵襲能力。

圖6 FBXO22穩定敲低和過表達對細胞侵襲的影響(200×)

3 討 論

世界衛生組織調查報告顯示,2020年宮頸癌仍是女性常見的癌癥之一[8],由于宮頸癌惡性程度高、侵襲性強、治療方法局限、發病年輕化、預后較差、易復發[9-10]等特點,其發病率和病死率仍居高不下。HPV是宮頸癌主要致病因素,在癌病理組織中檢出率達99%,HPV-16和HPV-18是高危人乳頭瘤病毒,占宮頸癌發病的70%。為了探索宮頸癌的病因,開發更高效的治療方法,進行宮頸癌細胞惡性生物學行為影響因素及機制的研究具有重要意義。

FBXO22第一次進入人們視野是作為p53的靶向基因[11],參與p53誘導的特異性蛋白的降解[12]。有研究表明,FBXO22是原發性乳腺癌的獨立預后指標,FBXO22過表達患者的總生存期和無病生存期明顯短于FBXO22低表達患者,敲除FBXO22抑制了裸鼠體外細胞生長和腫瘤形成,而過表達FBXO22增加了細胞活力[13]。FBXO22通過缺氧誘導因子-1α/血管內皮生長因子途徑抑制乳腺癌細胞[14]、黑素瘤細胞[15]遷移、侵襲和血管生成。lncRNA 0006282通過miR-155上調FBXO22表達,促進胃癌的發展[16]。FBXO22通過抑制基質金屬蛋白酶-9抑制人腎細胞癌遷移[17];lncRNA SNHG14通過miR-433-3p/FBXO22軸促進骨肉瘤進展[18]。FBXO22通過MAPK/ERK通路促進上皮性卵巢癌的生長和遷移并抑制自噬[19]。另一方面,FBXO22有時表現出腫瘤的抑制特性。在雌激素受體陽性和人表皮生長因子受體2型陰性乳腺癌患者中,FBXO22表達降低與預后不良緊密相關[20]。FBXO22低表達與乳腺癌患者低生存率有關[21]。同樣有研究者在腎細胞癌組織的免疫組化分析中發現,與正常腎組織比較,腎細胞癌標本中FBXO22的表達水平降低,FBXO22在腎細胞癌患者中的低表達與腫瘤大小、TNM分期和生存率差異有關[17]。

盡管FBXO22與多種腫瘤的相關性已被證實,FBXO22對于宮頸癌發生、發展和遷移的作用卻未見證實。因此,本研究設計并進行了相關實驗,以期發現宮頸癌治療的新靶點,為宮頸癌的個體化精準治療提供理論基礎。本研究首先通過TCGA數據庫分析發現,FBXO22在宮頸癌患者中表達上調,隨后通過qRT-PCR和Western blotting驗證了HPV陽性Hela細胞和CaSki細胞的FBXO22表達水平較HPV陰性的SiHa細胞和H8細胞顯著上調。為了進一步確定FBXO22在HPV陽性宮頸癌發生發展中的作用,本研究選擇了HPV陽性的Hela和CaSki細胞,利用細胞功能缺失或獲得的方法,分別構建了FBXO22敲除和過表達模型,檢測構建模型后FBXO22的表達水平,進行了一系列細胞功能實驗,結果表明,FBXO22低表達下調了FBXO22 mRNA及蛋白的表達水平,抑制了HPV陽性Hela和CaSki細胞的增殖、遷移及侵襲功能,而FBXO22過表達則可上調FBXO22 mRNA及蛋白的表達水平,促進HPV陽性Hela和CaSki細胞的增殖、遷移及侵襲功能。

綜上,本研究結果顯示,FBXO22對宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為均有明顯的促進作用。但關于其調控宮頸癌細胞惡性行為的具體機制尚不明確,需要進一步的實驗研究證實。