JMJD2B、HPIP對宮頸癌Hela細胞生物學行為的影響

李媛, 苗曉紅

1.遵化市人民醫院婦科,河北唐山064200;2.唐山市婦幼保健院婦科,河北唐山063000

宮頸癌是婦科常見腫瘤,目前臨床常采用手術、放療、化療等治療,但患者生存率仍然較低[1],尋找宮頸癌早期分子標志物及潛在治療靶點已成為研究熱點。JMJD2B是缺氧誘導因子-1α的下游靶基因,在腫瘤發生發展中發揮重要作用[2-3],下調JMJD2B表達水平可抑制卵巢癌細胞增殖[4]。HPIP是轉錄因子PBX的輔助抑制劑,參與器官形成和腫瘤發生[5],HPIP在宮頸鱗癌中表達上調[6],影響宮頸鱗癌發展進程。而JMJD2B和HPIP與宮頸癌的關系目前少見報道,本文主要分析JMJD2B、HPIP對宮頸癌Hela細胞生物學行為的影響,以期為宮頸癌基礎和臨床研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要儀器、試劑和細胞

CCK-8試劑盒購于武漢純度生物科技有限公司;TRIzol試劑購于上海文韌生物科技有限公司,反轉錄試劑盒、定量PCR試劑、酶標儀購于上海研卉生物科技有限公司;熒光定量PCR儀購于上海佐明機械設備貿易有限公司;JMJD2B抗體、HPIP抗體購于上海雅吉生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標記的抗兔、抗鼠二抗購于上海科敏生物科技有限公司。攜帶JMJD2B基因片段si-JMJD2B、攜帶HPIP基因片段si-HPIP和無同源性陰性對照載體[si-NC-JMJD2B(si-NC-J)和si-NC-HPIP(si-NC-H)]購于美國Invitrogen公司;si-JMJD2B序列為5′-UCUCCAUCACCUGCCUCAAGCACAA-3′,其si-NC序列為5′-CCUACAUCCCGAUCGAUGAUGUUGA-3′;si-HPIP序列為5′-CTGCTGGACAAGCTGGCCAAGGAGAACCA-3′,其si-NC序列為5′-CGGCAAGCUGACCCUGAAGTT-3′。

宮頸癌細胞系Hela和人正常宮頸上皮細胞(normal human cervical epithelial cells,HUCEC)購于中科院上海細胞庫。

1.2 細胞培養及轉染

將Hela細胞和HUCEC置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中培養,并選用對數生長期細胞進行后續實驗。實驗將細胞分si-JMJD2B組、si-NC組、si-HPIP組,根據轉染試劑說明書,分別將si-JMJD2B、si-NC、si-HPIP質粒轉染至si-JMJD2B組、si-NC組、si-HPIP組細胞,培養48 h后收集細胞,以備后續實驗。

1.3 qRT-PCR檢測JMJD2B和HPIP mRNA表達

采用TRIzol法提取細胞中總RNA,反轉錄獲得cDNA,進行qRT-PCR擴增,設置反應條件以β-actin作為反應內參。采用2-ΔΔCT法計算目標基因mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.4 Western blotting檢測JMJD2B和HPIP蛋白水平

收集Hela、HUCEC、si-NC-J、si-JMJD2B、si-NC-H、si-HPIP組細胞加入裂解液提取總蛋白進行電泳后轉膜,封閉1 h,加入JMJD2B、HPIP一抗(1∶2 000),4 ℃過夜孵育。添加相應二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h,洗滌。ECL化學發光液顯色,以β-actin為內參,成像系統獲得蛋白質條帶。

1.5 Hela細胞增殖實驗

收集si-NC-J、si-JMJD2B、si-NC-H、si-HPIP組細胞(5×103個/孔)接種于96孔板中,將細胞置于CO2培養箱進行培養,每孔加入10 μL CCK-8溶液,避光孵育2 h,于0、24、48、72、96、120 h時使用酶標儀(λ=450 nm)檢測細胞光密度(optical density,OD),本實驗平行重復3次。

1.6 Hela細胞Transwell侵襲實驗

在24孔板中,將5×104個/mL細胞懸液接種于內鋪Matrigel膠的Transwell小室中,于37 ℃、5%CO2培養48 h。用棉簽擦去Transwell小室面上的細胞,固定結晶紫染色,隨機取5個視野于顯微鏡下拍照,計數。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 Hela細胞和HUCEC中JMJD2B、HPIP蛋白表達的比較

Western blotting結果顯示,宮頸癌Hela細胞JMJD2B、HPIP蛋白表達高于HUCEC(P<0.05;圖1)。

圖1 Hela細胞和HUCEC中JMJD2B、HPIP蛋白表達的比較a為P<0.05,與HUCEC比較。

2.2 si-JMJD2B或si-HPIP對Hela細胞JMJD2B、HPIP mRNA和蛋白表達的影響

qRT-PCR和Western blotting結果顯示,Hela細胞轉染si-JMJD2B、si-HPIP后,JMJD2B和HPIP的mRNA和蛋白表達均降低(P<0.05;圖2)。

圖2 si-JMJD2B、si-HPIP對Hela細胞JMJD2B、HPIP mRNA和蛋白表達的影響a為P<0.05,與si-NC-J組比較;b為P<0.05,與si-NC-H組比較。

2.3 si-JMJD2B、si-HPIP對Hela細胞增殖的影響

細胞增殖實驗結果顯示,si-JMJD2B組和si-HPIP組細胞增殖活力明顯小于si-NC-J組或si-NC-H組(P<0.05;圖3)。

圖3 si-JMJD2B和si-HPIP對Hela細胞增殖活力的影響a為P<0.05,與同時間si-NC-J組比較;b為P<0.05,與同時間si-NC-H組比較。

2.4 si-JMJD2B和si-HPIP對Hela細胞遷移和侵襲的影響

Transwell實驗結果顯示,si-JMJD2B組和si-HPIP組遷移、侵襲細胞數量明顯低于si-NC-J組或si-NC-H組(P<0.05;圖4)。

3 討 論

宮頸癌是嚴重威脅全球女性生命健康的惡性疾病,近年來,宮頸癌發病率呈上升趨勢,且患者年齡越來越小[7]。傳統宮頸癌治療以手術和放化療為主,但其治療效果及患者預后并不能達到理想狀態[8]。因此,尋找宮頸癌預防、診斷及治療的生物標志物,對治療和控制患者疾病發展具有至關重要的意義。

本研究Western blotting檢測結果顯示,JMJD2B、HPIP在宮頸癌Hela細胞中蛋白表達高于HUCEC,推測JMJD2B和HPIP表達水平與宮頸癌發展進程存在一定關聯。JMJD2B是組蛋白去甲基化酶JMJD2家族成員,能夠識別二甲基化和三甲基化H3K9、H3K36,引起組蛋白的去甲基化[9]。組蛋白修飾是表觀遺傳學機制之一,而組蛋白甲基化是組蛋白修飾的一種方式,組蛋白修飾與基因的失活、X染色體失活、基因印記等基因沉默現象以及DNA修復有關[10-11]。有研究顯示,HPIP蛋白高表達與子宮內膜癌發展進程有關[12]。這些研究均表明JMJD2B和HPIP異常表達與腫瘤的發生發展有關,本研究結果顯示,JMJD2B和HPIP在宮頸癌細胞中高表達,其異常表達可能與腫瘤惡性行為學有關,與上述其他研究結果類似。

本文分別構建干擾JMJD2B和HPIP基因表達模型,進行一系列功能實驗。本研究結果顯示,與si-NC-J組相比,si-JMJD2B組JMJD2B mRNA和蛋白表達水平降低;與si-NC-H組相比,si-HPIP組HPIP mRNA和蛋白表達水平降低,提示JMJD2B和HPIP細胞干擾模型構建成功。本研究發現,宮頸癌細胞干擾JMJD2B和HPIP基因表達后,細胞光密度、遷移和侵襲數量明顯下降。JMJD2B在干細胞分化、炎癥和多種惡性腫瘤的發生發展中發揮重要的表觀遺傳學作用[13],既往研究顯示,下調JMJD2B表達可以抑制卵巢癌細胞增殖能力[2]。HPIP蛋白具有多種功能,是腫瘤發生過程中重要的分子生物標志物[14]。研究顯示,HPIP蛋白異常表達與乳腺癌、肺癌和胃癌等多種腫瘤發生和轉移有關[15]。既往研究顯示,轉化生長因子-β1可以通過HPIP誘導非小細胞肺癌A549細胞增殖和轉移[16]。結合本研究結果表明,干擾JMJD2B和HPIP表達,Hela細胞增殖、遷移和侵襲能力受到抑制,進而抑制宮頸癌細胞的惡性行為學,JMJD2B和HPIP差異表達均能影響宮頸癌細胞生理病理過程。

綜上所述,JMJD2B和HPIP基因在宮頸癌細胞中表達上調,干擾JMJD2B和HPIP基因表達可明顯削弱Hela細胞增殖、遷移和侵襲能力,影響宮頸癌發展進程。對于MJD2B和HPIP基因之間是否存在關聯尚需進一步分析,且本項研究缺乏臨床數據支持,今后需深入探究。