ZNF224和DEPDC1在肺腺癌中的表達及其臨床意義

張婧, 楊丹, 陳思言

南充市中醫醫院內一科,四川南充637000

肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)的一種,其發病率逐年升高,早期無明顯癥狀,就診時多為中晚期,預后較差[1-2]。因此,尋找與肺腺癌患者預后相關的指標,對臨床制定干預措施,延長患者生命有積極意義。研究表明,LUAD發生發展與信號轉導、癌基因激活、自噬等有關[3-4]。近期報道顯示,DEP結構域蛋白1(DEP domain containing 1,DEPDC1)在LUAD中呈高表達,與LUAD患者不良預后相關[5]。過表達鋅指蛋白224(zinc finger protein224,ZNF224)可促進黑色素瘤細胞增殖、侵襲[6];DEPDC1可通過與ZNF224相結合,進而激活核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)信號通路,從而影響肝癌的病理過程[7]。本文測定ZNF224、DEPDC1在LUAD患者中的表達,分析二者相關性及其與LUAD患者預后的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2014年5月—2018年9月本院收治的LUAD患者73例,年齡43～74歲,平均(59.13±11.27)歲;男42例,女31例;腫瘤直徑≥5 cm 45例,<5 cm 28例;吸煙39例,未吸煙34例;TNM分期[8]:Ⅰ～Ⅱ期41例,Ⅲ～Ⅳ期32例;<60歲33例,≥60歲40例;中、高分化51例,低分化22例;表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)表達陽性35例,陰性38例;淋巴結未轉移者30例,轉移者43例。本研究經本院倫理委員會批準,且符合《赫爾辛基宣言》。

納入標準:①患者符合LUAD判定標準[9],且經術后病理學確診;②受試者或其家屬簽署知情同意書。排除標準:①轉移性肺癌;②臨床資料不全;③有放化療史;④嚴重肝腎功能不全。

1.2 Ualcan數據庫檢索

運用Ualcan數據庫(http://ualcan.path.uab.edu)檢索LUAD組織和正常肺組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達。gene symbol為ZNF224、DEPDC1在TCGA數據集中選擇肺腺癌進行檢索所得。

1.3 組織標本收集

收集患者經手術切除的LUAD組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣3 cm處的肺組織),剪取一部分,置于福爾馬林中固定,制備石蠟切片;另一部分迅速置于液氮中,24 h后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 qRT-PCR檢測ZNF224、DEPDC1 mRNA表達

研碎凍存的LUAD組織和癌旁組織,以TRIzol Reagent(15596018,美國GIBCO公司)獲得組織總RNA,以RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622,上海恒斐生物科技有限公司)獲取組織cDNA;利用HieffTTMqPCR SYBR? Green Master Mix(YB11201ES03,上海鈺博生物科技有限公司)、qRT-PCR儀(StepOne TM,美國ABI公司)擴增cDNA,讀取循環閾值(CT值)。97.8 ℃ 6 min,96 ℃ 20 s,63 ℃ 20 s,62.5 ℃ 15 s,40個循環。GAPDH作為內參,引物序列ZNF224上游為5′-GACAGCAATCCAAAGGGAAGGG-3′,下游為5′-CAGATTTGCTGGAAGGACCACTC-3′。引物序列DEPDC1上游為5′-CTCGTAGAACTCCTAAAAGGCATG-3′,下游為5′-CAACATCTTCCTGGCTTAGTTCTC-3′。引物序列GAPDH上游為5′-AGAGAGCAGGCTCATTGTG-3′,下游為5′-GCAGGCCAGGGATCGAATGAT-3′。ZNF224、DEPDC1 mRNA相對表達量以2-ΔΔCT法計算。

1.5 免疫組化法檢測ZNF224、DEPDC1蛋白表達

取4 μm厚石蠟切片,SP法染色,依據免疫組化試劑盒說明書進行常規操作,一抗為ZNF224抗體(CSB-PA026592LD01HU,美國Cusabio公司)、DEPDC1抗體(ab197246,英國abcam公司),經顯色、復染、脫水、封片后在顯微鏡(Leica DVM6,德國徠卡公司)下拍照。按染色程度(A)與陽性細胞比例(B)評分乘積判定ZNF224、DEPDC1蛋白表達情況:以A×B≥3分為陽性,否則為陰性[10]。

1.6 隨訪

73例LUAD患者均隨訪36個月,以LUAD患者手術當天為隨訪起點,以LUAD患者死亡或隨訪至2021年9月為隨訪終點,以門診或電話為主要隨訪方式,記錄LUAD患者生存情況。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計量資料采用配對t檢驗,計數資料采用χ2檢驗。Pearson相關性分析LUAD組織中ZNF224 mRNA及蛋白表達分別與DEPDC1 mRNA及蛋白表達的相關性。Kaplan-Meier生存曲線法分析LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達與LUAD患者預后的關系。COX回歸法分析LUAD患者預后的影響因素。α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 Ualcan數據庫檢索結果

Ualcan數據庫檢索顯示,LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達均高于正常肺組織(P<0.05;圖1)。

圖1 Ualcan數據庫檢索結果a為P<0.05,與正常肺組織比較。

2.2 LUAD組織、癌旁組織ZNF224、DEPDC1 mRNA及其蛋白表達情況

與癌旁組織相比,LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達升高(P<0.05;表1)。免疫組化顯示,ZNF224主要定位于細胞質/核,DEPDC1定位于細胞核(圖2)。LUAD組織ZNF224、DEPDC1蛋白表達陽性率均高于癌旁組織(P<0.05;表2)。

表2 LUAD組織、癌旁組織ZNF224、DEPDC1蛋白表達情況(n=73) 例(%)

圖2 LUAD組織ZNF224及DEPDC1蛋白表達情況(免疫組化法,200×)A為ZNF224蛋白表達陰性;B為ZNF224蛋白表達陽性;C為DEPDC1蛋白表達陰性;D為DEPDC1蛋白表達陽性。

2.3 LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA及其蛋白表達與臨床病理特征關系

分別以LUAD組織中ZNF224、DEPDC1 mRNA相對表達量平均值2.29、2.35為臨界值,≥臨界值者分別為ZNF224 mRNA高表達組(37例)、DEPDC1高表達組(39例),<臨界值者分別為ZNF224 mRNA低表達組(36例)、DEPDC1低表達組(34例)。結果顯示,LUAD組織TNM分期、分化程度、淋巴結轉移,ZNF224低表達組與高表達組、DEPDC1低表達組與高表達組比較,差異均有顯著性(P<0.05;表3、表4)。

表3 LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達與臨床病理特征關系 例(%)

表4 LUAD組織ZNF224、DEPDC1蛋白表達與臨床病理特征關系 例(%)

2.4 LUAD組織ZNF224與DEPDC1的相關性

LUAD組織ZNF224 mRNA與DEPDC1 mRNA呈正相關(r=0.569,P<0.05),ZNF224蛋白與DEPDC1蛋白呈正相關(χ2=27.455,P<0.05)。

2.5 LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達與LUAD患者預后的關系

73例LUAD患者存活49例,死亡24例,生存率67.12%。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,ZNF224 mRNA低表達組LUAD患者的平均生存時間34.69個月(95%CI:33.45～35.94),長于ZNF224 mRNA高表達組28.43個月(95%CI:25.53～31.34);DEPDC1 mRNA低表達組LUAD患者的平均生存時間34.53個月(95%CI:32.99～36.07),長于DEPDC1 mRNA高表達組28.90個月(95%CI:26.17～31.63)。Log-Rank檢驗結果顯示,ZNF224、DEPDC1 mRNA高、低表達組LUAD患者的累積生存率相比,差異均有統計學意義(P<0.05;圖3)。

圖3 LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達與LUAD患者預后的關系

2.6 COX回歸分析LUAD患者預后的影響因素

單因素及多因素COX回歸分析結果顯示,TNM分期、ZNF224、DEPDC1 mRNA、淋巴結轉移是影響LUAD患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05;表5)。

表5 影響LUAD患者預后的單因素和多因素COX回歸分析

3 討 論

LUAD起病隱匿,多數患者早期僅出現胸悶、咳嗽等癥狀,患者就診時多已錯失最佳治療時機[11]。此外,LUAD具有高度異質性,其病變過程涉及多種信號通路改變[12],因此,仍需尋找可早期診斷LUAD、評估LUAD患者預后的標志物。

DEPDC1的基因位于染色體1p31.2,其可參與信號轉導,影響腫瘤細胞增殖,與胃癌、大腸癌等關系密切[13-14]。研究發現,DEPDC1在NSCLC中表達失調,與NSCLC患者預后有關[15];另外,DEPDC1在LUAD中呈過表達,其可能激活上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程進而參與LUAD發生發展[16]。本文中LUAD組織DEPDC1 mRNA表達較高,與Li等[16]結果相符,且LUAD組織DEPDC1表達陽性率較高,提示DEPDC1可能與LUAD密切相關,推測DEPDC1可能通過影響EMT,調節信號轉導過程,進而影響LUAD病理過程。

ZNF224調節細胞因子分泌,與腫瘤的發生發展有關[17-18]。研究發現,ZNF224在慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)中呈高表達,可能是治療CLL的潛在靶標[19];另外,ZNF224在多發性骨髓瘤中表達升高,在多發性骨髓瘤中發揮促癌作用[20]。本研究中LUAD組織ZNF224 mRNA表達較高,與Ualcan數據庫檢索結果相符,且LUAD組織ZNF224表達陽性率高于癌旁組織,提示ZNF224可能與LUAD病理發展相關,推測過表達ZNF224可能通過影響血管內皮生長因子等分泌,激活相關信號通路,進而促進LUAD病理變化,但其機制有待深入探討。本文中ZNF224 mRNA低表達組LUAD患者累積生存率高于ZNF224 mRNA高表達組,DEPDC1 mRNA高表達組LUAD患者累積生存率低于DEPDC1 mRNA低表達組,提示DEPDC1、ZNF224可作為評估LUAD患者預后的輔助標志物。

Pearson相關性結果顯示,ZNF224 mRNA及其蛋白表達分別與DEPDC1 mRNA及其蛋白表達呈正相關,提示ZNF224可能與DEPDC1協同影響LUAD病情進程。COX回歸分析結果顯示,ZNF224 mRNA、DEPDC1 mRNA、TNM分期、淋巴結轉移均可能增加LUAD患者發生不良預后的風險,及時測定ZNF224、DEPDC1表達有助于臨床診治LUAD、評估LUAD患者預后。

綜上,LUAD組織中ZNF224、DEPDC1上調,ZNF224與DEPDC1呈正相關,且均與LUAD患者預后關系密切,有望作為評估LUAD患者預后的潛在標志物。