慢性牙周炎牙齦卟啉單胞菌感染患者NLRP3炎癥小體與炎癥反應(yīng)及焦亡指標(biāo)的相關(guān)性

武金強, 谷若萌, 馬子安

廊坊市人民醫(yī)院口腔科,河北廊坊065000

慢性牙周炎是菌斑微生物導(dǎo)致的牙周組織慢性炎癥性疾病,持續(xù)激活的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致牙周組織發(fā)生不可逆破壞,嚴(yán)重時會造成牙齒松動和脫落,其機制目前尚不十分清楚。牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎常見致病菌,局部組織中存在的模式識別受體能識別該病原菌,并通過下游信號通路激活炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及焦亡等,進而導(dǎo)致組織損傷和破壞[1-2]。NLRP3是一類模式識別受體,以NLRP3為核心的炎癥小體可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細胞焦亡,牙齦卟啉單胞菌導(dǎo)致的牙周膜細胞損害與激活NLRP3炎癥小體有關(guān)[3]。為深入認(rèn)識NLRP3炎癥小體在牙齦卟啉單胞菌感染導(dǎo)致慢性牙周炎中的作用,本研究分析慢性牙周炎牙齦卟啉單胞菌感染患者NLRP3炎癥小體與炎癥反應(yīng)及焦亡指標(biāo)的相關(guān)性,為臨床提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇本院2020年2月—2022年2月收治的慢性牙周炎患者300例,按照牙齦卟啉單胞菌感染情況分為陽性組194例和陰性組106例。陽性組男101例、女93例,年齡(48.31±7.71)歲;輕度138例,重度56例,病程1～4年;發(fā)生全口牙牙槽骨吸收22例,磨牙牙槽骨吸收67例,前牙牙槽骨吸收72例。陰性組男64例、女42例,年齡(48.09±7.45)歲;輕度76例,重度30例,病程1～4年;發(fā)生全口牙牙槽骨吸收10例,磨牙牙槽骨吸收31例,前牙牙槽骨吸收40例。兩組一般資料比較差異無顯著性(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合慢性牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[4];②均進行牙齦卟啉單胞菌檢測[4];③均通過正畸治療或拔除患牙獲得牙齦組織標(biāo)本;④均留取齦溝液標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn):①近3個月接受過抗感染治療、免疫治療;②糖尿病、自身免疫性疾病;③惡性腫瘤;④妊娠或哺乳者。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),取得患者或家屬知情同意,簽署知情同意書。

1.2 牙周健康指標(biāo)的評估

在治療前檢測兩組牙周健康指標(biāo)菌斑指數(shù)(plaque index,PLI)、牙齦指數(shù)(gingival index,GI)、附著喪失(atachment loss,AL)、牙周袋深度(pocket depth,PD)。

1.3 熒光定量PCR檢測牙周組織NLRP3炎癥小體mRNA

提取牙周組織總RNA,將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用熒光定量檢測試劑盒(北京天根生化科技公司)對cDNA中的目標(biāo)基因NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、Caspase-1進行熒光定量PCR擴增,按照試劑盒說明書操作,以β-actin為內(nèi)參,計算NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達水平。

1.4 ELISA檢測齦溝液中炎癥因子水平

將無菌紙放置在牙周袋底部10 s,取出放入1 mL無菌生理鹽水中,室溫下洗脫40 min,4 ℃3 000×g離心5 min,收集上清液即為齦溝液。采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(上海西唐生物科技公司)檢測齦溝液中白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。

1.5 Western blotting檢測牙周組織中焦亡標(biāo)志基因蛋白水平

采用組織裂解液對牙周組織進行勻漿,提取蛋白,Western blotting檢測牙周組織中焦亡標(biāo)志基因GSDMD-N蛋白水平。以β-tubulin為內(nèi)參計算GSDMD-N蛋白表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組牙周健康指標(biāo)的比較

陽性組PLI、GI、AL、PD高于陰性組(P<0.05;表1)。

表1 兩組牙周健康指標(biāo)的比較

2.2 兩組NLRP3炎癥小體mRNA的比較

陽性組牙周組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達水平高于陰性組(P<0.05;表2)。

表2 兩組牙周組織中NLRP3炎癥小體mRNA的比較

2.3 兩組炎癥因子水平的比較

陽性組齦溝液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平高于陰性組(P<0.05;表3)。

表3 兩組齦溝液中炎癥因子水平的比較

2.4 兩組GSDMD-N蛋白水平的比較

陽性組牙周組織中焦亡標(biāo)志基因GSDMD-N蛋白表達水平高于陰性組(P<0.05;圖1)。

圖1 兩組GSDMD-N蛋白水平的比較a為P<0.05,與陰性組比較。

2.5 NLRP3炎癥小體與牙周健康指標(biāo)、炎癥因子、焦亡標(biāo)志基因的相關(guān)性

NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達水平與PLI、GI、AL、PD、IL-1β、IL-18、TNF-α、GSDMD-N蛋白表達水平均呈正相關(guān)(P<0.05;表4)。

表4 NLRP3炎癥小體與牙周健康指標(biāo)、炎癥因子、焦亡標(biāo)志基因的相關(guān)性

3 討 論

牙齦卟啉單胞菌是促進慢性牙周炎的致病菌,相關(guān)研究證實,牙齦卟啉單胞菌的菌毛、莢膜、膜內(nèi)成分及其釋放的脂多糖、外膜蛋白等參與炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及焦亡、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等生物學(xué)環(huán)節(jié)的調(diào)控[5],但具體的生物學(xué)機制尚不清楚。

病原菌調(diào)控宿主細胞炎癥反應(yīng)、凋亡及焦亡的過程涉及模式識別受體對病原菌成分的識別及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[6-7]。NLRP3是具有廣泛生物學(xué)活性的模式識別受體,其與細胞內(nèi)ASC、Caspase-1共同組成炎癥小體,一方面直接參與細胞炎癥反應(yīng)及焦亡的調(diào)控,另一方面通過復(fù)雜的生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)參與氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡等的調(diào)控。慢性牙周炎發(fā)病過程中NLRP3炎癥小體表達增加已有相關(guān)報道[8];另有細胞實驗證實牙齦卟啉單胞菌感染能夠激活牙周膜細胞中NLRP3炎癥小體[4]。本研究證實,合并牙齦卟啉單胞菌感染的慢性牙周炎牙周組織中NLRP3炎癥小體的表達高于未感染牙齦卟啉單胞菌的牙周組織,并且NLRP3炎癥小體的表達與牙周炎病情指標(biāo)PLI、GI、AL、PD呈正相關(guān),提示慢性牙周炎發(fā)病過程中牙齦卟啉單胞菌感染對NLRP3炎癥小體具有激活作用,并且這一激活作用可能造成牙周炎病情加重。

NLRP3炎癥小體在識別病原菌的多種成分后通過細胞內(nèi)ASC招募Caspase-1,后者一方面能夠促進IL-1β、IL-18的成熟和釋放,進而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)激活,增加其他炎癥因子如TNF-α釋放[9];另一方面能夠裂解GSDMD的氨基末端、生成GSDMD并介導(dǎo)細胞焦亡[10]。在慢性牙周炎的多種模型中均存在炎癥反應(yīng)和細胞焦亡的過度激活[11-12]。本研究證實,合并牙齦卟啉單胞菌感染的慢性牙周炎齦溝液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平及牙周組織中GSDMD-N水平高于未感染牙齦卟啉單胞菌的牙周組織,提示牙齦卟啉單胞菌感染加重了慢性牙周炎的炎癥反應(yīng)和細胞焦亡。本研究進一步通過相關(guān)性分析證實,NLRP3炎癥小體表達與IL-1β、IL-18、TNF-α、GSDMD-N水平呈正相關(guān),這一結(jié)果符合NLRP3炎癥小體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細胞焦亡的生物學(xué)特性,進而也提示激活NLRP3炎癥小體與牙齦卟啉單胞菌感染加重慢性牙周炎的炎癥反應(yīng)和細胞焦亡有關(guān)。

本研究僅僅通過臨床樣本的檢測結(jié)果展開討論分析,雖然能夠初步揭示NLRP3炎癥小體在牙齦卟啉單胞菌感染加重慢性牙周炎病情、炎癥反應(yīng)和細胞焦亡中的作用,但未能通過細胞實驗、動物實驗獲得NLRP3炎癥小體對牙周組織健康狀況影響的直接證實。此外,牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎常見的致病菌,除此之外也存在其他致病菌,今后可進一步探索牙周炎發(fā)病過程中不同類型致病菌激活NLRP3的特點,進而有助于全面認(rèn)識牙周炎的分子生物學(xué)機制。