HIF-3α蛋白檢測(cè)在子宮內(nèi)膜病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值

張靜芳 易嘉升 陸寶明

【摘要】目的：探討缺氧誘導(dǎo)因子-3α（Hypoxia inducible factor-3α，HIF-3α）檢測(cè)在子宮內(nèi)膜病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值。方法：收集于本院就診的女性因良性疾病切除子宮患者的正常內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織標(biāo)本，其中正常內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜不典型增生、子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜非腺癌標(biāo)本各16例。免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜增生和不典型增生組織以及子宮內(nèi)膜腺癌組織和子宮內(nèi)膜非腺癌組織中HIF-3α蛋白的表達(dá)。Western blot檢測(cè)比較各組織HIF-3α表達(dá)情況。結(jié)果：與正常內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜增生癌變后HIF-3α的表達(dá)顯著增多，其中子宮內(nèi)膜不典型增生組織內(nèi)HIF-3α表達(dá)量最多，而子宮內(nèi)膜腺癌與子宮內(nèi)膜非腺癌組織內(nèi)無明顯差異。結(jié)論：HIF-3α蛋白檢測(cè)可作為臨床子宮內(nèi)膜病變篩查過程中的重要依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】HIF-3α蛋白；子宮內(nèi)膜病變；篩查

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目《HIF3α蛋白在不同子宮內(nèi)膜病變中的表達(dá)》（B2021277）

Application value of HIF-3α protein detection in screening of endometrial lesions

ZHANG Jingfang， YI Jiasheng， LU Baoming

East Guangdong Hospital， The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Meizhou， Guangdong 514000， China

【Abstract】Objective：To investigate the application value of Hypoxia inducible factor-3α （HIF-3α） detection in screening of endometrial lesions. Methods：The specimens of normal endometrial tissue， endometrial carcinoma tissue and paracancer tissue were collected from women who underwent hysterectomy due to benign diseases. There were 16 specimens of normal endometrial tissue， endometrial hyperplasia， endometrial atypical hyperplasia， endometrial adenocarcinoma and endometrial non-adenocarcinoma respectively. The expression of HIF-3α protein in normal endometrial tissue， endometrial hyperplasia and atypical hyperplasia tissue， endometrial adenocarcinoma tissue and endometrial non-adenocarcinoma tissue was detected by immunohistochemical assay. Western blot analysis was performed to compare HIF-3α expression in different tissues. Results： Compared with normal endometrial tissues， the expression of HIF-3α increased significantly after endometrial hyperplasia， and the expression of HIF-3α was the highest in endometrial atypical hyperplasia tissues， while there was no significant difference between endometrial adenocarcinoma and non-endometrial adenocarcinoma tissues. Conclusion：The detection of HIF-3α protein can be used as an important basis for clinical screening of endometrial lesions.

【Key Words】HIF-3α protein； Endometrial lesions； Screening

癌細(xì)胞可以利用氧氣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)癌癥進(jìn)展，缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducible factors，HIF）是調(diào)節(jié)氧氣穩(wěn)態(tài)的主要因子之一，負(fù)責(zé)與成年人體內(nèi)50萬億個(gè)細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞的氧氣供需相調(diào)試，在這個(gè)過程中，HIFs 激活數(shù)千個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因轉(zhuǎn)錄過程中激活或者介導(dǎo)血管生成、癌癥干細(xì)胞生成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外間質(zhì)重塑、葡萄糖和脂類代謝、免疫逃避、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等。其中在轉(zhuǎn)錄水平上，維持氧穩(wěn)態(tài)的重要節(jié)段是如何利用缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）的作用，以及為了響應(yīng)降低的氧可用性HIFs介導(dǎo)的每個(gè)細(xì)胞如何轉(zhuǎn)錄程序進(jìn)行重排。缺氧誘導(dǎo)因子是細(xì)胞應(yīng)對(duì)缺氧狀態(tài)的關(guān)鍵因子。

HIF是α/β異二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的反應(yīng)，在三種HIF-α亞型中，HIF-3α與HIF-1α和HIF-2α在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)節(jié)方面不有所不同，并且長(zhǎng)期以來，HIF-3α被認(rèn)為是HIF調(diào)控基因的負(fù)調(diào)控因子并且具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，在缺氧時(shí)與HIF-1和HIF-2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶基因中的轉(zhuǎn)錄元件，從而對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響。缺氧誘導(dǎo)因子的活化隨后誘導(dǎo)下游靶基因，導(dǎo)致一系列反應(yīng)，由此產(chǎn)生的異常過程或代謝產(chǎn)物反過來影響缺氧誘導(dǎo)因子的穩(wěn)定性。鑒于HIFs在腫瘤進(jìn)展中的作用，HIFs已被認(rèn)為是提高治療效果的治療靶點(diǎn)。目前已知，HIF-1和HIF-2作為缺氧轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，HIF-3α是迄今為止研究最少的一種。

通過美國(guó)癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，高突變負(fù)荷組子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-3α突變顯著，提示其可能在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，是發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率最高的婦科惡性腫瘤，但其具體發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚，在鑒別診斷過度增生和高分化子宮內(nèi)膜癌的組織學(xué)研究中仍然存在爭(zhēng)議，利用現(xiàn)有的標(biāo)記物來預(yù)測(cè)非典型子宮內(nèi)膜癌患者是否過度增生尚不可靠[1]。研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜增生主要是指子宮內(nèi)膜內(nèi)腺體的過度增生，會(huì)導(dǎo)致腺體與基質(zhì)的比例過高，這一細(xì)胞學(xué)異型性，可能進(jìn)展為與子宮內(nèi)膜癌和其他病理變化共存，在子宮內(nèi)膜過度增生或癌癥中表達(dá)改變的生物標(biāo)志物，如孕激素受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子、視黃醛去氫酶II型和分泌的卷曲相關(guān)蛋白4，似乎均有望用作早期腫瘤標(biāo)志物，然而如何通過早期腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)進(jìn)而盡早阻斷子宮內(nèi)膜疾病的發(fā)生發(fā)展仍然有待研究[2]。本研究擬通過免疫組化和Western blot檢測(cè)不同子宮內(nèi)膜病變組織中HIF-3α蛋白的表達(dá)情況，對(duì)發(fā)現(xiàn)其潛在的分子機(jī)制和新型分子靶標(biāo)應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷有重要意義。

1.1 一般資料

使用G.Power軟件估計(jì)樣本量，取α=0.05，1-β=0.8，算得免疫組化需要總標(biāo)本80例，Western blot需要總標(biāo)本42例。選取正常內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜不典型增生、子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜非腺癌標(biāo)本各16例，術(shù)中取出組織后，在無菌條件下將組織置于福爾馬林浸泡（浸泡時(shí)間>12h），組織石蠟包埋，制成蠟塊，經(jīng)病理確診后用于IHC檢測(cè)；選取女性因良性疾病切除子宮患者的正常內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織作為標(biāo)本，術(shù)中取出標(biāo)本后，在無菌條件下放入液氮盒中凍存，并保存在-80℃冰箱中，使用Western blot法檢測(cè)HIF-3α表達(dá)情況。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

鼠抗人HIF-3α單克隆抗體由美國(guó)Abcam公司提供；免疫組化S-P試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供；DAB酶底物顯色劑由碧云天生物科技公司提供；GAPDH一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；HIF-3α抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 2.實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)

造模結(jié)束后將各組織進(jìn)行固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片。采用免疫組化S-P法進(jìn)行染色，染色步驟按照試劑盒要求進(jìn)行。陽(yáng)性對(duì)照：已知鼠抗人HIF-3α單克隆抗體表達(dá)陽(yáng)性的內(nèi)膜組織；陰性對(duì)照：PBS代替一抗。

1.2.2 Western blot實(shí)驗(yàn)

每例標(biāo)本取組織約50mg，加入細(xì)胞裂解液、研磨、離心，通過試劑盒檢測(cè)各組蛋白樣品的濃度。使用SDS-PAGE 在電泳液中分離。電泳通過SDSPAGE分離各組蛋白樣品，電泳結(jié)束后在200mA恒流條件下在轉(zhuǎn)移液中將各組蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后PBS洗滌，后將膜在封閉液中室溫封閉1h左右，封閉結(jié)束后PBS洗滌，后將膜與稀釋后的Gli-1和Shh抗體在4℃冰箱中孵育過夜。孵育結(jié)束后TBST洗滌，室溫下將膜與稀釋后的山羊抗兔IgG孵育1h左右，最后通過顯影儀顯影并用ImageJ進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，進(jìn)行x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1 免疫組化（IHC）檢測(cè)HIF-3α蛋白表達(dá)情況

采用IHC法對(duì)16例人子宮內(nèi)膜癌組織及周圍組織的石蠟包埋切片進(jìn)行HIF-3α蛋白檢測(cè)。HIF-3α蛋白在子宮內(nèi)膜不典型增生狀態(tài)下表達(dá)量明顯最多，略高于子宮內(nèi)膜癌，明顯高于正常內(nèi)膜組織以及子宮內(nèi)膜增生組織。而子宮內(nèi)膜腺癌與非腺癌標(biāo)本中，并未發(fā)現(xiàn)太大差異。（圖1）

正常子宮內(nèi)膜；（b）子宮內(nèi)膜增生；（c）子宮內(nèi)膜不典型增生；（d）子宮內(nèi)膜腺癌；（e）子宮內(nèi)膜非腺癌

有研究表明，當(dāng)HIF-α異二聚體在低氧條件下處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)可以執(zhí)行轉(zhuǎn)錄活性。HIF-1α和 HIF-2α異源二聚體是產(chǎn)生基因活化的主要轉(zhuǎn)錄因子，這些基因在其啟動(dòng)子序列中含有缺氧反應(yīng)元件。癌細(xì)胞中HIF-α靶基因的活化可促使新陳代謝過程中發(fā)生氧化磷酸化、糖酵解、生存活化、血管生成、轉(zhuǎn)移和增殖路徑。雖然過去的大部分研究集中在不同類型癌癥中HIF-1α和HIF-2α活性的重要性，但很少有數(shù)據(jù)可以充分解釋不同類型癌癥中HIF-3α表達(dá)水平和分子活性的重要性。HIF-3α含有ODD結(jié)構(gòu)域，可以在低氧條件下穩(wěn)定與 HIF-β亞單位競(jìng)爭(zhēng)二聚化來限制HIF-1α和HIF-2α的活性，目前已證明HIF-3α蛋白在肝臟、胃、大腸中都有表達(dá)，此外在正常細(xì)胞和缺氧細(xì)胞中也均有表達(dá)，并且其分布并不局限于細(xì)胞核中，在細(xì)胞胞漿中也有少量的表達(dá)，若將細(xì)胞保持在缺氧狀態(tài)下，HIF-3α蛋白的表達(dá)會(huì)明顯增加。盡管HIF-3α已經(jīng)顯示出組織特異性的表達(dá)模式，但是它在許多類型的癌癥中的確切表達(dá)模式仍然是未知的[3]。

因此有研究對(duì)HIF-3α蛋白對(duì)靶細(xì)胞的侵襲和遷移能力做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，臨床研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者體內(nèi) HIF-3α蛋白表達(dá)水平越高，其生存率反而降低，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HIF-3α蛋白表達(dá)升高時(shí)，癌細(xì)胞的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力明顯增強(qiáng)。而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究人員發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，敲除HIF-3α后能夠明顯抑制小鼠體內(nèi)胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。當(dāng)HIF-3α過表達(dá)時(shí)能夠明顯促進(jìn)小鼠體內(nèi)胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。在近年的文獻(xiàn)報(bào)道中，實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)HIF-3α促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的過程可能與 RhoCROCK1信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。此外，研究已證明HIF-1α和HIF-2α可能在肺缺氧適應(yīng)過程中起作用，但HIF-3α聯(lián)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可能在心臟對(duì)缺氧的反應(yīng)中起重要作用[4]。本研究中關(guān)于HIF-3α蛋白在子宮內(nèi)膜癌病變發(fā)展中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌變時(shí)的HIF-3α蛋白表達(dá)明顯大于正常內(nèi)膜組織以及子宮內(nèi)膜增生組織，其中子宮內(nèi)膜不典型增生狀態(tài)為HIF-3α蛋白的最高峰，略高于子宮內(nèi)膜癌，明顯高于正常內(nèi)膜組織以及子宮內(nèi)膜增生組織。

綜上所述，HIF-3α蛋白與子宮內(nèi)膜病變的之間存在一定相關(guān)性，當(dāng)細(xì)胞處于不典型增生狀態(tài)時(shí)HIF-3α蛋白為高表達(dá)狀態(tài)，子宮內(nèi)膜腺癌與非腺癌標(biāo)本總體HIF-3α蛋白表達(dá)量大于正常內(nèi)膜以及子宮內(nèi)膜增生狀態(tài)。這為后續(xù)發(fā)現(xiàn)其潛在的分子機(jī)制和新型分子靶標(biāo)應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷有重要意義。

參考文獻(xiàn)

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