高效液相色譜法測定枸櫞酸芬太尼注射液有關(guān)物質(zhì)含量*

宋文濤，曾令高，高梓真，王佳瑜，馮 旭，許向陽△

（1.江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司藥物研究院·江蘇省中樞神經(jīng)藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221000；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院·國家藥品監(jiān)督管理局麻醉精神藥品質(zhì)量監(jiān)測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401121）

枸櫞酸芬太尼注射液為強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥，適用于麻醉前、中、后期的鎮(zhèn)靜與鎮(zhèn)痛，是目前復(fù)合全身麻醉中的常用藥物，臨床用法為靜脈注射、硬膜外給藥及靜脈滴注［1-8］，其風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于口服、肌肉注射等給藥方式［9-10］，故應(yīng)嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量。枸櫞酸芬太尼注射液法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有《中國藥典》（ChP）［11］、《美國藥典》（USP）［12］和《英國藥典》（BP）［13］，但USP 中未對有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制，ChP 中僅控制1 個(gè)特定雜質(zhì)（雜質(zhì)Ⅰ），BP 中控制2個(gè)特定雜質(zhì)（雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ）。為進(jìn)一步明確枸櫞酸芬太尼注射液的潛在雜質(zhì)，保證用藥安全，本研究中建立了測定枸櫞酸芬太尼注射液有關(guān)物質(zhì)含量的高效液相色譜（HPLC）法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，旨在提升現(xiàn)有枸櫞酸芬太尼注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；ME403T型電子分析天平（精度為1 mg），XSE205型電子分析天平（精度為10μg），XP6型電子分析天平（精度為1 μg），Seven Excellence 型多參數(shù)測定儀，均購自瑞士Mettler Toledo 公司；SHH-200GD-2 型藥物強(qiáng)光照射試驗(yàn)箱（重慶永生實(shí)驗(yàn)儀器廠）；DGG-9030B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試藥

枸櫞酸芬太尼對照品（批號為171204-201905，含量為99.9%），雜質(zhì)Ⅰ對照品（批號為171268-201602，含量為100.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枮閃986640，含量為99.6%），雜質(zhì)Ⅲ對照品（批號為1030988，含量為98.8%），均購自英國LGC公司；雜質(zhì)Ⅺ（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為D1912161，含量為99.107%）；枸櫞酸芬太尼注射液（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格為每支10 mL∶0.5 mg，批號分別為ZA20211201，ZA20211202，ZA20 211203；規(guī)格為每支2 mL∶0.1 mg，批號分別為ZB20211201，ZB20211202，ZB20211203）；枸櫞酸、氯化銨均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack scepter C18-120 柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A 為0.01 mol/L 氯化銨溶液-乙腈（950∶50，V/V），B 為0.01 mol/L 氯化銨溶液-乙腈（400∶600，V/V），梯度洗脫（0～7 min時(shí)30%B →40%B，7～25 min 時(shí)40%B →100%B，25～40 min 時(shí)100%B，40～45 min 時(shí)100%B →30%B，45～60 min 時(shí)30%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：100μL。

2.2 溶液制備

空白溶液：取枸櫞酸適量，加水溶解并定量稀釋成每1 mL約含枸櫞酸0.028 mg的溶液。

對照品溶液：取雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅺ對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，用水稀釋成每1 mL約含各雜質(zhì)5μg的溶液，即得對照品貯備液；取對照品貯備液適量，加水溶解，稀釋成每1 mL約含各雜質(zhì)0.25μg的溶液，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：分別取枸櫞酸芬太尼對照品和對照品貯備液各適量，加水溶解，稀釋成每1 mL約含芬太尼50μg、各雜質(zhì)0.25μg的溶液，即得。

供試品溶液：取枸櫞酸芬太尼注射液適量，直接作為供試品溶液。

加樣供試品溶液：取對照品貯備液0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加供試品溶液定容，搖勻，即得

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果芬太尼及各特定雜質(zhì)的色譜峰均能達(dá)到基線分離，分離良好。詳見圖1。

1.雜質(zhì)Ⅲ 2.雜質(zhì)Ⅺ 3.雜質(zhì)Ⅱ 4.芬太尼 5.雜質(zhì)Ⅰ圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Impurity Ⅲ 2.Impurity Ⅺ 3.Impurity Ⅱ 4.Fentanyl 5.Impurity ⅠFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

破壞性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別在酸（3 mol/L 鹽酸溶液破壞24 h）、堿（3 mol/L 氫氧化鈉溶液破壞24 h）、氧化（10%過氧化氫溶液破壞60 min）、高溫（105 ℃破壞24 h）、光照［光照強(qiáng)度（5 000±500）lx，紫外光強(qiáng)度90μW/cm2，24 h］條件下進(jìn)行破壞性試驗(yàn)，取破壞后的供試品溶液和未破壞的供試品溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，破壞后的供試品溶液延長有機(jī)相比例最大洗脫時(shí)間段，運(yùn)行時(shí)間延長至90 min，結(jié)果見圖2。可見，擬訂的有關(guān)物質(zhì)測定方法對枸櫞酸芬太尼注射液強(qiáng)制降解產(chǎn)生的雜質(zhì)均可有效分離；氧化破壞條件下，雜質(zhì)Ⅱ增加；酸破壞條件下，雜質(zhì)Ⅰ略有增加；光照破壞條件下，在22～30 min 時(shí)會產(chǎn)生系列未知雜質(zhì)，為芬太尼的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，故按非特定雜質(zhì)進(jìn)行控制。

1.未破壞 2.酸破壞 3.堿破壞 4.氧化破壞 5.高溫破壞 6.光照破壞圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.No destroying 2.Destroyed by acid 3.Destroyed by alkali 4.Destroyed by oxidation 5.Destroyed by high temperature 6.Destroyed by lightFig.2 HPLC chromatogram of the destructive test

線性關(guān)系考察：取枸櫞酸芬太尼對照品和各雜質(zhì)對照品各適量，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以各成分質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，并以主成分線性方程的斜率除以各雜質(zhì)線性方程的斜率計(jì)算校正因子。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察、校正因子、檢測限及定量限確定結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test，correction factor，LOD and LOQ

檢測限與定量限確定：精密量取2.2項(xiàng)下對照品溶液適量，用水逐級稀釋，以各雜質(zhì)信噪比（S/N）≥3 時(shí)的樣品量為檢測限，以S/N≥10 且連續(xù)6 次進(jìn)樣峰面積的RSD≤10%時(shí)的樣品量為定量限。結(jié)果見表1。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下加樣供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果各雜質(zhì)的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件，由不同試驗(yàn)人員在不同日期采用不同品牌的高效液相色譜儀進(jìn)樣檢測。結(jié)果各雜質(zhì)的RSD均小于3.0%（n=12），表明方法中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下供試品溶液與對照品溶液各適量，分別于室溫下放置0，9，18，27，36，48，60，72 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果供試品溶液與對照品溶液中各雜質(zhì)及主峰面積的RSD均小于1.0%（n=8），表明供試品溶液與對照品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取2.2 項(xiàng)下對照品貯備液0.25，0.50，0.75 mL，置20 mL容量瓶中，加供試品溶液定容，分別作為50%，100%，150%濃度水平的加樣回收試驗(yàn)溶液，平行3份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

耐用性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液、加樣供試品溶液各適量，分別在不同檢測波長（208，210，212 nm）、柱溫（38，40，42 ℃）、流速（0.9，1.0，1.1 mL/ min）、流動相鹽溶液pH（9.4，9.6，9.8）、流動相比例及不同批次色譜柱條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果不同條件下，主峰及各雜質(zhì)的分離度均大于1.5，且有關(guān)物質(zhì)含量無明顯差異，表明方法耐用性較好。

2.4 樣品有關(guān)物質(zhì)含量測定

取樣品（規(guī)格為每支10 mL∶0.5 mg，批號分別為ZA20211201，ZA20211202，ZA20 211203；規(guī)格為每支2 mL∶0.1 mg，批號分別為ZB20211201，ZB20211202，ZB20211203），按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算雜質(zhì)Ⅺ含量，按外標(biāo)法以對照品溶液中芬太尼校正后峰面積（分別乘以各雜質(zhì)的校正因子）計(jì)算雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ及雜質(zhì)Ⅲ的含量。結(jié)果6批樣品中各特定雜質(zhì)及未知雜質(zhì)含量均小于0.05%（忽略限）。

2.5 方法驗(yàn)證

取2.2 項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液，分別按2.1 項(xiàng)下色譜條件、ChP 色譜條件［11］、BP 色譜條件［13］進(jìn)樣測定。結(jié)果ChP 色譜條件下，雜質(zhì)Ⅲ在溶劑峰位置出峰，且雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ未達(dá)到基線分離，色譜圖見圖3 A；BP 色譜條件下，雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅺ未達(dá)到基線分離，色譜圖見圖3 B。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，主峰及各雜質(zhì)峰分離度均大于1.5，分離良好。

1.雜質(zhì)Ⅲ 2.雜質(zhì)Ⅺ 3.雜質(zhì)Ⅱ 4.雜質(zhì)Ⅰ 5.芬太尼 6.雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)ⅪA.ChP法 B.BP法圖3 方法驗(yàn)證試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Impurity Ⅲ 2.Impurity Ⅺ 3.Impurity Ⅱ 4.Impurity Ⅰ 5.Fentanil 6.Impurity Ⅰ and impurity ⅪA.ChP method B.BP methodFig.3 HPLC chromatogram of the method validation test

3 討論

3.1 制劑雜質(zhì)譜分析

雜質(zhì)Ⅰ［N-（1-苯乙基-4-哌啶基）苯胺］為枸櫞酸芬太尼合成的中間體Ⅱ，ChP 標(biāo)準(zhǔn)及BP 標(biāo)準(zhǔn)均將其作為已知雜質(zhì)進(jìn)行控制；雜質(zhì)Ⅱ（芬太尼氮氧化物）在氧化破壞條件下檢出，為降解雜質(zhì)；雜質(zhì)Ⅲ（N-苯基-N-4-哌啶基丙酰胺）來源于枸櫞酸芬太尼中間體Ⅱ的合成過程，中間體Ⅰ中殘留的雜質(zhì)哌啶酮和苯胺反應(yīng)生成N-苯基哌啶-4-胺，在后續(xù)反應(yīng)中和丙酸酐反應(yīng)生成雜質(zhì)Ⅲ，樣品在光照破壞條件下亦略有檢出；雜質(zhì)Ⅺ（N-苯基丙酰胺）為枸櫞酸芬太尼中間體Ⅱ中殘留的苯胺和丙酸酐反應(yīng)生成的產(chǎn)物，亦可由枸櫞酸芬太尼降解產(chǎn)生。綜合分析各雜質(zhì)的來源及枸櫞酸芬太尼注射液后續(xù)穩(wěn)定性試驗(yàn)檢出情況，最終將雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ和雜質(zhì)Ⅺ作為特定雜質(zhì)納入枸櫞酸芬太尼注射液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 雜質(zhì)限度確定

ChP 標(biāo)準(zhǔn)控制1 個(gè)特定雜質(zhì)（雜質(zhì)Ⅰ），限度為標(biāo)示量的0.5%，最大未知雜質(zhì)不得過0.25%，總未知雜質(zhì)不得過0.75%；BP標(biāo)準(zhǔn)控制2個(gè)特定雜質(zhì)（雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ），限度均為標(biāo)示量的0.5%，最大未知雜質(zhì)不得過0.25%，總未知雜質(zhì)不得過0.75%。按各國藥典標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)從嚴(yán)制訂標(biāo)準(zhǔn)限度，結(jié)合2020 年版《中國藥典（四部）》9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則［14］、人用藥品技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)理事會（ICH）Q3B R2 新藥制劑中雜質(zhì)［15］的要求，規(guī)定本品含雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ和雜質(zhì)Ⅺ不得過標(biāo)示量的0.5%，最大未知雜質(zhì)不得過0.2%，總未知雜質(zhì)不得過0.75%。

3.3 方法評價(jià)

本研究中建立的方法操作簡便，專屬性強(qiáng)，靈敏度、耐用性好，準(zhǔn)確度、精密度較高，可用于枸櫞酸芬太尼注射液中有關(guān)物質(zhì)的含量測定。