碳酸鈣D3顆粒（Ⅱ）中維生素D3含量測定的不確定度評定

朱曉月，吳兆偉，安京燁，劉 齊，鄭 潔，孫 毅，王 琳

（北京市藥品檢驗研究院<北京市疫苗檢驗中心>·國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室·中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

碳酸鈣D3顆粒（Ⅱ）主要用于補鈣和防治骨質疏松癥，較其他補鈣制劑經濟學評價好［1］，臨床應用廣泛。但前期研究發現，按現行標準《國家藥品標準》WS1-XG-033-2021中的標準方法測定樣品中維生素D3含量時，2 份樣品結果偏低且不平行。在藥品檢驗領域，通過對方法不確定度的研究，可找出影響結果偏差的主要因素［2-8］。為此，依據《測量不確定度評定與表示》JJF 1059.1-2012［9］中的相關規定，通過建立數學模型，分析不確定度來源，計算各分量合成不確定度及方法擴展不確定度，對該標準方法進行不確定度評定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），配有SPD-M20A 型二極管陣列檢測器（PDA）；XA205DU 型電子天平（梅特勒-托利多國際貿易<上海>有限公司，精度為0.01 mg）；SB25-12DT 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為500 W）；HZQ-F 160 型振蕩培養箱（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；10 mL、25 mL、50 mL 玻璃容量瓶（BRAND Germany 公司，A 類）；5 mL、15 mL 單標線玻璃吸量管（SCRC公司，A類）。

1.2 試藥

碳酸鈣D3顆粒（Ⅱ）（批號為20210403J），混合輔料，均購自A 企業；維生素D3對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100061-202110，含量為100.0%）；二甲基亞砜、正己烷、異丙醇（色譜純，德國Merck 公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

避光操作。色譜柱：SIGMAALDRICH SUPELCOSIL LC-SI 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A 為異丙醇-正己烷（0.45∶100，V/V），B 為異丙醇-正己烷（20∶80，V/V），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：265 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：40μL。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

對照品溶液：取維生素D3對照品20 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加稀釋溶劑（75%二甲基亞砜水溶液1 mL，正己烷20 mL，振搖，靜置，取正己烷層）溶解并定容，搖勻；精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加稀釋溶劑溶解并定容，搖勻；精密量取5 mL，置100 mL 容量瓶中，加稀釋溶劑溶解并定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取20粒樣品內容物，混勻，研細，精密稱取細粉（相當于維生素D36.25μg），加75%二甲基亞砜水溶液20 mL，45 ℃水浴超聲（功率為500 W）提取15 min，放冷，精密加入稀釋溶劑15 mL，密塞，置振蕩培養箱（轉速為200 r/min）中振搖萃取90 min，離心（轉速為3 000 r/min）10 min，取上清液，即得。

2.3 數學模型建立

根據公式（1）建立數學模型。式中，C為樣品中維生素D3的含量（%）；AS為供試品溶液中維生素D3的校正峰面積；MR為對照品稱樣量（mg）；PR為對照品含量（%）；VS為樣品稀釋倍數；W為樣品平均裝量（g）；AR為對照品溶液中維生素D3的校正峰面積；MS為樣品稱樣量（g）；VR為對照品稀釋倍數；Q為維生素D3標示量（mg）。

2.4 相對不確定度計算

2.4.1 對照品對不確定度的貢獻［urel（R）］

1）對照品純度的相對標準不確定度［urel（PR）］

對照品說明書無不確定度相關信息，按其置信區間α為± 0.05%、P為100%計［10］，視為矩形分布，則urel（PR）=0.05%÷÷100%=0.000 289。

2）對照品稱量引入的相對標準不確定度［urel（MR）］

分別取維生素D3對照品20.44 mg 和20.14 mg，精密稱定，平行制備2 份對照品溶液。稱量過程中引入的不確定度有3個主要來源：（1）天平校準。依據天平的校準證書，天平檢定分度（e）值為0.1 mg，在0～5 g 量程內，最大允許誤差為±0.5e，即±0.05 mg，視為矩形分布（k=），則天平校準引入的標準不確定度為0.05 ÷=0.02 89 mg。（2）天平分辨率。所用電子天平最小有效數字為0.01 mg，視為矩形分布（k=），則分辨率引入的標準不確定度為0.01÷2÷=0.002 89 mg。（3）稱量重復性。稱量時重復性最大允許誤差為1.5e，即0.15 mg，視為矩形分布（k=），則重復性引入的不確定度為0.15÷=0.086 6 mg。單次稱量的相對標準不確定度為=0.0913 mg。天平共稱量2 次（對照品和紙重各1 次），故2 次稱量的相對標準不確定度為=0.129 mg。則urel(MR)==0.008 99。

3）對照品溶液制備引入的相對標準不確定度［urel（VR）］

配制對照品溶液過程引入的不確定度主要有吸量管（A 級）校準不確定度、容量瓶（A 級）校準不確定度和溫差導致溶液膨脹的不確定度。依照JJF1059.1-2012［9］和JJF1135-2005［11］的要求，吸量管、容量瓶的不確定度的估算應按三角分布（k=）。20 ℃正己烷體積膨脹系數為1.36×10-3mL/℃［12］，設實驗室的溫度在±4 ℃范圍內變動，取波動最大值4 ℃，溫差導致溶液體積膨脹視為矩形分布（k=）。吸量管及容量瓶的容量允許誤差［13-14］見表2，各分量不確定度見表3。對照品溶液制備過程中，使用5 mL 單標線吸量管2 次，使用100 mL 容量瓶3 次，根據表3 中各分量的結果，得urel(VR)==0.007 27。

表2 容量允許誤差（mL）Tab.2 Admissible error of volume（mL）

表3 各分量不確定度Tab.3 Uncertainty of each weight

4）對照品溶液測定引入的相對標準不確定度［urel（AR）］

對照品溶液測定的峰面積受進樣量重復性、泵流速穩定性、分離度重復性、組分在色譜柱等滯留變化、檢測器穩定性、積分變動性等隨機變化的影響，可合并為進樣重復性［15］。按外標法測定，通常平行制備2份對照品溶液，分別進樣5次和2次。因此，采用極差法［10］計算每份對照品溶液測定的相對標準不確定度，則urel(AR)==0.004 67。詳見表4。

5）對照品引入的相對標準不確定度［urel（R）］

urel(R)==0.012 5。

2.4.2 樣品對不確定度的貢獻［urel（S）］

1）樣品稱量引入的相對標準不確定度urel（MS）

分別取樣品細粉4 003.57 mg 和4 013.15 mg，精密稱定，平行制備2份供試品溶液，稱量過程中引入的不確定度來源與對照品一致，即天平校準、天平分辨率和稱量重復性。樣品稱量使用的天平與對照品一致，則urel(MS)==0.000 045 5。

2）供試品溶液制備的相對標準不確定度［urel（VS）］

制備供試品溶液過程引入的不確定度來源分別為吸量管校準不確定度和溫差導致溶液膨脹的不確定度。供試品溶液制備過程中，使用15 mL 單標線吸量管1次，由表3可知，urel(VS)=0.003 21。

3）樣品平均裝量引入的相對標準不確定度［urel（W）］

取樣品20粒，精密稱定質量，傾出內容物，囊殼用棉簽拭凈，再精密稱定囊殼質量，求得平均裝量。平均裝量引入的不確定度來源為天平稱量的不確定度，稱量使用的天平與對照品一致，20粒膠囊總質量為73 074.01 mg，20 粒囊殼總質量為11 446.13 mg，則urel(W)==0.000 011 4。

4）供試品溶液測定引入的相對標準不確定度［urel（AS）］

平行制備2 份供試品溶液，各進樣1 次，維生素D3含量為70.32%和71.19%，標準偏差（S）為0.006 15，根據標準不確定度A 類評定方法［3］，則urel(AR)=0.006 15÷=0.004 35。

5）樣品引入的相對標準不確定度［urel(S)］

urel(S)==0.005 41。

2.4.3 高效液相色譜儀對不確定度的貢獻［urel（I）］

經查校準證書可知，高效液相色譜儀紫外檢測器定量測量重復性為0.1%，視為矩形分布（k=），則urel(I)=0.1%÷=0.000 577。

2.4.4 方法偏倚對不確定度的貢獻［urel（B）］

分析方法的偏倚表示為分析回收率。采用加樣回收試驗法，制備相當于供試品溶液濃度60%，100%，160%的回收樣品，各3份，回收率測定結果見表5。方法偏倚的標準不確定度為urel(B)=4.60%÷=1.53%，則urel(B)=1.53%÷83.82%=0.018 3。

表5 加樣回收試驗測定結果（%，n=9）Tab.5 Results of the recovery test（%，n=9）

2.5 不確定度評定

計算方法的合成不確定度［uC（C）］為uC(C)==0.022 8。測得樣品中維生素D3平均含量為70.76%，則uC（C）=0.022 8×70.76%=1.61%。取擴展因子k=2，此時置信概率為95%，則擴展不確定度為U95=kuC（C）=2 ×1.61%=3.22%。由表6 可知，影響該方法結果準確度的主要因素為方法偏倚。

表6 相對標準不確定度評定結果Tab.6 Evaluation results of relative standard uncertainty

3 討論

采用《國家藥品標準》WS1-XG-033-2021 中維生素D3含量測定方法測定碳酸鈣D3顆粒（Ⅱ）中維生素D3，結果表示為（70.76±3.22）%，置信概率為95%，k=2。本研究中分析了不確定度的來源，計算各分量不確定度，并對結果進行綜合評定，碳酸鈣D3顆粒（Ⅱ）中維生素D3含量測定的不確定度貢獻主要來源于方法偏倚。該方法回收率較低，三水平回收樣品的平均回收率僅為83.82%，相對標準偏差（RSD）為4.60%（n=9）。建議對該方法進行影響因素試驗考察，制訂準確、可靠的檢驗方法，提高平均回收率至98.0%～102.0%，RSD≤1.5%（n=9），以保證該方法檢測結果的準確性。