電感耦合等離子體-質(zhì)譜法測(cè)定枸櫞酸三乙酯中7 種元素雜質(zhì)

王彩媚，林嗣翔，王 淼

（廣東省藥品檢驗(yàn)所·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663）

枸櫞酸三乙酯又稱檸檬酸三乙酯，化學(xué)名為2，2'-羥基-1，2，3-丙烷三羧酸三乙酯［1］，常用于膠囊劑、片劑、微丸、顆粒劑、膜劑、涂膜劑、透皮治療系統(tǒng)等的制備。枸櫞酸三乙酯由枸櫞酸和乙醇在催化劑條件下高溫反應(yīng)制得［2-4］，反應(yīng)物和反應(yīng)系統(tǒng)均可能帶來(lái)潛在的重金屬元素雜質(zhì)。重金屬元素對(duì)人體的心、腦、肺、腎、肝、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖器官等均可能造成損傷［5］，各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)越來(lái)越重視元素雜質(zhì)的控制。2017 年2 月，人用藥品技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)理事會(huì)（ICH）頒布了原料藥、制劑元素雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則（ICH Q3D）［6］，列出了各元素雜質(zhì)在不同給藥途徑下的允許濃度值。2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》［1］在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中利用重金屬比色法控制重金屬元素雜質(zhì)，但目前已無(wú)法滿足元素雜質(zhì)的精準(zhǔn)控制需要。《美國(guó)藥典》于2018 年更新了通則方法<232 >和<233 >［7］，以替換通則方法<231 >（比色法）［8］。我國(guó)于2017 年加入ICH，國(guó)家藥典委員會(huì)已在積極推進(jìn)ICH 各個(gè)雜質(zhì)指導(dǎo)原則在我國(guó)的實(shí)施，其中包括ICH Q3D［9］。電感耦合等離子體-質(zhì)譜（ICP-MS）法測(cè)定痕量元素雜質(zhì)的專屬性和靈敏度高，且可同時(shí)快速測(cè)定多種元素雜質(zhì)［10-14］。本研究中建立了測(cè)定枸櫞酸三乙酯中鎘（Cd）、鉛（Pb）、砷（As）、汞（Hg）、鈷（Co）、釩（V）、鎳（Ni）7種元素雜質(zhì)殘留量的ICP-MS 法，初步考察和評(píng)估我國(guó)枸櫞酸三乙酯中各元素雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，為ICH Q3D 在我國(guó)的逐步實(shí)施提供參考數(shù)據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；ETHOS One型微波消解儀（美國(guó)Melestone公司）；ED16型電熱趕酸器（北京萊伯泰科儀器公司）；CP225D型電子天平（德國(guó)Satorius公司，精度為十萬(wàn)分之一）。

1.2 試藥

枸櫞酸三乙酯（編號(hào)為1-23；涉及10家生產(chǎn)企業(yè)，編號(hào)為A-J）；V，Co，Ni，As，Cd，Pb 元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為51-042CRY2，質(zhì)量濃度均為10 μg/mL），Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為12-20HGY2，質(zhì)量濃度為10 μg/ mL），鈧（Sc）、銦（In）、鍺（Ge）、鉍（Bi）元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為5190-9770，質(zhì)量濃度分別為10，5，5，5μg/mL），均購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies 公司；金（Au）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院，批號(hào)為170523631，質(zhì)量濃度為1 000μg/mL）；65%硝酸（德國(guó)Merck 公司）；30%過(guò)氧化氫溶液（廣東光華科技股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件

載氣：氦氣；等離子體模式：HMI-8；采樣深度：10.0 mm；射頻功率：1 600 W；載氣流量：0.8 L/min；霧化氣流量：0.8 L/min；輔助氣流量：0.8 L/min；等離子氣流量：15.0 L/min；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：0.10 r/min；霧化室溫度：2 ℃。

2.2 溶液制備

Au 保護(hù)溶液：精密量取Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為1 000 μg/ mL）100 μL，置100 mL 容量瓶中，加2%硝酸溶液稀釋并定容，制成質(zhì)量濃度為1.0μg/mL的Au保護(hù)溶液。

供試品溶液：取樣品0.5 g，精密稱定，置消解罐中，精密加入Au保護(hù)溶液0.2 mL，加入硝酸5 mL及30%過(guò)氧化氫溶液2 mL，蓋上內(nèi)蓋，旋緊外蓋，按儀器操作說(shuō)明書緩慢升至180 ℃消解1 h，放冷，旋開外蓋，取下內(nèi)蓋，將消解罐置趕酸器上于100 ℃加熱趕酸，至溶液剩余約3 mL，用2%硝酸溶液定量轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加2%硝酸溶液稀釋并定容，搖勻，作為供試品溶液。

空白溶液：按供試品溶液制備方法制備不含樣品的空白溶液。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密量取V，Co，Ni，As，Cd，Pb 元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋為每1 mL含各元素500 ng的混合溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅰ；精密量取Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)液適量，用2%硝酸溶液稀釋為每1 mL 含Hg元素100 ng的溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅱ。

標(biāo)準(zhǔn)曲線混合線性溶液：精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅰ和Ⅱ各適量，用3%硝酸溶液分別稀釋為每1 mL 含Cd，Pb，As，Co，V，Ni元素0，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng及含Hg元素0，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 ng的系列溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密量取Sc，Ge，In，Bi元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，置50 mL 容量瓶中，用2%硝酸溶液定容，制成含Sc，Ge，In，Bi 質(zhì)量濃度分別為1.0，0.5，0.5，0.5μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液都通過(guò)儀器在線加入內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2.2項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)曲線混合線性溶液適量，按2.1 項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各元素質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、儀器響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1，表明Cd，Pb，As，Co，V，Ni元素的質(zhì)量濃度在0～20 ng/mL 范圍內(nèi)，Hg 元素的質(zhì)量濃度在0～5.0 ng/mL范圍內(nèi)，與儀器響應(yīng)值線性關(guān)系良好（r≥0.999 5，n=7）。

表1 線性關(guān)系考察、檢測(cè)限和定量限確定、精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test，LOD，LOQ，and the precision test

檢測(cè)限和定量限確定：取2.2 項(xiàng)下空白溶液適量，按2.1 項(xiàng)下質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定15 次，以響應(yīng)值的3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（3SD）所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限，以響應(yīng)值的10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（10SD）所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線混合線性溶液的中間質(zhì)量濃度（Cd，Pb，As，Co，V，Ni 元素的質(zhì)量濃度為2.0 ng/mL，Hg 元素的質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL），按2.1項(xiàng)下質(zhì)譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果見表1，表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為1）0.5 g，精密稱定，共9 份，分別加入標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅰ0.8，1.0，1.2 mL 及標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅱ0.4，0.5，0.6 mL，各3 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表2。

表2 7種元素雜質(zhì)加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（%，n=9）Tab.2 Results of the recovery test of seven elemental impurities（%，n=9）

2.4 樣品中元素雜質(zhì)殘留量測(cè)定

取23 批（編號(hào)為1-23）樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。參考ICH Q3D（R2）［6］，As，Cd，Hg，Pb，V，Co，Ni 的允許濃度分別為1.5，0.5，3，0.5，10，5，20 μg/g，以允許濃度的30%設(shè)定控制閾值，分別為0.45，0.15，0.9，0.5，10，5，20μg/g。結(jié)果樣品中元素雜質(zhì)As，Cd，Hg，Pb，V，Co，Ni的檢測(cè)限分別為0.000 7，0.000 8，0.001 5，0.001 7，0.000 002，0.01，0.005μg/g，含量遠(yuǎn)低于控制閾值，表明枸櫞酸乙酯中元素雜質(zhì)殘留量均處于較低水平。詳見表3。

表3 樣品中7種元素雜質(zhì)殘留量測(cè)定結(jié)果（μg/g）Tab.3 Determination results of residual quantity of seven elemental impurities in samples（μg/ g）

3 討論

3.1 樣品前處理

枸櫞酸三乙酯屬小分子有機(jī)化合物，濕法消解時(shí)無(wú)須浸泡過(guò)夜即可消解完全；測(cè)定Hg元素時(shí)，消解后的趕酸溫度不宜過(guò)高，應(yīng)不超過(guò)100 ℃。

3.2 元素雜質(zhì)選擇

ICH Q3D 將元素雜質(zhì)分為3 類。第一類元素為As，Hg，Pb，Cd，該類元素為人體毒素，在藥品生產(chǎn)中應(yīng)限制使用或禁用，在所有給藥途徑的藥物中均需考察。第二類元素雜質(zhì)的毒性與給藥途徑有關(guān)，分為2 個(gè)亞類。其中，2A 類V，Co，Ni，由于這些元素具有較高的自然豐度，所有給藥途徑的藥物均需對(duì)其潛在來(lái)源進(jìn)行評(píng)估；2B 類Ag，Au，Pb 及銥（Ir）、鋨（Os）、鉑（Pt）、銠（Rh）、釕（Ru）、硒（Se）、鉈（Tl），這些元素的豐度較低，出現(xiàn)在藥品中的概率較低，除非有意添加，否則無(wú)需進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［2］。因此，本研究中選擇第一類、第2A 類元素作為考察和評(píng)估對(duì)象。

3.3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

目前，藥品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重點(diǎn)是結(jié)合ICH Q3D 中的每日允許暴露量（PDE）評(píng)估藥品中元素雜質(zhì)的水平。PDE 值代表每日最大給藥劑量的藥品中每個(gè)元素的最大日允許攝入量（μg/d）。不同給藥途徑的元素雜質(zhì)的PDE 值不同，枸櫞酸三乙酯屬口服制劑用藥用輔料，其元素雜質(zhì)PDE 值按口服給藥途徑進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。但PDE 值僅反映來(lái)自藥品的總暴露量，需將PDE 值轉(zhuǎn)換為濃度，作為一種評(píng)估藥品或其組分中元素雜質(zhì)含量的工具。按公式計(jì)算允許濃度，允許濃度（μg/g）=PDE/藥品日劑量。

ICH Q3D 將藥品既定PDE 值的30%定義為控制閾值，作為實(shí)測(cè)元素雜質(zhì)水平顯著性的衡量指標(biāo)，控制閾值可用于判斷是否需要額外控制。若藥品中所有來(lái)源的總元素雜質(zhì)水平始終低于PDE 的30%，則不再需要額外控制；若風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估無(wú)法證明某個(gè)元素雜質(zhì)水平始終低于控制閾值，則需建立控制方法以保證藥品中元素雜質(zhì)水平不超過(guò)PDE。由表3 可知，本研究中的23 批樣品中Cd，As，Hg，Co，V，Ni，Pb 7 種元素雜質(zhì)的含量均低于控制閾值，表明安全風(fēng)險(xiǎn)較低。