中草藥漱口顆粒質(zhì)量標準研究*

林 娟，許 文，李玲慧，李 丹，潘鴻貞△

（1.福建省福州市中醫(yī)院，福建 福州 350001；2.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

中草藥漱口顆粒為福建省福州市中醫(yī)院擬開發(fā)的中藥復方制劑，由石膏、地骨皮、骨碎補、紫花地丁、蒲公英、蟛蜞菊、白茅根、白術(shù)、蒼術(shù)、黃芪、甘草11味中藥材組方，具有清熱瀉火、涼血解毒、消腫止痛、健脾益腎功效，適用于治療口腔疾病，尤其是口腔潰瘍、牙周炎、牙齦炎，能顯著降低口腔潰瘍的復發(fā)率［1］。顆粒劑型可解決傳統(tǒng)湯劑存在的煎煮麻煩、攜帶不便、藥效物質(zhì)不穩(wěn)定、不宜久儲等缺點。前期研究中，確定了中草藥漱口顆粒的制備工藝［2］。為進一步開展質(zhì)量標準研究，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對中草藥漱口顆粒中的骨碎補、蒲公英、紫花地丁、甘草進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定紫花地丁主要成分秦皮乙素的含量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AR224CN 型電子天平（美國Ohaus 公司，精度為萬分之一）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配有二極管陣列檢測器（DAD）；PALL Casada 型一體化超純水機（美國Pall公司）。

1.2 試藥

中草藥漱口顆粒（福建中醫(yī)藥大學制劑實驗室生產(chǎn)，批號分別為20220401，20220402，20220403）；骨碎補對照藥材（批號為121169-202105），柚皮苷對照品（批號為110722-202116），菊苣酸對照品（批號為111752-202105），秦皮乙素對照品（批號為110741-202109，含量為96.0%），甘草對照藥材（批號為120904-202021），甘草苷對照品（批號為111610-201908），蒲公英對照藥材（批號為202004），紫花地丁對照藥材（批號為202106），均購于中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板，甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純，均購于Merck 化工技術(shù)有限公司；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別［3］367，［4-5］

骨碎補：取樣品5 g，加甲醇30 mL，加熱回流提取1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，即得供試品溶液。取骨碎補對照藥材1 g，同供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取骨碎補以外的其他藥材，按處方工藝制備陰性樣品5 g，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取柚皮苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.54 mg/mL 的對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（一部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液及陰性對照品溶液各4μL，點于同一硅膠G薄層板上，置展開劑甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（1∶12∶2.5∶3，V/V/V/V）中展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 A。

1-3.供試品溶液 4.對照藥材溶液 5.對照品溶液 6.陰性對照品溶液A.骨碎補（365 nm） B.蒲公英（365 nm） C.紫花地丁（365 nm） D.甘草（日光）圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Reference medicinal solution 5.Reference solution 6.Negative reference solutionA.Drynariae Rhizoma（365 nm） B.Taraxaci Herba（365 nm） C.Viole Herba（365 nm） D.Glycyrrhizae Radix et Rhizoma（sunlight）Fig.1 TLC chromatograms

蒲公英：取樣品5 g，加甲醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，即得供試品溶液。取蒲公英對照藥材1 g，同供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取蒲公英以外的其他藥材，按處方工藝制備陰性樣品5 g，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取菊苣酸對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.44 mg/mL 的對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（一部）》通則0502 TLC法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液及陰性對照品溶液各5μL，點于同一硅膠G薄層板上，置展開劑三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-水（8∶10∶3∶1，V/V/V/V）中展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 B。

紫花地?。喝悠? g，加甲醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，即得供試品溶液。取紫花地丁對照藥材1 g，同供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取紫花地丁以外的其他藥材，按處方工藝制備陰性樣品5 g，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取秦皮乙素對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.15 mg/ mL 的對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（一部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液及陰性對照品溶液各4μL，點于同一硅膠G 薄層板上，置展開劑甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶3∶1，V/V/V）的上層溶液展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 C。

甘草：取樣品5 g，加水20 mL使溶解，用10 mL正丁醇提取3次，合并3次正丁醇液，水洗3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，即得供試品溶液。取甘草對照藥材1 g，同供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取甘草以外的其他藥材，按處方工藝制備陰性樣品5 g，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取甘草苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的甘草對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（一部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液及陰性對照品溶液各5μL，點于同一硅膠G 薄層板上，置展開劑乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶1，V/V/V/V）中展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的橙黃色斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 D。

2.2 秦皮乙素含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：344 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取樣品0.8 g，精密稱定，置50 mL 錐形瓶中，用移液管精密加入25 mL 甲醇，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）處理20 min，0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，即得供試品溶液。取缺紫花地丁陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取秦皮乙素對照品4.6 mg，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為920μg/mL 的對照品貯備液；取對照品貯備液適量，加甲醇稀釋成質(zhì) 量濃度分別為9.2，18.4，27.6，36.8，46.0，52.2，64.4μg/mL的系列對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗［6］：精密吸取對照品溶液（質(zhì)量濃度為64.4 μg/ mL）、供試品溶液、陰性對照品溶液各10μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。秦皮乙素與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5，拖尾因子為0.94，理論板數(shù)按秦皮乙素峰計超過5 000。

1.秦皮乙素A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖2 高效液相色譜圖1.QuercetinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取2.2.2 項下系列對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件依次進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標、對照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=40.612X-11.413（R2=0.999 7，n=7）。結(jié)果表明，秦皮乙素質(zhì)量濃度在9.2～64.4μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.2.2 項下對照品溶液（質(zhì)量濃度為64.4 μg/mL）適量，按2.2.1 項下色譜條件于1 d 內(nèi)連續(xù)進樣6 次，或連續(xù)3 d 重復進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果秦皮乙素峰面積的日內(nèi)精密度試驗的RSD為0.11%（n=6），日間精密度試驗的RSD為0.02%（n=3），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20220403）6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件分別進樣測定，計算秦皮乙素含量。結(jié)果秦皮乙素平均含量為0.814 mg/g，RSD為1.69%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取重復性試驗項下供試品溶液，于室溫放置0，2，4，6，8，12，24 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為3.52%（n=7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為20220403）0.40 g，精密稱定，共6份，分別精密加入秦皮乙素對照品（相當于樣品濃度的100.00%），依法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取樣品（批號分別為20220401，20220402，20220403）各3 份，依法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，按外標法以峰面積計算樣品含量。結(jié)果見表2。

表2 3批樣品中秦皮乙素含量測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of content determination of quercetin in three batches of samples（n=3）

3 討論

3.1 HPLC 定量指標選擇

參考2020 年版《中國藥典（一部）》，根據(jù)方中各成分的指標性含量測定成分進行預試驗，測定全方多成分的含量。經(jīng)過篩選，君藥石膏在2020 年版《中國藥典（一部）》中無指標性成分；臣藥白茅根、蟛蜞菊也無含量測定指標；臣藥蒲公英指標性成分菊苣酸，骨碎補指標性成分柚皮苷的檢測含量均低于萬分之一。紫花地丁指標性成分秦皮乙素的檢測含量為千分之一，適合作為含量測定指標［7］。秦皮乙素是2020年版《中國藥典（一部）》紫花地丁中的含量測定指標性成分，具有良好的抗腫瘤、抗炎及抗菌活性［7-9］。秦皮乙素是中草藥漱口顆粒中的重要活性成分，也是所有藥味中含量最高的成分。故選擇紫花地丁指標性成分秦皮乙素作為中草藥漱口顆粒的含量測定指標，并進行方法學考察。

3.2 TLC 定性指標選擇

TLC 鑒別中，多以化學物質(zhì)作對照。中藥制劑藥味多，成分較復雜，對照品藥材為非專屬性成分時，特征斑點判斷有一定難度［10-13］。故選擇對照品、對照藥材及缺藥材的陰性對照品作參照。前期試驗中，開展了骨碎補、地骨皮、蒲公英、紫花地丁和甘草5 味藥材的定性鑒別，發(fā)現(xiàn)骨碎補、蒲公英、紫花地丁和甘草4味藥材的鑒別方法可行，且陰性對照無干擾；但臣藥地骨皮以地骨皮對照藥材［3］128，以及缺地骨皮的陰性對照樣品作對照，存在陰性干擾，故不作為TLC測定指標。

3.3 檢測波長選擇

采用紫外-可見分光光度計測定200～400 nm 波長范圍內(nèi)秦皮乙素的吸收光譜，發(fā)現(xiàn)于205，230，255，300，345 nm 波長處均有吸收峰，以345 nm 波長處吸收值最大。采用HPLC 法驗證對照品溶液和供試品溶液的色譜，發(fā)現(xiàn)于344 nm 波長處均有最大吸收，且色譜圖較一致。故選擇344 nm 波長作為秦皮乙素含量測定的檢測波長［14-15］。

3.4 方法評價

本研究中建立的定性定量方法操作簡便，穩(wěn)定性、重復性、準確度均符合要求，可用于中藥漱口顆粒的質(zhì)量控制。