大黃靈仙方調控膽管細胞炎癥的作用及機制研究

陳偉棠 俞淵 龐澆安 李敏鵬 潘孟 陸世鋒 楊文 滕金豪 葉桂源

原發性肝內膽管結石是指發生于左右肝管匯合部位以上的肝膽管結石,是我國常見的良性膽道疾病,具有發病隱匿、病變復雜、術后殘石復發高等特點[1]。該病早期易繼發膽管炎癥、膽道出血、化膿性膽道炎、梗阻性黃疸等,病程晚期可并發膽汁性肝硬化、肝實質損壞甚至膽管癌等危重并發癥,嚴重影響患者的生命安全[2]。流行病學顯示:該病的好發年齡群體主要為35歲至75歲[3],男女之間發病率無明顯差異,而在國家和種族人群之間存在差異,東亞地區發病率約占25%,歐美發病率約為1%[4]。中國是膽結石發病的重災區國家之一,膽結石的發病率可占所有疾病的10%,而肝膽管結石的發病率約占膽石病的30%[2]。

相關研究證實:肝膽管結石的發病機制涉及多種因素和多個環節,常見的病因主要有膽道感染、膽管炎、膽汁淤積以及膽管解剖變異等因素[5],其中以感染致結石最為顯著。本課題組前期已證實:大黃靈仙方可有效預防肝內膽管結石的形成及術后復發,改善膽管微環境,降低膽道感染發生幾率,使膽管恢復到非炎性狀態,其機制可能與調控Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)信號通路和激活核轉錄因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路相關炎癥因子的表達水平有關[6-7]。而白細胞介素-1受體相關激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK)-1、IRAK-4以及成纖維生長因子激活酶1MAP3KT結合蛋白2(TGF-3 activator 1 map3KT-binding protein 2,TAB2)作為上述信號軸的下游信號分子,在該通路中具有正向傳導信號的作用,與骨關節炎、胃腸道炎癥、癌癥等疾病密切相關。但在膽管炎癥中,通過調控IRAK-1、IRAK-4以及TAB2的異常表達,緩解和抑制膽管細胞炎癥反應,預防肝膽管結石的形成及術后復發,尚無相關文獻研究。為進一步完善大黃靈仙方修復膽管細胞炎癥損傷的作用靶點,本課題通過內毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)構建膽管炎癥大鼠模型,推測大黃靈仙方可能通過調控IRAK-1、IRAK-4和TAB2的異常表達,抑制膽管系統炎癥損傷,進而防治肝膽管結石。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠45只,平均鼠齡6周,體質量:160～200 g。購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號SCXK(湘)2019-0004],飼養于廣西中醫藥大學仙葫校區動物房,室溫20～24℃,濕度45%～55%。實驗方案經廣西中醫藥大學實驗動物倫理委員會同意通過,相關實驗操作均按照動物倫理審查標準嚴格進行,批準號DW20191017-023。

1.2 動物分組

45只大鼠隨機分為9組:空白組、模型組、大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑組、p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑+ p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組,每組大鼠5只。本課題均在廣西中醫藥大學第一臨床醫學院7樓實驗操作室進行操作。

1.3 主要藥物與器材

大黃靈仙方:生大黃15 g、威靈仙30 g、金錢草30 g、黃芪30 g、芒硝10 g、澤蘭15 g、柴胡12 g、郁金12 g、雞內金12 g、枳殼12 g、磁石10 g、炙甘草5 g,經廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科按相當量換算配為顆粒劑,所有中藥顆粒劑均由江陰天江藥業有限公司提供,LPS、p38絲裂活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號通路阻斷劑、p38MAPK信號通路阻斷劑、NF-κB信號通路阻斷劑(均購于美國Sigma公司,批號分別為L4391-1MG、IC50-17、5108-96-3),IRAK4 Antibody、TAB2(C88H10)Rabbit mAb(均購于美國CST公司,批號分別為:4363、3745)、Mouse Anti-βactin mAb(購于北京中杉金橋生物技術有限公司,批號:TA-09)、IRAK-1 Antibody(購于Santa Cruz公司,批號sc-5288),羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(均購于Proteintech公司,批號分別為SA00001-2、SA00001-1),PVDF膜浸潤活化液、特超敏ECL化學發光試劑盒(均購于上海碧云天,批號分別為P0021S、P0018AS)。

1.4 造模與給藥

大鼠膽管炎癥模型參考文獻進行,在膽總管一次注射5 mg/kg LPS以構建肝內膽管感染動物模型[8]。根據等效劑量系數折算法及前期研究基礎,大鼠劑量=6.3×成人的臨床劑量,最終確定大黃靈仙顆粒給藥劑量320 mg/kg。具體造模如下:(1)空白組:第1～7天予蒸餾水灌胃(2次/天,灌胃量為2 mL/100 g)(2)模型組:第1～3天予蒸餾水灌胃(2次/天,灌胃量為2 mL/100 g),第4天在膽總管注射LPS以構建肝內膽管炎癥大鼠模型,第5～7天繼續予蒸餾水。(3)大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑組、p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組:第1～3天予分別行320 mg/kg大黃靈仙顆粒、120 mg/kg NF-κB信號阻斷劑、10 mg/kg p38MAPK信號阻斷劑、120 mg/kg NF-κB信號阻斷劑聯合10 mg/kg p38MAPK信號阻斷劑進行腹腔注射(1次/天,連續干預3天),第4天在膽總管注射LPS 以構建肝內膽管炎癥大鼠模型,第5～7天繼續予大黃靈仙方灌胃;(4)NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑+ p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組:第1～3天予大黃靈仙方灌胃(2次/天,灌胃量為2 mL/100 g)并分別予120 mg/kg NF-κB信號阻斷劑、10 mg/kg p38MAPK、120 mg/kg NF-κB信號阻斷劑聯合10 mg/kg p38MAPK信號阻斷劑進行腹腔注射(1次/天,連續干預3天),第4天在膽總管注射LPS以構建肝內膽管炎癥大鼠模型,第5～7天繼續予大黃靈仙方灌胃;(5)第7天灌胃結束后禁食禁水12小時,隨后無菌操作下取材,各組大鼠在造模和干預期間無死亡。

1.5 標本采集及方法

大鼠術前12小時禁食禁水,使用3%戊巴比妥鈉4 mg/100 g腹腔注射麻醉大鼠,隨后腹部去毛,置于無菌手術臺上在劍突下作橫行切口,經全身肝素化、灌注預熱后,大鼠肝臟由紅褐色變成土黃色,在顯微鏡下剔除多余的肝臟組織,保留完整的膽管樹,進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)等相關指標檢測。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 RT-qPCR技術檢測 IRAK-4、IRAK-1、TAB2 mRNA表達情況 (1)引物合成。各基因及內參基因β-actin引物采用Primer 5.0軟件設計,見表1。(2)檢測方法。采用Trizol法從膽管樹中提取總RNA,于超微量紫外線光度儀分析RNA濃度、純度及完整性,提取質量:OD260/OD280應在1.8～2.0之間;按照逆轉錄試劑盒將RNA進行逆轉錄從而獲得 cDNA;依據熒光定量PCR反應條件進行擴增反應,檢測 IRAK-4、IRAK-1、TAB2 mRNA表達量,最終采用2-△△ct計算。

表1 目的基因熒光定量PCR引物序列

1.6.2 WB技術檢測IRAK-1、IRAK-4、TAB2蛋白表達水平 剪取等體積膽管樹研磨,用移液槍吸取1 mL細胞裂解液加入研磨管后置于冰上充分研磨,待組織完全裂解后轉移至EP管中4℃離心取上清液,采用BCA法測定蛋白含量。制備SDS-PAGE凝膠,電泳分離蛋白濕轉模式下將蛋白轉印至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封PVDF膜然后加入相應一抗:β-actin(1∶2 000)、IRAK-4(1∶1 500)、IRAK-1(1∶1 500)、TAB2(1∶1 500),4℃冰箱中孵育過夜。回收一抗,TBST洗PVDF膜,加入二抗(1∶10 000),室溫孵育1小時后用TBST 洗滌3次。超敏ECL化學發光底物在凝膠成像系統中進行檢測,Image J軟件計算各組蛋白條帶與β-actin的灰度值比值。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 大黃靈仙方對IRAK-4、IRAK-1、TAB2蛋白表達的影響

與空白組比較,模型組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2的蛋白表達量升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,大黃靈仙顆粒組、p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑+ p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2的蛋白表達量降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。與大黃靈仙顆粒組比較,NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑+ p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2的蛋白表達量下降,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1,表2。

注:A為空白組;B為模型組;C為大黃靈仙顆粒組;D為p38MAPK阻斷劑組;E為NF-κB阻斷劑組;F為NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組;G為p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組;H為NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組;I為NF-κB阻斷劑+ p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組。

表2 IRAK4、IRAK1、TAB2蛋白表達情況鼠只=5)

2.2 大黃靈仙方對IRAK-4、IRAK-1、TAB2 mRNA表達的影響

與空白組比較,模型組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2 mRNA表達量升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,大黃靈仙顆粒組、p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2 mRNA表達量下降(P<0.05),NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組的TAB2 mRNA表達量下降(P<0.05);與大黃靈仙顆粒組比較,NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2 mRNA表達量下降,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3,圖2、3、4。

圖2 IRAK-1的擴增曲線與溶解曲線

圖4 TAB2的擴增曲線與溶解曲線

表3 IRAK4、IRAK1、TAB2 mRNA表達情況鼠只=5)

3 討論

肝臟是人體最大的實質器官,具有分解代謝、清除毒素、抗氧化等功能,然而肝臟容易受到體內外各種致病因素的侵擾而損傷,原發性肝內膽管結石作為常見的難治性良性膽道疾病,一直是肝臟疾病中的研究熱點。因此,探索針對其機制的有效防治措施是現今亟需解決的難題。而中醫藥對膽石癥的治療由來已久,許多臨床實踐及實驗也證實了其在緩解患者臨床癥狀、溶石排石及改善血清學指標等方面具有確切的療效。大黃靈仙方是唐乾利根據十多年臨床經驗創制的中藥復方,該方以疏肝利膽、攻下排石為立方原則,全方由生大黃、威靈仙、芒硝、金錢草、枳殼、雞內金、澤蘭、柴胡、郁金、磁石、黃芪、炙甘草組成,臨床上常用于肝內膽管結石的治療。現代藥理學證明:大黃、威靈仙可作用于肝臟的酶和蛋白,調節膽汁酸與肝臟脂質的平衡,增強膽囊收縮,減少膽汁淤積,從而降低結石的形成幾率[9]。而柴胡中蘊含的皂苷、有機酸、揮發油等化學成分,可促進膽汁、膽固醇的分泌與排泄,枳實中的黃酮類,甘草中的甘草酸、甘草苷,金錢草中的酚性成分、黃酮類等均有疏肝、利膽、排石等功效[10-11]。由此可見,大黃靈仙方中的組方藥物具有緩解膽道炎癥、增強膽道收縮功能、抑制結石形成等功效。

目前已經證實,肝膽管結石的形成與感染互為因果[12]。2015年,Peers C等[13]發現,膽管感染以革蘭氏陰性菌感染為主,LPS是革蘭陰性菌細胞壁的重要組成部分,經肝臟排入膽汁中的內毒素大部分仍保留LPS完整的分子結構,具有內毒素的生物特性,當LPS作用于細胞膜受體,通過細胞內信號傳遞級聯使基因表達發生變化,介導內皮細胞、平滑肌細胞以及單核巨噬細胞的激活,誘導炎癥細胞因子合成和釋放,從而引發膽道內慢性炎癥。

炎癥的發生與信號通路的調控失常及關鍵基因的異常表達存在關聯,而藥物治療膽石癥常從削弱炎癥信號通路出發,通過減輕炎癥反應減少結石形成。2015年,Skevaki等[14]研究發現,IRAK1和IRAK-4是IRAK激酶家族成員,在免疫系統中發揮重要作用,參與調控Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達。當IRAK-1發生磷酸化反應時,亦會活化TRAF6并與由TABs(TAB2)組成的蛋白激酶復合物結合,引起NF-κB信號通路產生促炎細胞因子[15]。2019年,Yin D等[16]也證實了,IRAK-1能通過驅動單核細胞/巨噬細胞浸潤,促進炎性細胞的分泌,通過對慢性壓迫性損傷大鼠模型注射IRAK1的siRNA可降低IRAK-1的表達,逆轉脊髓中該信號通路下游分子p-NF-κB表達的上調,抑制神經炎癥的進展。IRAK-4過度表達可增強LPS誘導的NADPH氧化酶活性,激活MAPK信號通路并啟動炎癥應答[17]。相關研究也證實了:在潰瘍性腸炎的炎癥產生機制中,TLR/MyD88炎癥信號通路的異常表達起著關鍵作用,TLRs能夠通過與病原識別模式分子結合的方式,介導其下游的信號傳遞分子MyD88進行胞內信號轉導,而大量募集的MyD88可誘導IRAK4發揮激酶活性,產生磷酸化反應,最終釋放TNF-α、IL-1β等細胞炎癥因子,引發炎癥級聯反應[18]。動物實驗證實了:當LPS與TLR4結合后通過MyD88招募并活化信號蛋白IRAK(特別是IRAK-1和IRAK-4),可激活下游NF-κB和MAPK信號通路并交互放大炎性反應[19],通過抑制IRAK-1、IRAK-4以及TAB2的異常表達可下調TLR4/NF-κB/MAPK信號通路的炎癥應激反應。可見,IRAK-1、IRAK-4和TAB2作為TLR4/NF-κB/MAPK信號通路的下游因子,在炎癥反應過程中扮演著重要角色。但通過調控IRAK-1、IRAK-4和TAB2的異常表達,緩解和抑制膽管細胞炎癥反應,進而預防肝膽管結石的形成及術后復發,尚無相關報道。故本課題采取大黃靈仙方干預膽管炎癥大鼠模型,探究其抑制膽管細胞炎癥反應的作用機制。

結合膽管炎性反應是導致肝內膽管結石形成的關鍵因素的論點,IRAK-1、IRAK-4、TAB2作為TLR4/NF-κB/MAPK信號通路的下游信號分子,在該通路中具有正向傳導信號的作用。為進一步驗證IRAK-1、IRAK-4和TAB2與膽管炎癥之間的關系,筆者運用WB和RT-qPCR對其進行檢測。研究結果顯示:與空白組對比,模型組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2蛋白及mRNA表達顯著增加,提示經LPS誘導后模型組大鼠的信號通路被激活并呈現出高表達狀態,大鼠膽管細胞炎癥反應增強,分別給予大黃靈仙方、p38MAPK信號通路阻斷劑以及NF-κB信號通路阻斷劑干預后,IRAK-1、IRAK-4、TAB2的蛋白及mRNA表達量均有不同程度下調,表明大黃靈仙方可阻礙其所介導的TLR4/NF-κB/MAPK信號通路進行信號傳導,降低大鼠膽管組織炎癥反應。當p38MAPK信號通路阻斷劑與NF-κB信號通路阻斷聯合使用后,其抑制膽管炎癥反應的效果明顯優于單一使用信號通路阻斷的大鼠,說明同時下調IRAK-1、IRAK-4和TAB2三者的炎癥表達水平,能進一步抑制TLR4/NF-κB/MAPK信號通路介導的炎癥瀑布反應,使得大鼠膽管炎癥損傷進一步緩解。而大黃靈仙顆粒和P38MAPK信號通路阻斷劑、NF-κB信號通路阻斷劑三者聯合使用后,上述通路指標的表達量進一步降低的同時,膽管組織炎癥損傷也進一步緩解,表明大黃靈仙顆粒聯合信號阻斷劑可進一步促進大黃靈仙方抑制炎癥信號通路的活化作用,可能是防治肝膽管結石的機制之一。但在與模型組對比中,p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組中的IRAK-4的蛋白及mRNA表達量和p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組中的IRAK-1的蛋白表達量異常增加,引起的炎癥反應的結果與其它研究不一致[20],推測其原因可能是存在其它炎癥因子與IRAK-1或IRAK-4發生競爭性結合,使TLR4/NF-κB/MAPK信號通路表達異常上升,具體作用機制仍需進行下一步驗證。

綜上所述,初步推測大黃靈仙方可緩解LPS誘導的大鼠膽管炎癥反應,促進膽管細胞的修復,從而達到減少肝膽管結石發生及術后復發的目的,其作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB/MAPK信號通路下游IRAK-1、IRAK-4、TAB2炎癥因子的活化有關。但該方是復方中藥,具有多靶點、多途徑的特征,其確切的抗膽管炎癥的作用機制尚未完全闡明,后續對于具體分子機制以及相關信號通路之間的聯系仍需進行基因靶點敲除或網絡藥理學等研究。