基于16S核糖體DNA基因測序技術探討分消走泄法對支氣管哮喘大鼠腸道菌群的影響

劉璐佳 楊陽 景偉超 王有鵬

全球哮喘倡議報告將支氣管哮喘(簡稱“哮喘”)描述為一種通常以慢性氣道炎癥為特征的異質性疾病[1]。本病臨床以反復發作的呼吸困難、喘息、胸悶和咳嗽等呼吸道癥狀為主癥[2]。據估計,全世界高達14%的兒童和8.6%的成年人患病[3]。目前,哮喘管理的長期目標是實現癥狀控制、保護肺功能、降低惡化和死亡的風險,以及盡量減少與藥物相關的副作用[4],尤其在新型冠狀病毒大流行的背景下,哮喘患者必須在良好控制臨床癥狀的情況下繼續進行適當的治療[5]。因此,對于闡明哮喘發病機制,探尋有效防治藥物是當前研究的重點。

人體腸道菌群是一個復雜的生態系統,涉及宿主的新陳代謝、免疫和健康。值得注意的是,新的證據支持肺部疾病通常伴有腸道菌群失調和免疫炎癥反應,腸道菌群及其代謝產物直接或間接參與肺病宿主的免疫調節,形成“肺—腸”軸[6]。已有研究表明,腸道菌群失調是導致哮喘和其他呼吸系統疾病的重要因素之一[7-8]。這和中醫學上的“肺與大腸相表里”“肺腸相關”理論不謀而合?；诖?筆者所在研究團隊首次將分消走泄法引入哮喘的治療當中,創立了臨床有效方劑白果溫膽湯治療哮喘,并于2022年被授予國家發明專利(專利號:ZL202111491708.8)。白果溫膽湯以調和為主,分消上下之勢,達通利三焦、理氣化痰、止咳平喘之效。然目前尚缺乏白果溫膽湯干預哮喘作用機制的文獻報道,為此本文通過對哮喘模型大鼠肺組織病理形態、糞便腸道菌群進行檢測,探討白果溫膽湯的作用機制,為后續進一步研究白果溫膽湯提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

72只SPF級雄性SD大鼠體質量(180±20)g,由遼寧長生生物技術有限公司提供,動物許可證號:SCXK(遼)2020-0001。飼養環境安靜,光/暗循環12小時,室內溫度(25±1)℃,室內濕度45%～55%,自由獲取食物和水。

1.2 實驗藥物

白果溫膽湯:陳皮18 g、清半夏12 g、茯苓18 g、炒枳實12 g、竹茹12 g、白果12 g、炒葶藶子12 g、射干18 g、浙貝母18 g、炒紫蘇子18 g、蜜枇杷葉18 g、浮萍24 g、生甘草12 g,煎煮過濾后,用旋轉蒸發儀濃縮成藥物濃度5 g/mL,置4℃冰箱中保存備用。

地塞米松片:天津天藥藥業股份有限公司,國藥準字:H12020686。

1.3 實驗主要試劑和儀器

OVA(貨號:#A8040,北京索萊寶科技有限公司)、氫氧化鋁凝膠(貨號:S30353,上海源葉生物科技有限公司)、蘇木精染料(貨號:#G3720,北京索萊寶科技有限公司)、伊紅(貨號:15086-94-9,山東西亞化工科技有限公司)、4%多聚甲醛(貨號:BL539A,廣州碩譜生物科技有限公司)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(貨號:BL302A,廣州碩譜生物科技有限公司)、RNA 6000 Nano kit(貨號:5067-1511,Agilent)、Agilent High Sensitivity DNA Kit(貨號:5067-4626,Agilent)、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(貨號:P7589,Invitrogen)、Q5?High-Fidelity DNA Polymerase(貨號:M0491L,NEB)、AxyPrep DNAGel Extraction Kit(貨號:AP-GX-250,Axygen)。

超聲霧化器(型號:402AI,上海魚躍醫療設備有限公司)、紫外分光光度計(型號:NANO 2000,Thermo)、TBS380 熒光計(型號:E6090,Promega)、電泳儀(型號:DYY-7C,北京六一生物科技有限公司)、PCR擴增儀(型號:2720,ABI)、2100生物分析儀(型號:2100Bioanalyzer,Agilent)、自制霧化箱。

1.4 分組與造模

將72只雄性SD大鼠隨機分為六組:空白組、模型組、地塞米松組及白果溫膽湯高、中、低劑量組,每組12只,適應性飼養7天后開始實驗。根據參考文獻制備動物模型,包括致敏和激發兩個階段[9-10]。致敏階段:模型組和各給藥組大鼠第1天和第8天分別腹腔內注射1 mL抗原混懸液(10%卵清蛋白和10%氫氧化鋁混合液),空白組給予等量生理鹽水替代。激發階段:第15天起,將模型組和各給藥組大鼠逐一置于自制霧化箱內,給予2%卵清蛋白霧化進行激發,空白組給予生理鹽水霧化吸入,每天一次,共14天。

1.5 藥物干預

從實驗的第15天起,各組于霧化前半小時進行藥物灌胃?？瞻捉M與模型組分別給予生理鹽水代替藥物灌胃,日1次,持續14天。地塞米松組給予0.5 mg/kg地塞米松灌胃,日1次,持續14天。白果溫膽湯高、中、低劑量組(臨床用量按動物體表面積比值換算成等效劑量為18 g/kg,高劑量按人體等效劑量2倍,組間劑量比為2∶1),每次分別按36 g/kg、18 g/kg、9 g/kg的劑量給予灌胃給藥,給藥體積設為1 mL/100 g,日1次,持續14天。各組在灌胃半小時后開始并完成激發階段(具體方法參照制備動物模型處)。

1.6 取材方法

取材前禁食12小時,末次霧化結束24小時后,用10%水合氯醛3 mL/kg對大鼠進行麻醉,將麻醉成功的大鼠仰臥位固定于操作臺,剪毛,用手術剪沿腹中線向上逐層剪開腹腔、胸腔,取右肺中葉將其放入4%多聚甲醛固定液中,于室溫固定,備做蘇木精—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE);在盲腸末端剪一個小口,把盲腸內容物擠入滅菌的EP管中,立即用液氮速凍。

1.7 指標檢測

1.7.1 行為學觀察 實驗過程中觀察記錄各組大鼠的精神狀態、食量、飲水量、呼吸及毛發光澤等情況的變化。

1.7.2 肺組織病理學檢測 HE染色檢測各組大鼠肺組織病理改變:將多聚甲醛固定好的右肺中葉組織,依次完成包埋切片—切片脫蠟至水—蘇木精染色—鹽酸酒精分化—自來水返藍—伊紅染色—脫水、透明、封片后,利用光學顯微鏡鏡檢,采集并分析所得圖像。觀察各組大鼠肺組織HE染色病理改變結果。

1.7.3 16S核糖體DNA(16S ribo-somal DNA,16S rDNA) Miseq高通量測序觀察腸道菌群情況,觀察治療后各組大鼠腸道菌群的多樣性和各菌群的豐度。即從每組隨機選出5個樣本進行糞便DNA的抽取,使用Agilent High Sensitivity DNA Kit遵循制造商的說明。使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳分別測量提取DNA的數量和質量。使用正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rRNA基因V3～V4區域進行PCR擴增。PCR擴增子使用Vazyme V AHTSTM DNA Clean Beads進行純化,并使用Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測試劑盒進行定量。將擴增子等量合并,使用Illlumina MiSeq平臺和MiSeq Reagent Kit v3進行雙端測序。

微生物組生物信息學使用QIIME2進行,使用demux插件對原始序列數據進行多路分解,使用cutadapt插件進行引物切割。再使用DADA2插件對序列進行質量過濾、降噪、合并和去除嵌合體,獲得非單子擴增子序列變體(amplicon sequence variant,ASV)。Classify-skleaen算法對ASV進行物種注釋,再進行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。Alpha多樣性分析包括觀察各組大鼠腸道菌群豐度Chao1指數、Observed_species指數、基于進化的多樣性Faith’s PD指數、均勻度Pielou_e指數、菌群多樣性Shannon指數等。Beta多樣性分析包括對各組大鼠腸道菌群進行Anosim分析等。最后,利用平臺得到各組大鼠在科水平上的腸道菌群豐度,比較各組差異。

1.8 數據處理

2 結果

2.1 行為學觀察結果

空白組:實驗過程中大鼠均精神狀態良好,活動自如,毛發光亮順滑,可正常進食及飲水,呼吸如常。生理鹽水霧化吸入時,觀察到有個別大鼠出現一過性呼吸急促,但很快緩解,后無其它異常反應。

模型組:致敏后大鼠出現煩躁多動,呼吸加深加快,四肢及腹部偶見抽搐動作。進入激發階段,霧化時大鼠出現明顯的嗆咳、呼吸頻率加快、搔鼻抓臉、煩躁等表現,隨著時間的延長,大鼠精神萎靡、反應遲鈍、咳嗽、搔鼻等表現漸重。

地塞米松組:致敏后及激發階段初期與模型組大鼠表現相似,但伴隨地塞米松發揮干預作用,大鼠咳嗽、搔鼻抓臉、煩躁等癥狀均有不同程度的改善,明顯輕于模型組。

白果溫膽湯高、中、低劑量組:致敏后及激發階段初期白果溫膽湯各組與模型組大鼠表現相似,但伴隨白果溫膽湯的干預作用,各組大鼠咳嗽、搔鼻抓臉、煩躁等癥狀均有不同程度的改善。低劑量組大鼠一般狀況優于模型組;中劑量組大鼠一般狀況優于白果溫膽湯低劑量組,與地塞米松組相似;高劑量組大鼠癥狀改善情況與中劑量組相似,且與地塞米松組相比,大鼠神態安靜,毛發更加滑順光亮。

2.2 肺組織HE染色結果

空白組:肺組織形態結構較正常,肺間隔輕度增厚,可見少量炎性細胞。模型組:肺氣管上皮破損,肺間隔增厚,炎性細胞增多。各治療組與模型組比較,均有一定改善,表現為肺組織結構清晰,肺間隔厚度降低,炎性細胞減少。結果見圖1。

圖1 肺組織HE染色鏡下觀察結果(×200)

2.3 菌群豐度情況

本實驗共30個樣本,得到1990364條序列,各樣本平均讀長數目66345個,序列長度分布范圍為50～433 bp。結果見圖2。獲得六組大鼠糞便樣本在不同分類水平的ASVs的數目,樣本中測得所有ASVs均可被識別,并在各分類等級均有體現,分布也較為廣泛,采用韋恩圖分析各組間菌群運算的分類單元數量及其種類交叉情況。結果見圖3。

圖2 序列長度分布

圖3 各組大鼠腸道菌群ASVs分布韋恩圖

2.4 Alpha多樣性分析

2.4.1 物種累計曲線 隨著樣本量的增加,曲線逐漸趨于平緩,表明測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種,測序數據量合理,測序深度足夠大。結果見圖4。

圖4 物種累積曲線

2.4.2 菌群Alpha多樣性分析 各組大鼠腸道菌群的稀釋曲線均急劇上升后呈平緩趨勢,結果見圖5,表明測序深度可以覆蓋本樣本中的物種組成情況。

圖5 物種的稀疏曲線

與空白組比較,模型組大鼠腸道菌群豐度Chao1指數及Observed_species指數、基于進化的多樣性Faith’s PD指數、均勻度Pielou_e指數、菌群多樣性Shannon指數均有下降趨勢,但差異均無統計學意義(P>0.05);地塞米松組大鼠腸道菌群Chao1指數、Observed_species指數、Faith’s PD指數、Pielou_e指數、Shannon指數均有明顯下降,差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腸道微生物菌群豐富度和多樣性比較鼠只=5)

與模型組比較,地塞米松組大鼠腸道菌群Chao1指數、Pielou_e指數、Shannon指數均有明顯下降,差異均具有統計學意義(P<0.05);白果溫膽湯低劑量組Faith’s PD指數有明顯下降,差異具有統計學意義(P<0.05),白果溫膽湯各劑量組其余指數隨濃度升高逐漸增高,但差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

與地塞米松組比較,白果溫膽湯低、中劑量組Pielou_e指數、Shannon指數均有明顯上升,差異均具有統計學意義(P<0.05),白果溫膽湯高劑量組Chao1指數、Observed_species指數、Faith’s PD指數、Shannon指數均有明顯上升,差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

與白果溫膽湯低劑量比較,白果溫膽湯高劑量組Faith’s PD指數有明顯上升,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.5 菌群Beta多樣性分析

對六組大鼠腸道菌群進行Anosim分析,獲得圖6和表2,其中統計量R大于0時表示組間差異大于組內差異?？梢钥闯龀坠麥啬憸袆┝拷M與白果溫膽湯高劑量組兩組組間差異小于組內差異,其余各組兩兩比較均組間差異大于組內差異;其中空白組與模型組、空白組與地塞米松組、模型組與各治療組、地塞米松組與白果溫膽湯各劑量組、白果溫膽湯低劑量組與白果溫膽湯中、高劑量組之間均具有差異性(P<0.05)。

表2 大鼠糞便樣本的組間差異中的R值(Anosim分析)

注:A空白組;B模型組;C地塞米松組;D白果溫膽湯低劑量組;E白果溫膽湯中劑量組;F白果溫膽湯高劑量組。

2.6 物種組成分析結果

在科水平如圖7所示:與空白組比較,模型組乳桿菌科(Lactobacillaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、副萼苔科(Paraprevotellaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)比例升高,瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、擬桿菌門S24-7菌科(S24-7)、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)比例降低。與模型組比較,各治療組中乳桿菌科(Lactobacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)比例均降低,脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)比例均升高;地塞米松組、白果溫膽湯低劑量組及白果溫膽湯中劑量組中瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)比例降低,白果溫膽湯高劑量組比例升高;地塞米松組Peptostreptococcaceae比例降低,白果溫膽湯各治療組比例升高;地塞米松組和白果溫膽湯中劑量組中Lachnospiraceae比例降低,在白果溫膽湯低劑量和高劑量組比例升高;在地塞米松組和白果溫膽湯低劑量組中S24-7比例降低,在白果溫膽湯中劑量組和高劑量組比例升高;在地塞米松組和白果溫膽湯低劑量組中Paraprevotellaceae比例降低,在白果溫膽湯中劑量組和高劑量組中比例升高。并使用Krona軟件進行科水平群落分類學組成的交互展示,以模型組科水平為例,獲得圖8,可以更清晰看出在科水平,各菌群所占有的比例。

圖7 各組大鼠腸道菌群科水平分類學組成分析

圖8 模型組科水平Krona物種組成圖

3 討論

哮喘是一種影響各年齡段的復雜性疾病,是由易感個體對常見“非傳染性”環境抗原(過敏原)的異常免疫反應引起,其病因、臨床表現和嚴重程度在個體之間可能存在很大差異[11-12]。在動物實驗中,某些腸道微生物菌株已被證明能抑制或減弱與慢性炎癥相關的免疫反應,從人類受試者身上研究者發現,改變或不太多樣化的腸道微生物群組成與哮喘等疾病相關[13],如急性發作支氣管哮喘患兒腸道優勢菌數量減少,腸道機會致病菌數量增加[14]。而益生菌可以對未得到最佳控制的哮喘患者產生影響,減少局部和全身炎癥狀態,控制哮喘,改善患者生活質量[4]。使用雙歧桿菌輔助治療哮喘,能夠改善腸道微生態和肺功能,調節免疫功能,減少炎癥反應,提高療效[15]。由此可見,在早期維持正常的腸道微生物群或糾正其紊亂可能是預防和治療哮喘的一種有效方法[16]。

本實驗觀察白果溫膽湯高、中、低劑量組大鼠致敏后及激發階段初期,大鼠行為學等一般狀況表現與模型組相似,但伴隨白果溫膽湯高、中、低不同劑量的干預逐漸延長,各劑量組大鼠咳嗽、搔鼻抓臉、煩躁等癥狀均較模型組有不同程度的改善。這說明白果溫膽湯在改善哮喘大鼠行為學等一般狀況表現方面具有一定作用。此外,本實驗大鼠肺組織HE染色結果顯示,與空白組比較,模型組出現一系列病理改變,復制哮喘模型成功,與模型組比較,地塞米松組與白果溫膽湯高、中、低劑量組均可改善哮喘大鼠的肺組織結構,降低肺部炎癥反應,且隨白果溫膽湯劑量升高藥效越佳。

正常腸道微生物群的失調是考慮哮喘發生發展的重要因素之一[17]。針對腸道菌群多樣性進行分析,包括組內菌群的菌群豐度、多樣性、均勻度和組間菌群的差異性。Alpha多樣性分析顯示,與空白組比較,模型組大鼠腸道菌群多樣性有下降趨勢,可見哮喘會導致大鼠的腸道菌群多樣性等發生變化,一定程度破壞大鼠腸道微生態穩態,這與Liu C等[18]研究結果具有一致性,其發現哮喘會破壞腸道菌群的穩定性,降低腸道菌群多樣性及豐富度。與模型組比較,地塞米松組大鼠腸道菌群豐度、均勻度、菌群多樣性等均有明顯下降趨勢,白果溫膽湯各劑量組隨藥物濃度增加,腸道菌群的多樣性及豐富度等均明顯上升,逐漸趨近空白組大鼠的多樣性及豐度;可見白果溫膽湯在改善哮喘大鼠腸道菌群方面遠優于地塞米松,并且隨藥物濃度升高效果增加,地塞米松會降低腸道菌群多樣性與其在機體內一定程度延遲腸道菌群恢復有關[19]。Beta多樣性分析結果提示空白組與模型組組間差異較大,說明哮喘大鼠腸道菌群改變較大,分別經過地塞米松和不同劑量的白果溫膽湯治療后,地塞米松組的差異更大,白果溫膽湯各劑量組具有不同程度的改善,通過與空白組比較,可見經過白果溫膽湯干預后,會使哮喘大鼠腸道菌群改善趨向健康大鼠。有研究表明嬰兒早期腸道微生物群的減少和代謝活動的改變與哮喘的發生發展有關[20],且Jia W Q等[21]已證明哮喘患者腸道菌群多樣性的變化與哮喘的發病率有關,可見更好的維持腸道菌群多樣性對疾病的治療有較好的效果。

針對科水平,哮喘大鼠乳桿菌科(Lactobacillaceae)比例升高,各治療組降低,可能其比例改變與哮喘的發生發展有關,Zawistowska-Rojek等[22]研究發現乳酸桿菌科菌株的粘附能力、競爭性粘附、自聚集和共聚集等特性可能會影響胃腸道病原菌的定植和清除,在疾病的發生發展中起到一定的作用。哮喘模型組大鼠梭菌科(Clostridiaceae)比例較空白組升高,各治療組與模型組比較明顯降低,哮喘可能會導致Clostridiaceae比例的升高,從而改變腸道菌群的穩定性,但Huang F等[23]研究認為低水平的梭菌科是哮喘發病的危險因素,這與菌群具有雙向調節也可能有關。哮喘大鼠腸道菌群脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)比例降低,各治療組比例升高,脫硫弧菌科細菌與腸道炎性疾病和慢性疾病有關[24]。

實驗中發現消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)模型組比例降低,白果溫膽湯干預后比例升高,瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)模型組比例降低,白果溫膽湯高劑量干預后比例升高,S24-7(擬桿菌門S24-7菌科)模型組比例降低,白果溫膽湯中高劑量組治療后比例升高?？梢姲坠麥啬憸梢愿玫木S持腸道菌群穩定性,尤其是在改善Peptostreptococcaceae、Ruminococcaceae、S24-7比例方面。

綜上所述,本研究針對目前哮喘高發的現狀,創新性地將中醫肺腸相關理論和現代醫學的腸道微生態相結合,甄選臨床應用多年的基于分消走泄法首創的白果溫膽湯為研究藥物開展實驗研究,藥物市場靶向明確。實驗結果證實了“肺—腸軸”理論在哮喘中起著重要作用,在一定程度上揭示了哮喘肺腸同病的現代醫學內涵,并闡明了白果溫膽湯可能通過調節腸道菌群的多樣性、豐富度及調節菌群結構改善哮喘。在今后的研究中,筆者將以此為基礎,望進一步為中醫藥調控哮喘提供實驗依據和理論基礎,探索藥物調控機制的新方向,為哮喘的臨床治療和預防提供參考。