白菜型油菜BrBBX家族的鑒定與BrBBX46和BrBBX53基因的脅迫響應分析

皮博藝 聶治 杜文平 余桂容 甘雨 宋軍

摘要：BBX是一類重要的鋅指蛋白轉錄因子家族，包含1～2個高度保守位于蛋白質序列N端的BBX結構域，在調控植物的生長發育和響應環境脅迫中發揮著重要作用。利用生物信息學分析手段，在白菜型油菜中鑒定出59個BrBBX家族成員，對它們的染色體定位、基因結構、蛋白保守結構域，以及BrBBX46和BrBBX53基因的啟動子進行了分析，并用qRT-PCR技術鑒定了BrBBX46和BrBBX53基因在模擬干旱和鹽脅迫下的表達水平。結果顯示，59個BrBBXs不均勻地分布于白菜型油菜基因組的10條染色體。通過對系統進化、基因結構、蛋白保守 結構域的分析，59個BrBBXs被分為5個亞族，每個亞族的基因結構、蛋白結構域和保守基序均相對保守，同一亞族的成員具有相似的基因結構和保守結構域。對啟動子的分析結果顯示，BrBBX46和BrBBX53基因的啟動子中均含有大量的脅迫相關響應元件，尤其是干旱脅迫響應元件，二者均有14個；在40% PEG和120 mmol/L NaCl處理下，二者的表達水平均顯著上升，說明BrBBX46和BrBBX53基因能夠響應干旱和鹽脅迫的誘導，可能在干旱和鹽脅迫下發揮著重要功能。以上結果為進一步了解和利用BrBBX家族成員改良白菜型油菜耐旱耐鹽新品種提供了良好的基因資源。

關鍵詞：白菜型油菜；BBX家族；BrBBX46；BrBBX53；生物信息學；脅迫響應

中圖分類號：S565.4? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ?文章編號：2097-2172（2024）01-0026-011

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.01.005

Identification of the BBX family in B. rapa and Stress Response

Analysis of BrBBX46 and BrBBX53 Genes

PI Boyi， NIE Zhi， DU Wenping， YU Guirong， GAN Yu， SONG Jun

（Institute of Biotechnology & Nuclear Techniques， Sichuan Academy Agricultural Sciences， Chengdu Sichuan 610066， China）

Abstract： BBX is an important family of zinc finger protein transcription factors， containing one to two highly conserved BBX domains located at the N terminus of the protein sequence. It plays an important role in regulating plant growth and development and responding to environmental stress. In this study， 59 BrBBX family members were identified in B. rapa by bioinformatics analysis，and their chromosome location， gene structure， protein conserved domain， and promoters of BrBBX46 and BrBBX53 genes were analyzed. The expression levels of BrBBX46 and BrBBX53 were determined by qRT-PCR under simulated drought and salt stress. The result showed that 59 BrBBXs were unevenly distributed on 10 chromosomes of the B. rapa genome. Based on the analysis of phylogenetic evolution， gene structure and protein conserved domains， 59 BrBBXs were divided into five subfamilies. The gene structure， protein domain and conserved motifs of each subfamily were relatively conserved， and members of the same subfamily had similar gene structure and conserved domains. The results of promoter analysis showed that the promoters of BrBBX46 and BrBBX53 contained a large number of stress-related response elements， especially drought stress response elements， and there were 14 drought stress response elements in BrBBX46 and BrBBX53， respectively. The expression levels of BrBBX46 and BrBBX53 were significantly increased under the treatment of 40% PEG and 120 mM NaCl， indicating that BrBBX46 and BrBBX53 can respond to the induction of drought and salt stress and may play important functions under drought and salt stress. These results provide good gene resources for further understanding of BrBBX family and using BrBBX family members to improve the drought and salt tolerant new varieties of B. rapa.

Key words： B. rapa; BBX family; Identification; BrBBX46; BrBBX53; Bioinformation; Stress response

轉錄因子（Transcription factor， TF）又稱反式作用因子，是一種DNA結合蛋白，通過與靶基因的特定順式元件相互作用，激活或抑制下游基因的表達［1 ］。轉錄因子在植物生長發育、光周期調控、響應生物脅迫（如細菌、真菌和病毒攻擊）以及非生物脅迫（干旱、鹽、高滲透壓、熱或寒冷）中發揮重要作用［2 - 4 ］。

鋅指蛋白（Zinc Finger Protein， ZFP）是植物應對逆境的重要轉錄因子，B-Box（BBX）型鋅指蛋白包含1～2個位于N端的BBX結構域（C-X2-C-X8- C-X7-C-X2-C-X4-H-X8-H），也有一些BBX家族成員在C端包含一個CCT結構域［5 ］。BBX結構域可分為2種類型：BBX1和BBX2；CCT結構域由42～43個氨基酸組成，對轉錄和核蛋白轉運具有重要作用［6 - 7 ］。Khanna等［5 ］在擬南芥中鑒定出32個BBX蛋白，并根據AtBBX蛋白成員的BBX結構域和CCT結構域是否存在，將它們分為5個亞族，分別為第Ⅰ亞族、第Ⅱ亞族、第Ⅱ亞族、第Ⅳ亞族和第Ⅴ亞族，其中第Ⅰ亞族和第Ⅱ亞族均包含2個BBX結構域和1個CCT結構域，第Ⅲ亞族包含1個BBX結構域和1個CCT結構域，第Ⅳ亞族包含2個BBX結構域，而第Ⅴ亞族僅包含1個BBX結構域。隨著對BBX基因家族功能的研究，BBX型鋅指蛋白家族在其他植物中也被鑒定，如水稻、玉米、大豆、茶樹、巨桉、馬鈴薯等植物中分別有30、36、42、31、21、30個BBX成員［8 - 13 ］。近年來，BBX家族成員在植物光形態形成、開花調控、激素信號轉導和非生物脅迫中均有報道［2， 14 - 17 ］。

在擬南芥中，多數BBX家族基因的功能已被報道，第1個被發現的擬南芥BBX成員CO （CONSTANS）在開花過程中發揮作用［18 ］。AtBBX4（COL1）和AtBBX20-22能夠促進根的伸長，在光響應途徑中起著調控因子的作用，促進擬南芥幼苗的光形態建成。也有一些BBX成員在擬南芥幼苗光形態建成過程中發揮相反的功能，如AtBBX18、AtBBX19、AtBBX25和AtBBX32在擬南芥光形態建成過程中作為負調控因子，抑制幼苗的光形態建成［19 ］。水稻中擬南芥CO的同源蛋白Hd1（OsBBX家族蛋白）在光響應途徑中調控水稻的花期，在短日照條件下能夠促進水稻開花［20 ］。擬南芥CO蛋白在水稻中的同源蛋白OsCOL9能正向調控抗原細胞抗性，敲除水稻OsCOL9基因可增加水稻的產量，提高轉基因水稻植株對稻瘟病菌的敏感性，使稻瘟病菌感染的可能性增大［21 ］。AtBBX20、AtBBX18和AtBBX16分別參與了油菜素內酯（BR）、赤霉酸（GA）和生長素信號的轉導［22 - 24 ］。

BBX成員除了參與植物的生長發育，還參與了非生物脅迫響應，AtBBX24在擬南芥耐鹽性調控中起著調控因子的作用，過表達AtBBX24基因能夠增強擬南芥植株的耐鹽性［16 ］；AtBBX5能夠響應干旱和鹽的誘導，通過增強ABA的生物合成以及脅迫響應基因的表達增強擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受能力［25 ］；AtBBX18通過調控熱休克應答基因（HSP）參與了擬南芥植株對熱脅迫的耐受性的調控［17 ］。Yang等［26 ］在菊花（Chrysanthemum morifolium）中證明了CmBBX24可以提高植物對低溫和干旱的耐受性水平，Liu等［27 ］進一步在擬南芥中異源表達菊花CmBBX22基因，發現其能顯著延緩擬南芥葉片衰老、增強植株耐旱性。蘋果MdBBX10在擬南芥中異位表達增強了轉基因擬南芥植株的耐鹽性和耐旱性［28 ］。

白菜型油菜（Brassica rapa， 2n=20， AA）是研究多倍體進化的模式生物，是甘藍型油菜（B. napus，2n=38， AACC）A基因組的提供者，也是重要的經濟作物。目前在水稻、玉米、大豆、馬鈴薯等作物中已鑒定出BBX家族成員［8 - 10， 13 ］，而白菜型油菜的BBX家族的鑒定還未見報道。為此，本研究通過生物信息學分析方法和手段，在全基因組范圍內鑒定了白菜型油菜的BBX家族成員，分析了BrBBX家族的染色體分布、系統進化關系、基因結構、蛋白結構與保守基序以及BrBBX46和BrBBX53基因對干旱脅迫和鹽脅迫的響應，以期為深入研究BrBBX基因家族的功能和耐鹽耐旱新品種的改良提供理論參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試植物材料及培養條件

白菜型油菜在溫度24±1℃、光照強度100 μmol /（m2·s）、空氣濕度60%～70%、光周期為16 h光照/8 h黑暗的植物生長室中進行培養。

1.2? ?白菜型油菜BrBBX蛋白家族的鑒定

根據擬南芥AtBBX家族蛋白序列［5 ］，在白菜型油菜數據庫（http：//brassicadb.cn/#/）中，利用BLASTp工具查找白菜型油菜BBX蛋白序列，隨后在http：//smart. embl-heidelberg.de/和https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi上進行鑒定，含有1個或2個BBX結構域的蛋白為白菜型油菜BBX家族成員。

1.3? ?BrBBX基因在染色體上的分布

從白菜型油菜數據庫中獲取BrBBX成員的基因號及其在染色體上的位置信息，利用Mapchart 2.2軟件繪制BrBBX成員在染色體上的分布圖。

1.4? ?BrBBX基因家族系統發育進化樹的構建

根據已報道的擬南芥和水稻BBX蛋白序列，結合在數據庫下載的白菜型油菜BBX家族成員蛋白序列，在MEGA7軟件中采用鄰近法（Neighbor-Joining， NJ）繪制BrBBX基因家族系統發育進化樹，校驗參數Bootstrap Replications設置為1000。

1.5? ?BrBBX家族的基因結構、蛋白保守結構域和保守基序分析

從數據庫下載白菜型油菜BBX家族成員DNA序列和CDS序列，利用在線軟件GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）分析外顯子、內含子的數目及位置。利用從數據庫獲取的白菜型油菜BBX家族成員的蛋白序列，通過在線軟件Multiple Em for Motif Elicitation（MEME， https：//meme-suite.org/meme/ tools/meme）繪制BrBBX成員保守結構域圖，分析BrBBX家族成員保守序列。

1.6? ?擬南芥BBX24同源基因BrBBX46和BrBBX53的脅迫響應分析

在數據庫下載AtBBX24在白菜型油菜中同源基因BrBBX46和BrBBX53起始密碼子上游2 000 bp序列，作為BrBBX46和BrBBX53基因的啟動子進行分析。利用PlantCARE在線工具對BrBBX46和BrBBX53基因啟動子中的響應元件進行分析［29 ］。

為了研究AtBBX24在白菜型油菜中的同源基因BrBBX46和BrBBX53對干旱脅迫和鹽脅迫的響應，首先用75%乙醇清洗白菜型油菜種子3～5 min，再用去離子水漂洗3遍后浸種3～4 h，隨后播種于裝有濕潤的營養土、蛭石（體積比為1∶1）的小花缽中，在4 ℃條件下低溫處理48 h后置于生長室培養。待白菜型油菜植株生長至2片真葉完全展開時，用120 mmol/L NaCl和40% PEG處理12 h，之后分別取對照條件（未脅迫）、120 mmol/L NaCl 和40% PEG處理下的樣品各3份，液氮速凍，-80 ℃條件下保存。

根據Huang等［30 ］的方法，用Trizol試劑［Sangon Biotech （Shanghai） Co.， Ltd.］抽提白菜型油菜總RNA，然后利用超微量分光光度計（NanoDrop 2000， Thermo Fisher Scientific， USA）測量RNA質量和濃度，使用反轉錄試劑盒［Hifair■ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（gDNA digester plus），Yeasen Biotech（Shanghai） Co.， Ltd.］將1 ug RNA反轉為cDNA，以BraA02g003190（BrACTIN）為內參基? ?因［31 ］，利用qRT-PCR技術對BrBBX46和BrBBX53的表達量進行鑒定，引物序列見表1。最后采用2-ΔΔCT法計算BrBBX46和BrBBX53基因在干旱和鹽脅迫處理下的表達水平［32 ］。

2? ?結果與分析

2.1? ?BrBBX基因家族的染色體定位分析

利用擬南芥AtBBX家族蛋白序列，在白菜型油菜數據庫共篩選鑒定到59個BrBBX基因家族成員。根據白菜型油菜數據庫公布的染色體位置信息，利用MapChart 2.2 軟件繪制BrBBX家族基因的染色體定位圖譜（圖1）。

從圖1可知，白菜型油菜的基因組共10條染色體：Chr01～Chr10。其中Chr09染色體最長（45.2 M），Chr03染色體次之（38.1 M）；長度最短的是Chr10染色體，只有20.7 M，有5個BrBBX基因位于該染色體；BrBBX基因在Chr01和Chr07染色體上最多，均有8個，但Chr07染色體更短，因此，Chr07染色體上BrBBX的基因密度大于Chr01染色體。

2.2? ?BrBBX蛋白的系統發育進化分析

利用已報道的32個AtBBX蛋白、30個OsBBX蛋白序列和已鑒定的59個BrBBX蛋白進行系統發育分析。結果顯示，與擬南芥的聚類結果相似［5 ］，59個BrBBX蛋白被分為第Ⅰ亞族、第Ⅱ亞族、第Ⅲ亞族、第Ⅳ亞族、第Ⅴ亞族（圖2）。其中，第Ⅳ亞族有17個BrBBX蛋白，是擁有BrBBX成員最多的亞族；12個BrBBX蛋白被聚類在第Ⅱ亞族；第Ⅲ亞族是最小的一個亞家族，僅包含6個BrBBX蛋白，位于該亞族的還有4個AtBBX和3個OsBBX；第Ⅰ亞族包含9個BrBBX，第Ⅴ亞族包含15個BrBBX。與擬南芥和水稻不同的是，在第Ⅴ亞族中，擬南芥7個BBX成員和水稻中3個BBX成員均聚類在同一個小亞族，而在白菜型油菜中BrBBX被分為了2個小亞族：Ⅴ-1和Ⅴ-2，其中Ⅴ-1包括9個BrBBX家族成員，Ⅴ-2包括6個BrBBX家族成員。

2.3? ?BrBBX家族成員的結構和保守基序分析

白菜型油菜BrBBX家族的基因結構和蛋白保守結構域（圖3）顯示，聚類于同一亞族的BrBBX成員具有相似的基因結構。除了8個BrBBX成員以外，大多數BrBBX成員的基因組序列在2 kb以下。在第Ⅰ亞族中，BrBBX基因僅有1個或2個外顯子；第Ⅱ亞族中，除了BrBBX55有5個外顯子以外，其他BrBBX基因的外顯子個數均為3～4個；基因組序列最長的基因BrBBX4和序列最短的基因BrBBX3均聚類在第Ⅴ亞族。

為了研究BrBBX蛋白的保守結構域，通過MEME在線工具對59個BrBBX的蛋白保守結構域進行了分析（圖3）。發現位于同一亞族的BrBBX成員具有相似的結構域和保守基序：第Ⅰ亞族和第Ⅱ亞族中的BrBBX成員均包含2個BBX結構域（BBX1和BBX2）和1個CCT結構域；第Ⅲ亞族中的BrBBX成員包含1個BBX1結構域和1個CCT結構域；第Ⅳ亞族中的BrBBX成員包含2個BBX結構域（BBX1、BBX2）；第Ⅴ亞族的BrBBX成員僅有1個BBX結構域，不同的是，在擬南芥和水稻中，該亞族中的BBX成員的BBX結構域類型均為BBX1，而在白菜型油菜中，有的BrBBX成員含有BBX1結構域，有的則具有BBX2結構域。對BrBBX家族蛋白的保守結構域基序序列進行分析的結果與前人的報道相似［5 - 7 ］：BrBBX家族中的BBX1和BBX2結構域分別具有保守的C-X2- C-X8-C-X7-C-X2-C和C-X7-C-X2- C-X4-H基序（圖4A、圖4B），而CCT結構域包含了42～50個氨基酸殘基，也具有高度的保守性（圖4C）。

2.4? ?BrBBX46和BrBBX53的脅迫響應分析

早期有研究顯示，AtBBX24正調控擬南芥的耐鹽性［16 ］。通過系統發育和序列比對分析，在白菜型油菜中鑒定出2個AtBBX24的同源基因BrBBX46和BrBBX53，通過在數據庫下載的BrBBX46和BrBBX53基因的啟動子序列，對2個基因的啟動子元件進行統計分析。分析結果顯示，除了核心啟動子元件以外，BrBBX46基因的啟動子中響應干旱脅迫元件最多，有14個；BrBBX53基因的啟動子中光響應的元件數目最多（有17個），其次為干旱脅迫響應元件，與BrBBX46基因一樣，也有14個；BrBBX46和BrBBX53基因的啟動子中還發現與厭氧脅迫、光、水楊酸、防御和脅迫相關的啟動子元件。但響應低溫、細胞周期調控、赤霉素和生長素的作用元件僅存在于BrBBX53基因的啟動子中（圖5A）。上述結果說明BrBBX46和BrBBX53可能與干旱、厭氧等脅迫應答相關，BrBBX53還可能響應低溫和植物激素的誘導［33 ］。

利用qRT-PCR技術，鑒定了BrBBX46和BrBBX53基因在模擬干旱和鹽脅迫條件下的表達水平，結果表明，BrBBX46和BrBBX53基因的表達水平受PEG和NaCl誘導均顯著上調，與對照未脅迫相比，BrBBX46基因在PEG和NaCl處理下的表達水平上調了6倍左右（圖5B）；BrBBX53基因在PEG處理下上調了12倍，在NaCl處理下上調了9倍（圖5C）。說明BrBBX46和BrBBX53基因既能響應PEG模擬干旱的誘導，也可能參與NaCl誘導的鹽脅迫響應。

3? ?結論與討論

在白菜型油菜中共鑒定到59個BrBBX，分布于白菜型油菜基因組的10條染色體。與擬南芥相比，白菜型油菜每個亞族中的BrBBX蛋白數量均介于AtBBX數量的1.50 ～ 2.20倍，說明在進化過程中白菜型油菜BrBBX家族發生了基因復制事件。水稻是單子葉植物進化分析的模式植物，與水稻相比，白菜型油菜每個亞族中的BrBBX蛋白數量是水稻中OsBBX數量的1.28 ～ 5.00倍，這說明了單子葉植物與雙子葉植物之間的進化差異。白菜型油菜BBX家族基因在進化上相對保守，聚類于同一亞族的基因具有相似的基因結構與蛋白結構。前人報道擬南芥第Ⅰ亞族和第Ⅱ亞族中的BBX成員均包含2個BBX結構域，并且BBX1結構域位于BBX2結構域之前［5 ］，而本研究發現僅在第Ⅱ亞族中與擬南芥結構域一致。在第Ⅰ亞族中BrBBX蛋白的BBX1結構域在BBX2結構域之后；且在擬南芥中的第Ⅴ亞族中僅發現了BBX1結構域，而在白菜型油菜的第Ⅴ亞族中既發現了BBX1結構域，還發現了BBX2結構域的存在。這可能是在進化的過程中，白菜型油菜的BrBBX家族發生了BBX結構域改變或缺失［34 - 35 ］。

BBX家族基因在響應生物和非生物脅迫方面發揮著重要作用［17， 21 ］。AtBBX24正向調控擬南芥的耐鹽性［16 ］，AtBBX5正向調控擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性［25 ］，AtBBX18負調控擬南芥耐熱性［17 ］。通過系統進化分析，從進化保守的BBX結構域未發生改變的第Ⅳ亞族中比對到擬南芥AtBBX24的同源基因：BrBBX46和BrBBX53，對其啟動子元件進行了分析，發現這2個BrBBX基因的啟動子中含有大量的干旱脅迫響應元件。模擬干旱和鹽處理條件下，二者的表達量均顯著上調，均能響應干旱和鹽脅迫的誘導，說明BrBBX46和BrBBX53與二者在擬南芥中的同源基因AtBBX24相似，均能響應鹽脅迫的誘導；BrBBX46和BrBBX53基因啟動子中富含的大量干旱脅迫響應元件，也使其在模擬干旱條件下通過上調基因的表達水平來應對干旱脅迫。方寶華等［14 ］的研究表明，水稻中也有部分BBX成員能夠響應鹽脅迫和干旱脅迫，如OsBBX6、OsBBX7、OsBBX19、OsBBX28等均能響應干旱脅迫，OsBBX1、OsBBX19、OsBBX26、OsBBX28等能響應鹽脅迫的誘導。但也有推測：水稻BBX可能不是作為干旱或鹽脅迫中的重要因子參與逆境響應。根據系統進化分析，在水稻中BrBBX46和BrBBX53的同源基因是OsBBX4，但在非生物脅迫的表達譜鑒定中，該基因在干旱和鹽處理下表達量略有上調，但未達到顯著差異，這可能是由于OsBBX4與BrBBX46和BrBBX53的親緣關系較遠，導致了不同物種中同源基因的功能差異化。

本研究利用生物信息學分析手段在白菜型油菜全基因組水平上鑒定到59個BrBBX成員，系統地分析了59個BrBBX的染色體分布、系統發育、基因結構、蛋白保守結構域，以及AtBBX24的同源基因BrBBX46和BrBBX53對干旱脅迫（40% PEG處理）、鹽脅迫（120 mmol/L NaCl處理）的響應，并利用qRT-PCR技術鑒定了BrBBX46和BrBBX53基因在模擬干旱脅迫和鹽脅迫下的表達水平，結果顯示，59個BrBBXs不均勻地分布在白菜型油菜基因組的10條染色體上。通過對系統進化、基因結構、蛋白保守結構域的分析，將59個BrBBXs分為5個亞族，每個亞族的基因結構、蛋白結構域和保守基序都相對保守，同一亞族的成員具有相似的基因結構和保守結構域。啟動子的分析結果顯示，BrBBX46和BrBBX53基因的啟動子中均含有大量的脅迫相關響應元件，尤其是干旱脅迫響應元件，二者均有14個；在40% PEG和120 mmol/L NaCl處理下，二者的表達水平均顯著上升，說明BrBBX46和BrBBX53基因能夠響應干旱脅迫和鹽脅迫的誘導，可能在干旱脅迫和鹽脅迫下發揮著重要功能。為了解和研究白菜型油菜基因家族的成員提供了豐富的信息和理論基礎，并且為進一步利用BrBBX家族成員改良白菜型油菜耐旱耐鹽新品種提供了良好的基因資源。

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收稿日期：2023 - 11 - 20

基金項目：四川省財政自主創新專項（2022ZZCX028）。

作者簡介：皮博藝（1993 — ），女，湖南澧縣人，助理研究員，博士，主要從事作物分子生物學及遺傳育種研究工作。Email： boyipi@163.com。

通信作者：宋? ?軍（1981 — ），男，四川眉山人，副研究員，碩士，主要從事植物誘變及生物育種工作。Email： 39535047@qq.com。