綿羊ANO5基因的生物信息學分析

代淇佳 馬博 謝凡 張小雪

摘要：作為Anoctamin蛋白家族的第五個成員，ANO5基因主要在綿羊肌肉再生、肌母細胞融合和肌細胞膜修復中發揮作用。為探究ANO5基因在綿羊體內的功能，本研究利用生物信息學軟件分析了綿羊ANO5基因及其編碼產物的結構與功能。結果顯示：綿羊ANO5基因含有一個最大長度為3 351 bp的開放閱讀框，推測其編碼1116個氨基酸殘基。該基因編碼蛋白的分子式為C5897H9014N1546O1668S42，分子質量為129 602.32 Da，理論等電點為7.24，估計半衰期為30 h，不穩定指數為49.71，脂肪族氨基酸指數為79.43。綿羊ANO5蛋白位于質膜的可能性最大（56.5%），不含信號肽，具有8段跨膜區，屬于不穩定親水性跨膜蛋白。二級結構以無規卷曲（68.43%）為主，三級結構主要由無規卷曲纏繞折疊形成。

關鍵詞：綿羊；ANO5基因；生物信息學分析

中圖分類號：S826? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2024）01-0037-06

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.01.006

Bioinformatics Analysis of ANO5 Genein Ovis aries

DAI Qijia， MA Bo， XIE Fan， ZHANG Xiaoxue

（College of Animal Science and Technology， Gansu Agriculture University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： As the fifth member of the protein family Anostatin， the ANO5 gene mainly plays a role in sheep muscle regeneration， myocyte fusion， and muscle cell membrane repair. To explore the function of ANO5 gene in sheep， bioinformatics software was used in this study to analyze the structure and function of the ANO5 gene and its encoding product. The findings indicatesthat the ANO5 gene encodes 1116 amino acid residues and has an open reading frame with a maximal length of 3 351 bp. The protein that is encoded by this gene is C5897H9014N1546O1668S42 in molecular formula， 129 602.32 Da in molecular mass， 7.24 in theoretical isoelectric point， 30 hours in estimated half-life， 49.71 in instability index， and 79.43 in aliphatic amino acid index. The sheep ANO5 protein， which contains eight transmembrane domains， is an unstable hydrophilic transmembrane proteinand is most likely to be found in the plasma membrane （56.5%）. It also lacks signal peptides. Random curling accounted for 68.43% of the secondary structurewhile winding folding， and random curling constituted the majority of the tertiary structure.

Key words： Ovis aries; ANO5 gene; Bioinformatics analysis

Anoctamin 蛋白家族共10個成員，分別為ANO1～10，它們在離子轉運、磷脂擾亂和調節其他膜蛋白等方面發揮功能［1 ］。作為Anoctamin家族的第五個成員，ANO5基因主要在肌肉再生、肌母細胞融合和肌細胞膜修復中發揮作用。骨骼肌在正常使用過程中會承受相當大的機械應力，從而使骨骼肌細胞質膜受損甚至部分死亡［2 ］。這些損傷可通過質膜重組或衛星細胞修復，失去的骨骼肌細胞可通過駐留在組織中的肌肉干細胞分化而彌補［3 ］。然而，過度地再生和有缺陷的膜修復會耗盡干細胞池，導致肌肉無力和萎縮［4 ］，從而影響動物的肌肉生長速度。2016年，Griffin等［5 ］報道稱ANO5基因缺失小鼠在激光誘導損傷后修復肌漿的能力下降；同時，在心臟毒素損傷后表現出再生延遲，并出現肌母細胞融合缺陷。2019年，Chandra等［6 ］通過首次建立人類肌肉細胞模型來研究ANO5 在肌肉萎縮癥中的細胞功能，證明了 ANO5在人類肌肉細胞肌漿膜修復中的作用。2021年，Foltz等［7 ］發現小鼠肌肉損傷后ANO5通過促進關鍵修復蛋白的轉運以促進膜修復。2023年，Schmaier等［8 ］發現，缺失ANO5基因的小鼠在血管損傷后纖維蛋白形成數量減少。但是關于ANO5基因具體如何調節肌肉再生、肌母細胞融合和肌細胞膜修復尚有爭議，還有待進一步研究。

然而以上對ANO5基因的研究主要集中在人和小鼠，綿羊上的研究幾乎空白，其生物學功能尚不明確。因此，本研究通過對綿羊ANO5基因及其編碼產物的理化性質、序列特征、蛋白質結構進行預測和分析，以期為深入研究該基因及其編碼蛋白基本結構提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?序列來源

數據資料來源于NCBI網站（www.ncbi.nlm.nih.gov）的GenBank數據庫，包括綿羊（XP_042093 646.1）、狗（XP_038285432.1）、黑猩猩（XP_05451 8146.1）、人（XP_005252879.1）、雞（XP_046797525.1）、家鼠（NP_001407332.1）、牛（XP_024842731.1）、山羊（XP_017899030.1）、野牦牛（XP_005907 878.1）等9個物種的mRNA序列（括號內為GenBank登錄號）。

1.2? ?方法

采用 NCBI 的在線分析程序ORF Finder分析綿羊ANO5基因開放閱讀框（Openreading frame，? ORF）；采用ProtParam工具及Bioedit7.0軟件預測綿羊ANO5蛋白的理化性質，包括分子量、等電點、分子式、原子總數、不穩定指數、脂溶指數和總平均親水性指數等；采用PSORT Ⅱ 預測蛋白亞細胞定位；采用 SignalP 6.0預測蛋白信號肽；采用DeepTMHMM預測蛋白跨膜螺旋區域；采用Smart軟件分析蛋白保守結構域；采用ProtScale工具分析蛋白親疏水性；采用Jpred 4分析蛋白二級結構信息；采用 SWISS-MODEL網站對綿羊ANO5蛋白進行三級結構的預測；采用 DNAMAN 6.0 軟件進行多個物種 ANO5蛋白的氨基酸序列比對分析并構建同源樹［9 - 11 ］。

2? ?結果與分析

2.1? ?綿羊ANO5基因開放閱讀框分析

開放閱讀框（Open Reading Frame， ORF）是mRNA上的一段堿基序列，起始于起始密碼子，結束于終止密碼子，1個ORF對應1個蛋白質，通過ORF分析可以證明新的DNA序列是否能夠為特定的蛋白質編碼基因［11 ］。采用NCBI的ORF Finder程序分析綿羊ANO5基因開放閱讀框，結果見圖 1。綿羊ANO5基因CDS區有34個開放閱讀框，其中有一條最大長度為3 351 bp的ORF，起始密碼子位于56 bp處，終止密碼子位于3 406 bp處，推測其編碼1 116個氨基酸殘基。

2.2? ?綿羊ANO5蛋白的基本理化性質分析

蛋白質的基本理化性質包括相對分子質量、等電點pI、氨基酸組成、基因編碼產物的不穩定指數和半衰期等［11 ］。采用Bioedit及ProtParam軟件對綿羊ANO5基因編碼產物理化性質進行分析，結果表明，綿羊ANO5 蛋白理論等電點pI為7.24，帶負電荷的氨基酸殘基有139個，帶正電荷的氨基酸殘基總數有139個。其分子式為C5897H9014N1546O1668S42，總原子數為18 167，分子質量為129 602.32 Da。其氨基酸組成見圖 2，其中氨基酸組成中含量最多的氨基酸是Leu（亮氨酸），所占比例為9.14%；含量最少的氨基酸是Cys（半胱氨酸），所占比例為1.43%。綿羊ANO5蛋白脂肪族氨基酸指數為79.43，半衰期為30 h，不穩定指數為49.71，標準蛋白的不穩定參數值 < 40，由此可確定該蛋白屬于不穩定蛋白。

2.3? ?綿羊ANO5蛋白亞細胞定位

采用PSORTⅡ在線軟件對綿羊ANO5蛋白進行亞細胞定位的結果可知，綿羊ANO5蛋白主要分布在質膜中，概率為56.5%；分布在內質網的概率較高，為34.8%；同時分散分布在線粒體（概率為4.3%）和高爾基體（概率為4.3%）中。由此推斷，該蛋白主要在質膜中發揮生物學作用。

2.4? ?不同物種ANO5蛋白的多序列比對及同源性分析

采用DNAMAN軟件將NCBI中收錄的人、黑猩猩、狗、山羊、綿羊、牛、野牦牛、家鼠、雞等共9種動物的ANO5蛋白序列進行多序列比對和同源樹分析的結果（圖 3、圖 4）表明，綿羊與同為牛科的山羊、牛、野牦牛同源性較高，分別為99%、95%、92%。

2.5? ?綿羊ANO5蛋白信號肽預測及跨膜結構域預測

采用Signalp6.0軟件及DeepTMHMM程序對綿羊ANO5蛋白信號肽分析及跨膜結構域預測分析結果（圖 5、圖 6）表明，綿羊ANO5蛋白不存在信號肽，但具有8段跨膜區域，由此推斷其屬于一種非分泌跨膜蛋白。

2.6? ?綿羊ANO5蛋白保守結構域分析

采用smart在線軟件對綿羊ANO5蛋白保守結構域預測分析結果（圖 7、表 1）表明，綿羊ANO5蛋白共有8個跨膜區域，分別為500～522、582～601、659～681、711～733、756～778、877～899、933～952、1023～1045；第58～121、208～219、276～284、618～626、1080～1091位氨基酸殘基均為低復雜性區域。

2.7? ?綿羊ANO5蛋白親水性/疏水性分析

采用 ProtScale 軟件對綿羊ANO5蛋白進行蛋白親水性/疏水性分析，結果見圖 8。研究發現，綿羊ANO5蛋白的疏水性分值在第677～678位氨基酸處最高，為3.256；在第143位氨基酸處最低，為-3.556，總平均親水性為-0.373。由此可知，該蛋白為親水性蛋白。

2.8? ?綿羊ANO5蛋白結構預測

2.8.1? ? 蛋白二級結構預測? ? 采用 Jpred 軟件對綿羊ANO5蛋白二級結構分析預測，結果見圖 9。研究發現，綿羊ANO5蛋白的二級結構包括68.43%的無規卷曲，26.43%的α螺旋，5.14%的β折疊?？芍?，該蛋白為混合型蛋白，且二級結構以無規卷曲為主。

2.8.2? ? 蛋白三級結構預測? ? 使用在線軟件SWISS-MODEL對綿羊ANO5蛋白的三級結構進行預測，結果見圖 10。研究發現，綿羊ANO5蛋白三級結構中無規卷曲占主要部分。

3? ?結論與討論

骨骼肌對機體呼吸、代謝、運動、體溫保持等基本生命活動具有重要的調控作用，而運動、疾病、創傷等會導致骨骼肌不同程度的損傷［12 ］。細胞膜不僅是分隔細胞內外環境的屏障，還是細胞內外物質交換和信息傳遞的樞紐［13 ］。因此，細胞膜的完整性對維持細胞內穩態并發揮其正常生理功能的重要性不言而喻［14 ］。然而， 細胞膜常因生理、病理因素導致損傷［15 ］。骨骼肌具有顯著的再生能力，細胞膜也具有一定的修復能力，它們能夠在損傷后進行自我修復，從而保證其正常生理功能。ANO5在人和小鼠上已被證實能夠影響肌肉再生、肌母細胞融合和肌細胞膜修復［5 - 7 ］，而肌肉再生、肌母細胞融合和細胞膜修復的過程對綿羊的生長性能又有重要影響，因此對該基因及其編碼產物開展功能預測與研究是有必要的。因此，本研究利用生物信息學方法，對綿羊ANO5基因的開放閱讀框及其編碼產物的理化性質、親疏水性、信號肽位點、亞細胞定位、保守結構域、蛋白質二級結構、三級結構進行預測分析。并將不同物種該蛋白氨基酸序列進行多序列比對和同源性分析。分析結果表明：綿羊ANO5基因最長ORF長度為3 351 bp，起始密碼子位于56 bp處，終止密碼子位于3 406 bp處，推測其編碼1 116個氨基酸殘基。氨基酸組成中含量最多的是Leu（亮氨酸），所占比例為9.14%；含量最少的氨基酸是Cys（半胱氨酸），所占比例為1.43%。蛋白分子式為C5897H9014N1546O1668S42，分子質量為129 602.32 Da。該蛋白理論等電點為7.24，脂肪族氨基酸指數為79.43，估計半衰期為30 h，不穩定指數為49.71，由于蛋白質的半衰期與穩定性之間有一定的關系，半衰期時間短的蛋白質通常穩定性較差，所以該蛋白是一種不穩定型蛋白［16 ］。亞細胞定位位于質膜的可能性最大，為56.5%。該蛋白不存在信號肽，具有8段跨膜區，是一種非分泌跨膜蛋白。疏水性分值在第677～678位氨基酸處最高，為3.256，在第143位氨基酸處最低，為-3.556，總平均親水性為-0.373，表明該蛋白具有一定的水溶性。該蛋白二級結構以無規卷曲（68.43%）為主，有助于其識別結合序列［17 ］。三級結構由無規卷曲纏繞折疊形成，這與該蛋白二級結構組成相一致。綿羊ANO5與山羊ANO5和牛ANO5同源性較高（95%和92%），這與它們的動物分類學一致，它們都屬于偶蹄目、反芻亞目、?？?。

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收稿日期：2023 - 11 - 15

基金項目：甘肅農業大學大學生創新創業訓練計劃項目（202304027）。

作者簡介：代淇佳（2001 — ），男，河北保定人，本科在讀，研究方向為動物科學。Email： 654321921@qq.com。

通信作者：張小雪（1984 — ），女，湖北武漢人，副教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究及教學工作。Email： zhangxx@gsau.edu.cn。