雷公藤甲素通過調(diào)控NLRP3通路抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)

穆秉桃，李玉璐，劉淇源，孫肖樂，胡芬琦，曹佳蕾，楊鳳君，李佩佩，畢宇錦，王澤濤，張慧宇

（1.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所/分子細胞免疫學(xué)大同市重點實驗室，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009；3.山西大同大學(xué)中醫(yī)藥健康服務(wù)學(xué)院，山西大同 037009）

諸多證據(jù)表明，神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性疾病的病理生理學(xué)機制中占據(jù)了中心地位。在神經(jīng)退行性疾病腦組織中有許多炎癥標(biāo)記物，比如炎性細胞因子的增加，受損區(qū)域小膠質(zhì)細胞激活等。其中研究小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機制一直是焦點[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥小體活化在神經(jīng)退行性疾病炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2019 年《Nature》上的新成果揭示：在阿爾茨海默病中，Aβ 沉積會激活NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3）炎性小體[3]；NLRP3 炎性小體可以驅(qū)動帕金森病的神經(jīng)變性等[4]。提示抑制NLRP3 炎癥小體活化可能成為治療神經(jīng)退行性疾病的有效靶點。

由于NLRP3炎癥小體的激活主要存在于小膠質(zhì)細胞，因此NLRP3 炎癥小體就成為小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的主要響應(yīng)者。抑制其激活可能成為神經(jīng)退行性疾病的一種有希望的治療干預(yù)方法。

雷公藤甲素（Triptolide,TP）是二萜類化合物的一種，從雷公藤根部提取分離獲得，以顯著的抗炎、抗氧化和免疫抑制作用被廣泛應(yīng)用[5]。研究顯示，TP對小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)有顯著的抑制作用[6]，但是其機制尚不清楚。也有研究表明TP 可以抑制NLRP3 的活化[7]，我們推測TP 抑制BV2 小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)機制之一可能是通過調(diào)控NLRP3 通路。在本研究中，我們主要觀察TP 對脂多糖（Lipopolysaccharide LPS）誘導(dǎo)BV2 細胞的影響，包括其激活狀態(tài)、活性、炎性損傷和NLRP3 炎癥小體表達，探究其對神經(jīng)炎癥的抑制機制。

1 材料和方法

1.1 材料

鼠源性BV2 小膠質(zhì)細胞株，由軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認知與腦科學(xué)研究所提供。TP（純度≥98%）購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司（貨號：DL0034）；山羊抗兔（ab150077）熒光二抗為美國Abcam 公司產(chǎn)品；谷氨酰胺、高糖DMEM 為美國Gibco 公司產(chǎn)品；兔抗NLRP3 抗體（批號af2155）、兔抗ASC 抗體（af6234）、兔抗caspase1（af1681）、一氧化氮檢測試劑盒、RIPA 裂解液（P0013B）、LPS、牛血清蛋白及PMSF 均為上海碧云天公司產(chǎn)品；兔 抗IL-18 抗 體（57058S）、兔 抗GAPDH（5174S）、化學(xué)發(fā)光底物試劑（WBKLS0500）購自美國Milllipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗處理

10 mL 培養(yǎng)平皿中加入5～6 mL 含有100 mL/L胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的高糖培養(yǎng)基，把BV2細胞懸液滴2～3滴到平皿中混勻。在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，間隔1 d 換培養(yǎng)液，待細胞達80%豐度后用0.25 %的胰酶進行消化傳代接種培養(yǎng)。達對數(shù)生長期細胞分成對照組、LPS模型組、LPS+TP 藥物處理組三組。LPS模型組細胞采用1 mg/L LPS 作用24 h，LPS+TP 組細胞同時加入1 nmol/L TP[8]和1 mg/L LPS 作用24 h。鏡下觀察藥物組細胞發(fā)生的形態(tài)變化并和對照組比較，拍照記錄。

1.2.2 Griess 法測定上清液中的NO水平

在96 孔板中接種BV2 細胞，接種濃度50 個/μL，每孔100 μL 共設(shè)置5 個復(fù)孔，按照細胞分組藥物對應(yīng)處理24 h，吸取細胞上清液加入新的96 孔板中，每孔各50 μL 上清液和標(biāo)準(zhǔn)品，再各加50 μL 的Griess Reagent I和Ⅱ溶液，立即混勻后用酶標(biāo)儀測定540 nm處吸光值，同時制作并繪制NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線，用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算NO 含量。

1.2.3 Western blot法檢測

在6孔板中接種BV2細胞，接種濃度1 000個/μL，每孔2 000 μL，每組設(shè)置2 個復(fù)孔，依據(jù)細胞分組加入藥物處理24 h，棄上清液留下貼壁細胞，PBS 輕柔清洗，加RIPA 裂解液冰上裂解細胞30 min，收集液體，行超微量分光光度計定量蛋白，并將各組蛋白含量調(diào)成一致。后續(xù)用10%SDS-PAGE 進行電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為200 mA進行2 h，之后5%的脫脂牛奶封閉，4 ℃冰箱一抗[NLRP3、ASC、caspase1、IL-18 和GAPDH（1∶1000）]孵育過夜，次日室溫下二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶3000）]孵育2 h，然后Bio-Rad 凝膠成像儀蛋白顯影、觀察并定量分析條帶。

1.2.4 免疫熒光染色法

在24 孔板的底部放入滅菌玻璃小圓片，滴入100 μL 濃度為200 個/μL BV2 細胞液，30 min 后加入900 μL 細胞培養(yǎng)液，待細胞貼壁后依據(jù)分組加入藥物作用24 h，棄上清后用4 %多聚甲醛固定細胞30 min，固定前后用PBS 輕柔清洗細胞。接著加入封閉液封閉細胞1 h（含1%的BSA 和0.3%的Triton X-100 的PBS 液），4 ℃冰箱一抗[NLRP3、ASC、caspase1、IL-18（1∶1000）]孵育過夜：，次日室溫下避光二抗[Alex Fluor 594（紅色）和488（綠色）標(biāo)記的山羊抗兔IgG]孵育2 h，PBS 洗3 次，用DAPI 封固液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，實驗重復(fù)三次，數(shù)據(jù)取平均值，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP對LPS 誘導(dǎo)BV2 細胞NO 釋放量的影響

對NO 釋放量的檢測反映LPS 致炎作用，Griess法結(jié)果表明，對比對照組，模型組經(jīng)LPS 作用后細胞釋放出多量NO（P＜0.01），LPS致炎明顯；對比模型組，TP 組NO 的釋放量明顯較低（P＜0.05），抗炎效果明顯。

圖1 TP對LPS致炎BV2 細胞NO 釋放量的影響

2.2 TP對LPS誘導(dǎo)的BV2細胞形態(tài)的影響

圖2結(jié)果顯示，非激活狀態(tài)的BV2小膠質(zhì)細胞胞體較小而圓潤、胞質(zhì)清亮，細胞突起邊緣清晰。LPS致炎性激活狀態(tài)下的BV2 小膠質(zhì)細胞胞體變大、觸角延伸變粗變長，突起末端分支變多,呈現(xiàn)阿米巴樣。TP 組細胞形態(tài)發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，阿米巴樣小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯減少,細胞形態(tài)接近對照組。

圖2 TP作用LPS 誘導(dǎo)的BV2 細胞形態(tài)變化

2.3 TP對LPS 誘導(dǎo)的BV2 細胞炎性小體表達的影響

圖3～8顯示了TP對LPS誘導(dǎo)的BV2細胞炎性小體表達的影響。與對照組比較，模型組LPS致小膠細胞炎癥后，炎性小體成分NLRP3、ASC、caspase1表達增高，激活的炎性因子IL-18表達增高。與模型組比較，TP處理組NLRP3、ASC、caspase1和IL-18表達均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 NLRP3的免疫熒光染色檢測及比較

圖4 ASC的免疫熒光染色檢測及比較

圖5 caspase1的免疫熒光染色檢測

圖6 IL-18的免疫熒光染色檢測及比較

圖7 NLRP3、ASC、caspase1和IL-18 蛋白免疫印跡條帶圖

圖8 NLRP3、ASC、caspase1和IL-18 蛋白表達水平比較

3 討論

在近年的研究中，慢性炎癥已成為神經(jīng)退行性疾病的核心標(biāo)志。而神經(jīng)炎癥主要是由常駐小膠質(zhì)細胞群體驅(qū)動的[9]。由NLRP3、凋亡相關(guān)點狀蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD ASC）和半胱天冬酶-1 前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1 Pro-caspase-1）組成的NLRP3炎性小體，促進前體Procaspase-1成熟為活性caspase-1，參與關(guān)鍵調(diào)節(jié)介質(zhì)Gasdermin D（GSDMD）的切割，存在GSDMD 氨基末端的結(jié)構(gòu)域又可以激活NLRP3 炎癥小體引起系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)[10]?；钚詂aspase-1還將白細胞介素（Interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的前體裂解為活性物質(zhì)，促進IL-18成熟并介導(dǎo)神經(jīng)組織損傷的炎癥反應(yīng)。更多的研究已經(jīng)明確了NLRP3炎癥小體在神經(jīng)退行性疾病中異?；罨?，NLRP3、caspase1上調(diào),IL-18的表達增強。IL-18通過多種機制誘導(dǎo)神經(jīng)細胞損傷，包括誘導(dǎo)NO產(chǎn)生，激活壞死和凋亡通路、調(diào)節(jié)突觸可塑性和絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activatedprotein kinase，MAPK）通路的影響元件，破壞細胞外基質(zhì)和血腦屏障，加劇腦細胞水腫，最終導(dǎo)致細胞壞死[11]。本實驗LPS誘導(dǎo)刺激BV2小膠質(zhì)細胞炎癥損傷，通過免疫熒光和wester blot法觀察到，LPS使BV2細胞NLRP3炎癥小體激活，NLRP3、ASC、caspase1表達增加（P＜0.5）,促IL-18炎癥因子的成熟并誘導(dǎo)其大量表達（P＜0.5），引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

最新報道顯示,TP可以通過Nrf/HO-1通路抑制NLRP3炎癥小體的免疫活化,預(yù)防細胞損傷[12]。本實驗利用具有抗炎作用的TP作用于LPS誘導(dǎo)的炎性BV2細胞24 h后，免疫熒光和westerblot 顯示炎性小體成分NLRP3、ASC、caspase1表達受到抑制，并且炎癥因子IL-18的表達降低，和LPS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.5），說明中藥雷公藤甲素的抗炎效果良好，對小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)有抑制作用。

由上所知，LPS 誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞激活，NLRP3炎性小體及致炎因子表達增高，致炎作用明顯，TP干預(yù)后抑制了NLRP3 通路激活，有抑炎并保護神經(jīng)細胞作用。靶向不同位點抑制小膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體的激活可能成為干預(yù)神經(jīng)退行性疾病的一種有希望的治療策略。TP治療有可能成為神經(jīng)退行性疾病中抑制炎癥反應(yīng)的新思路。下一步實驗中，我們將建立不同的細胞及動物模型進一步明確TP的神經(jīng)保護作用及其它機制，為深入探討神經(jīng)退行性疾病的致病機制、尋找新靶點和篩選新的有效藥物提供理論和實驗依據(jù)。