響應面法優化蛹蟲草液體發酵配方及條件的研究

童奇偉 周吉亮 羅珊珊 曹天旭 蔣佳穎 杜萍*

響應面法優化蛹蟲草液體發酵配方及條件的研究

童奇偉1周吉亮2羅珊珊2曹天旭2蔣佳穎2杜萍2*

（1. 重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 萬州 404100；2. 長江師范學院現代農業與生物工程學院，重慶 涪陵 408100）

蛹蟲草是一種珍稀的藥食兩用真菌，為提高其菌絲體的液體發酵效率，首先通過單因素試驗確定了蛹蟲草液體發酵的最優碳源、氮源及適宜培養的pH、溫度、裝液量和轉速6個因素。然后采用Plackett-Burman試驗設計，確定葡萄糖、牛肉膏、溫度是影響蛹蟲草液體發酵菌絲體生物量的關鍵因素。利用響應面法設計三因素三水平試驗，最終獲得蛹蟲草菌絲體液體發酵的最佳配方及條件為：牛肉膏13.34 g/L、葡萄糖20.00 g/L、MgSO41.5 g/L、KH2PO41.5 g/L，pH 6.5，搖床轉速150 r/min，溫度27 ℃。驗證試驗表明，優化后條件培養的菌絲生物量可達1.489 g/105 mL，是優化前的2倍，與模型預測值基本一致，優化效果較好，可為蛹蟲草液體深層發酵培養及后續工廠化生產提供技術參考。

蛹蟲草；液體發酵；響應面法；菌絲生物量

蛹蟲草（）又名北冬蟲夏草，是子囊菌亞門、麥角菌科、蟲草屬的一種藥食兩用真菌[1-3]。蛹蟲草與珍稀藥用菌冬蟲夏草在有效成分、功效等方面有諸多相似之處。相比冬蟲夏草，蛹蟲草還具有生長周期短、更易人工培養的優勢。近年來，蛹蟲草作為冬蟲夏草的替代品被廣泛開發利用，其子實體富含蟲草多糖、蟲草素和甾醇類等多種活性成分[4-6]。蟲草素（Cordyce-pin）作為其利用最為廣泛的活性成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒等功效，常被用來治療人體免疫方面的疾病[7-9]。

液體發酵培養法因生產周期短、可連續發酵、便捷、獲取發酵活性物質成本低而被廣泛應用。蛹蟲草液體培養菌絲體的化學組成與子實體接近[10]，其液體培養基配方及發酵條件的研究多采用單因素或正交試驗方法，選取的培養基配方及條件的因素不夠全面，得到的工藝條件有較大偏差。響應面分析法通過回歸方程分析優化試驗條件，預測響應值，反映各因素之間對結果的交互影響，可有效確定多個影響因子的最佳組合條件。因此，本研究采用響應面法優化蛹蟲草液體發酵配方及條件，為提高工業發酵蛹蟲草菌絲體生物量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種。蛹蟲草母種為野生標本分離菌種，菌株編號為JLCY-LI819，標本于2016年7月16日由北華大學林學院由士江采自吉林省吉林市永吉縣口前鎮，經ITS序列鑒定為，即蛹蟲草，基因序列號為MT525327，現保存于長江師范學院食用菌栽培實驗室。

供試培養基配方。PDA培養基（用于母種擴繁）：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L，pH自然。基礎培養基：碳源20 g/L、氮源10 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗

（1）碳源試驗。設葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、甘露醇、糊精、乳糖、可溶性淀粉和麥芽糖9種供試碳源，分別添加到以蛋白胨為氮源的基礎培養基中，250 mL錐形瓶裝液量為100 mL，常規方法制備培養液，待滅菌冷卻后接入2塊1 cm2大小的蛹蟲草菌塊，于27 ℃、130 r/min搖床培養7天，每天觀察菌絲生長情況及長勢，培養結束后，用純凈水將菌絲體沖洗干凈，置于50 ℃烘箱干燥至恒重后測定菌絲生物量（干重），每處理5次重復。

（2）氮源試驗。設尿素、硝酸銨、蛋白胨、麩皮、麥芽浸膏、酵母膏與牛肉膏7種供試氮源，分別添加到以葡萄糖為碳源的基礎培養基中，其他操作同碳源試驗，下同。

（3）pH試驗。采用葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源的基礎培養基，將培養液的pH分別調節至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5與8.0。

（4）溫度試驗。采用葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源的基礎培養基，培養溫度分別設置為19、21、23、25、27與31 ℃。

（5）轉速試驗。采用葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源的基礎培養基，發酵液pH調節到6.5，轉速分別設置為110、120、130、140、150與160 r/min。

（6）裝液量試驗。采用葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源的基礎培養基，發酵液pH調節到6.5，轉速130 r/min，裝液量分別設置為30、45、60、75、90、105、120與130 mL。

1.2.2 蛹蟲草液體發酵Plackett-Burman設計

根據單因素試驗結果，以菌絲體生物量為評價指標，通過Design-Expert 8.0.6軟件設計6因素2水平的Placket-Burman響應面試驗（表1），篩選對蛹蟲草菌絲生長影響顯著的因素，并分析不同因素間的相互作用。

1.2.3 蛹蟲草液體發酵Box-Behnken 試驗

在1.2.2試驗結果的基礎上，以葡萄糖濃度、牛肉膏濃度與培養溫度為自變量，通過Box-Behnken設計3因素3水平的響應面試驗（表2），以菌絲體生物量為響應值，對菌絲體生物量進行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與響應值之間函數關系的回歸方程，根據試驗生成的等高線和響應面圖確定最優的發酵條件。

1.2.4 模型的驗證

以發酵實驗驗證響應面模型優化的最佳條件，比較模型預測值與實驗值，驗證模型的有效性，實驗重復4 次，取平均值。從15組條件中選出一組最佳的培養工藝，對分析出來的最佳工藝條件模型再進行4次重復試驗，以驗證響應面分析結果的準確性和實際可行性，并與響應面優化前獲得的菌絲生物量進行比較。

1.2.5 數據分析

采用Microsoft Excel 2016對試驗數據進行整理，利用SPSS 25.0軟件進行數據的差異顯著性檢測及方差分析（< 0.05），GraphPad Prism 5.0軟件繪圖，以Design-Expert 8.0.6進行Placket-Burman與Box-Behnken的試驗設計、分析測試結果，以優化因素的最佳添加量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同碳源與氮源的蛹蟲草菌絲生物量

在發酵液中添加不同碳源與氮源對蛹蟲草菌絲生物量的影響不同（圖1～圖3）。碳源以葡萄糖的菌絲體生物量顯著高于其他碳源，菌絲球密集，木糖的菌絲體生物量最低，菌絲球最少。氮源則以牛肉膏培養基蛹蟲草菌絲體生物量最高，菌絲球數量多而密集，以尿素為氮源的菌絲體生物量最低，幾乎不生長。

2.1.2 不同pH與培養溫度的蛹蟲草生物量

隨著發酵液pH與培養溫度的升高，蛹蟲草菌絲體的生物量均呈先增加后下降的變化趨勢（圖4～圖6）。發酵液pH為6.5時，菌絲體生物量最高，為0.67 g/100 mL，pH 4和8的菌絲體生物量顯著低于其他處理。發酵液pH在5.5～7時，菌絲球大小基本一致，而pH偏低或偏高時，發酵液呈淡黃色，菌絲球小而數量少。

表1 Plackett-Burman分析因素及水平

表2 Box-Behnken分析因素及水平

注：小寫字母不同表示在P < 0.05水平差異顯著，下同。

圖2 不同氮源對蛹蟲草菌絲體生物量的影響

圖3 不同碳源與氮源蛹蟲草液體發酵情況

圖4 不同pH與培養溫度蛹蟲草液體發酵情況

培養溫度以27 ℃時，菌絲體生物量顯著高于其他處理，為0.6 g/100 mL，且菌絲生長茁壯，幾乎覆蓋整個液面。當培養溫度為19 ℃時，菌絲體生物量最低，為0.05 g/100 mL。

2.1.3 不同裝液量與培養轉速的蛹蟲草生物量

不同裝液量與培養轉速對蛹蟲草菌絲體的生物量有顯著影響，隨著裝液量與培養轉速的增加，菌絲生物量均呈現先增加后下降的單峰曲線變化（圖7～圖9）。裝液量以105 mL菌絲體生物量顯著高于其他處理，菌絲球整體長勢較好，均勻一致，培養液呈清亮的淡黃色。培養轉速以150 r/min菌絲生物量最高，為0.89 g/100 mL，顯著高于其他處理，當轉速為110 r/min時，菌絲體生物量最低，僅為0.04 g/100 mL。

圖5 不同pH對蛹蟲草菌絲體生物量的影響

圖6 不同溫度對蛹蟲草菌絲體生物量的影響

圖7 不同裝液量對蛹蟲草菌絲體生物量的影響

圖8 不同培養轉速對蛹蟲草菌絲體生物量的影響

2.2 Plackett-Burman試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，以菌絲體生物量為響應值，以影響菌絲體生物量的葡萄糖、牛肉膏、溫度、pH、轉速、裝液量6個因素為考察因素，Plackett-Burman試驗設計及結果見表3，可知不同發酵液配方與發酵條件的組合對蛹蟲草菌絲體生物量的影響不同，菌絲體生物量從0.22 g到1.16 g不等。進一步方差分析表明，葡萄糖（A）、牛肉膏（B）、溫度（C）3個因素對蛹蟲草菌絲體生物量具有顯著性影響（表4）。

圖9 不同裝液量與培養轉速對蛹蟲草液體發酵的影響

2.3 Box-Behnken 試驗結果

在單因素試驗和Plackett-Burman試驗的基礎上，確定葡萄糖、牛肉膏、溫度是影響蛹蟲草液體發酵菌絲體生物量的關鍵因素，以這3個因素為自變量，以生物量為響應值，運用Box-Behnken方法設計三因素三水平試驗進一步優化發酵參數，結果見表5，菌絲體生物量在0.891～1.587 g/105 mL之間。用Design Expert 8.0.6 軟件對試驗數據進行回歸分析，得到如下方程描述蛹蟲草菌絲體生物量的響應面特征：

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果

表4 Plackett-Burman方差分析結果

＝1.56＋0.14＋0.14－0.061－0.086＋0.009－0.062－0.1182－0.2092－0.1412

其中，是預測的菌絲體生物量，、、分別為葡萄糖、牛肉膏與培養溫度的編碼值。

回歸方程的方差分析表明，所建回歸方程的模型差異顯著（< 0.05），而失擬項差異不顯著（> 0.05），表明模型具有較高可靠性，建模成功。此外，葡萄糖、牛肉膏與培養溫度3個因素，以及、、2、2與2均顯著，模型的擬合度2為0.9841，表明該二次方程模型可以解釋和預測98.41%的變量響應（表6）。

2.4 響應曲面分析

葡萄糖、牛肉膏與培養溫度3個因素兩兩交互作用對菌絲體生物量的響應面曲面圖見圖10。響應曲面圖越陡，因素之間的交互作用越顯著，反之不顯著；等高線越密集且形狀越近似于橢圓形，因素之間交互效應越強，反之越弱[11]。由圖10可知，葡萄糖與牛肉膏、牛肉膏與培養溫度的交互作用顯著，而葡萄糖與培養溫度的交互作用不顯著。在等高線圖中，藍色區域為響應最低值，紅色區域為響應最高值。當溫度為27 ℃時，葡萄糖濃度為20～23 g/L，牛肉膏濃度為12～14 g/L時蛹蟲草菌絲體生物量最高。牛肉膏濃度為12 g/L，當葡萄糖濃度為20～23 g/L，溫度為26～27.5 ℃時蛹蟲草菌絲體生物量最高，其余區間干重較低不適合取值。當葡萄糖濃度為20 g/L時，牛肉膏濃度為12～14 g/L，溫度為26～27.5 ℃為最佳取值區間，得到的蛹蟲草菌絲干重最高。

2.5 驗證試驗

綜合單因素試驗結果和響應面模型數據分析得出愿望函數優化，得到蛹蟲草最佳液體發酵培養基的配方為：牛肉膏為13.34 g/L、葡萄糖20.0 g/L、MgSO41.5 g/L、KH2PO41.5 g/L，pH 6.5。最適培養條件為：溫度27 ℃，轉速150 r/min，裝液量105 mL，發酵周期7 d。利用該參數再次進行液體發酵培養，以檢驗該模型的準確性，4個平行試驗結果得到菌絲體干重1.489 g，與預測值基本一致。

表5 Box-Behnken試驗設計及結果

表6 響應面法優化發酵條件試驗模型

注：2= 0.9841，2Adj= 0.9556；*與**分別表示差異顯著（<0.05）與極顯著（<0.01）。

3 討論與結論

蛹蟲草含有蟲草多糖、蟲草素、甾醇等生物活性物質，具有降血糖、抗炎、抗腫瘤、抗轉移、降血脂、免疫調節和抗氧化等作用，食藥用價值高。優化發酵配方與發酵條件是提高蛹蟲草液體發酵效率的重要途徑。本研究通過單因素試驗明確了發酵液中的碳源、氮源、培養溫度、pH、裝液量與培養轉速對蛹蟲草菌絲體發酵的影響，并在此基礎上利用Plackett-Burman與Box-Behnken設計進行響應面優化試驗，分析了因素間的交互作用。結果顯示葡萄糖與牛肉膏分別是發酵液的最優碳源與氮源。此前，也有研究表明葡萄糖是蛹蟲草菌絲體生長與蟲草素合成的重要前體，這與本研究的結果一致[12]。本研究氮源試驗表明牛肉膏、蛋白胨與酵母膏等有機氮源均利于蛹蟲草菌絲體的生長，而無機氮的尿素則不利于菌絲的生長，這與Mao等[13]的研究結果相近。響應面分析表明葡萄糖與牛肉膏2個因素之間存在顯著的交互作用，因此在考慮碳源與氮源用量時應該綜合考慮。

本研究顯示蛹蟲草菌絲體在弱酸性環境中（pH 5.5～6.5）生長良好，這與Sung等[14]以及Park等[15]的研究結果相近。培養轉速與裝液量均關系到發酵液中的溶氧量，而適宜的溶氧量有利于菌絲體的生長和代謝平衡。本研究蛹蟲草菌絲體液體培養最佳裝液量為105 mL，最佳轉速為150 r/min，這與劉然等的研究結果接近[16]。

綜上所述，本研究獲得的蛹蟲草菌絲體液體發酵的最佳配方及條件為：牛肉膏13.34 g/L、葡萄糖20.00 g/L、MgSO41.5 g/L、KH2PO41.5 g/L，pH為6.5，搖床轉速150 r/min，溫度27.08 ℃（為便于操作，使用27 ℃）。驗證試驗表明，優化后的菌絲生物量可達1.489 g/105 mL，是優化前的2倍，與模型預測值基本一致，優化效果較好，為蛹蟲草液體深層發酵培養及后續工廠化生產提供了技術參考和理論依據。

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Optimization of formula and conditions for liquid fermentation ofby response surface method

TONG Qiwei1ZHOU Jiliang2LUO Shanshan2CAO Tianxu2JIANG Jiaying2DU Ping2*

（1. College of Biology and Food Enginerring, Chongqing Three Gorges University, Wanzhou 404100, China；2. College of Modern Agriculture and Bioengineering, Yangtze Normal University, Fuling 408100, China）

is a kind of rare medicinal and edible mushroom. In order to improve the liquid fermentation efficiency of its mycelia, the optimum carbon source, nitrogen source, pH, temperature, volume of culture media and rotation speed for liquid fermentation were optimized by single factor test. Then Plackett-Burman method was used to further optimize the single factors that were screened to affect mycelia biomass to screen the key influencing factors. The optimal formula and conditions of liquid fermentation ofmycelia were obtained as follows: beef extract 13.34 g/L, glucose 20.00 g/L, MgSO41.5 g/L, KH2PO41.5 g/L, pH 6.5, shaking speed 150 r/min, temperature 27 ℃. Verification tests showed that the biomass of mycelia under optimized conditionscould reach 1.489 g/105 mL, which was twice that before optimization, basically consistent with the predicted value of the model, and the optimization effect was good, which provided a theoretical basis for liquid deep fermentation culture and subsequent factory production of.

; liquid fermentation; response surface method; mycelial biomass

S646

A

2095-0934（2024）01-052-08

全國大學生創新創業訓練計劃項目（X202310647090）；長江師范學院大學生創新創業訓練計劃項目（X202310647090）

童奇偉（1998—），男，碩士研究生，研究方向為食藥用菌資源及馴化栽培研究。E-mail：1694180435@qq.com

杜萍（1982—），女，博士，教授，主要從事食藥用菌資源、馴化栽培及分子系統學研究。E-mail：duping7374@163.com。