藍盆花醇提物抗肝纖維化的作用及機制研究 Δ

金 蓉，趙曉璐，顏羽昕，高曉陽，張春艷，李明奇，馬月宏 （內蒙古醫科大學基礎醫學院，呼和浩特 010110）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是指肝臟受到損傷或異常刺激時發生的一種病理性改變，其最顯著的病理特征是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積[1—2]。已有研究證實，在肝臟損傷的情況下，肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）活化轉變為肌成纖維細胞，α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、膠原蛋白Ⅰ（collagen type Ⅰ，Collagen Ⅰ）和Collagen Ⅲ表達量增加，進而導致HF 的發生[3]。有研究發現，微小RNA-21 （miRNA-21）可通過靶向磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）調控磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路，即通過上調PTEN 表達抑制PI3K/Akt 信號通路，進而阻斷HF的發生發展[4]。目前，抗HF藥物的研發速度較為緩慢，尚無確切療效的藥物可應用于臨床。

蒙藥藍盆花，又稱蒙古山蘿卜花，主產于內蒙古、黑龍江、吉林等地[5]。其味甘、澀，性涼，具有清肝熱、肺熱及解毒、“燥合日烏”（即干燥積水、消腫、祛風濕）的作用[6]。前期本課題組通過超高效液相色譜-飛行時間質譜法鑒定發現，藍盆花中含有氨基酸類、酚類、皂苷類、黃酮類、生物堿類等多種有效成分，其中黃酮類成分為其主要藥效成分[7]。相關研究顯示，在德都紅花-7、額力根-7 等蒙醫經典藥方中，黃酮類成分均具有明顯抗HF的作用[4，8]。此外，本課題組前期通過轉錄組測序和京都基因與基因組百科全書富集差異基因發現，藍盆花可使PI3K/Akt 信號通路相關蛋白及miRNA-21 表達顯著下調[7]。本研究擬在前期研究基礎上，采用四氯化碳（CCl4）誘導HF 大鼠模型，初步揭示藍盆花醇提物改善HF的作用，并圍繞miRNA-21/PTEN/PI3K/Akt軸探討其可能的作用機制，為明確蒙藥藍盆花的適應證及其開發應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有1000B-8W 型藥物粉碎機、SM2010R 型切片機（德國Leica 公司），CLx800 型酶標儀（美國Bio-Tek 公司），CT15RE 型高速離心機（日本Hitachi 公司），DYY-6C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），7500 Fast 型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 主要藥品與試劑

藍盆花藥材（批號191219）購自內蒙古天盛蒙中醫有限責任公司，由內蒙古醫科大學蒙醫藥學院蒙藥炮制實驗中心主任呼日樂巴根教授鑒定為真品；蘇木素-伊紅（HE）染色液（批號BA4099）購自珠海貝索生物技術有限公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（批號20210727）、Masson 染色試劑盒（批號2109001）均購自北京索萊寶科技有限公司；miRNA-21 模擬物、模擬物NC（陰性對照）（批號均為20210813010），miRNA-21 抑制劑、抑制劑NC（陰性對照）（批號均為PA20210813010）和轉染試劑riboFECTTMCP（批號W0728）均購自廣州銳博生物技術有限公司；FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號Y1302）、SuperReal 熒光定量預混試劑（批號s8129）均購自天根生化科技（北京）有限公司；兔源α-SMA、Collagen Ⅰ、PTEN、PI3K、Akt單克隆抗體（批號分別為bs-10196R、bs-0578R、bs-0686R、bs-0128R、bs-6951R）均購自北京博奧森生物技術有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（批號10494-1-AP）、兔源β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號20536-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；Dy-Light 800 標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號ATWF15081）購自亞科因（武漢）生物技術有限公司。

1.3 動物

本研究所用動物為健康清潔級雄性Wistar大鼠，共78只，體重（200±20） g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2021-0006。大鼠于內蒙古醫科大學實驗動物中心先適應性飼養1 周后進行實驗，飼養環境溫度為20～22 ℃、相對濕度為45%～65%、晝夜明暗交替。本研究動物實驗經內蒙古醫科大學醫學倫理學會批準后實施（倫理審批號為YKD2019144）。

1.4 細胞株

大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購于北京北納科技有限公司。

2 方法

2.1 藍盆花醇提物的制備

藍盆花藥材經粉碎后，按藥液比1∶10（g/mL）加入70%乙醇回流提取，重復2次；過濾，取濾液合并，旋轉蒸發儀干燥濃縮，即得藍盆花醇提物粉末，詳細提取過程參考文獻[9]。采用紫外-可見分光光度法測得該醇提物中總黃酮含量為38%。

2.2 藍盆花醇提物含藥血清的制備

將28 只Wistar 大鼠隨機分為空白組與含藥血清制備組，每組14只。含藥血清制備組大鼠按1 800 mg/（kg·d）（以生藥量計）灌胃藍盆花醇提物（藍盆花的成人臨床用量為2～3 g，在制備含藥血清時按成人用量2.4 g 換算，本實驗劑量相當于8倍成人臨床等效劑量），空白組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天給藥1次，持續1周。末次給藥/生理鹽水2 h 后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，靜置20 min，然后在4 ℃離心機中以3 000 r/min 離心15 min，收集上層血清，用0.22 μm濾膜過濾，即得空白血清和含藥血清，－80 ℃冰箱中保存備用。

2.3 體內動物實驗

2.3.1 動物造模及分組

將剩余的50只大鼠按隨機數字表法分成5組，即空白組、模型組和藍盆花醇提物低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg，以生藥量計；按成人用量2.0 g 換算，分別為成人臨床等效劑量的0.5、1、2倍），每組10只。除空白組外，其余各組大鼠均參考文獻[10]采用CCl4灌胃法進行造模：每周二和周五的上午8：00按2 mL/kg的劑量灌胃50%CCl4溶液，連續8周。造模的同時，藍盆花醇提物各劑量組大鼠灌胃相應藥液[以0.5%羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液為溶劑]，空白組和模型組大鼠灌胃等體積0.5%CMC-Na溶液，每天下午4：00給藥1次，連續8周。

2.3.2 樣本取材及處理

末次給藥結束后，禁食不禁水12 h，麻醉并解剖大鼠，取出肝臟，并用生理鹽水進行肝臟灌流，觀察肝臟形態特征。將部分肝組織放入4%多聚甲醛中固定48 h，剩余肝組織則放入凍存管中于－80 ℃冰箱中保存。

2.3.3 大鼠肝組織病理形態學觀察

（1）HE染色檢測。取“2.3.2”項下經4%多聚甲醛固定的肝組織樣本，常規制備石蠟切片（厚度為4 μm）后，行常規HE染色，然后在顯微鏡下觀察肝組織病理形態。

（2）Masson 染色檢測。取“2.3.2”項下經4%多聚甲醛固定的肝組織樣本，常規脫蠟后，按照Masson染色試劑盒說明書操作進行染色，每組選取3個不同的視野，在顯微鏡下進行觀察。細胞質、肌纖維及紅細胞染色后呈紅色，膠原染色后呈藍色。使用Image J 軟件對Masson染色陽性區域的膠原面積進行分析，并計算膠原百分比[膠原百分比＝膠原陽性區域面積/總面積×100%]。

2.3.4 大鼠肝組織中HF指標及PI3K/Akt信號通路相關mRNA表達的檢測

采用RT-PCR 法檢測。取“2.3.2”項下凍存的肝組織，常規解凍后，用Trizol法提取肝組織中總RNA，測定其濃度和純度后，將RNA 逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系如下：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40個循環。以β-actin為內參，采用2－△△Ct法分析目的基因mRNA表達水平。實驗重復3次。PCR引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，詳細信息見表1。

表1 PCR引物序列及擴增產物長度

2.3.5 大鼠肝組織中HF指標及PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的檢測

采用Western blot 法進行檢測。取“2.3.2”項下凍存的肝組織，加入RIPA 裂解液提取組織中總蛋白，加入5×蛋白上樣緩沖液后在金屬浴100 ℃下煮沸10 min。取變性后蛋白進行SDS-PAGE 電泳（分離膠恒壓80 V、電泳時間30 min，濃縮膠恒壓120 V、電泳時間90 min），然后在恒流200 mA的條件下濕轉至0.45 μm NC膜（轉膜時間根據蛋白分子量大小而定，每1 kDa 約轉膜1 min），加入5%脫脂奶粉在室溫下封閉4 h；加入GAPDH（稀釋比例為1∶10 000）和α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt、PTEN一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；TBST清洗3次，加入二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育1 h。再次用TBST清洗3次后顯影條帶，用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.4 體外細胞實驗

2.4.1 藍盆花醇提物含藥血清對細胞中miRNA-21表達的影響

用含10%胎牛血清的高糖培養基將HSC-T6細胞常規培養至對數生長期。將對數生長期細胞接種至6孔板中（每孔5×104～1×105個細胞），實驗設置對照組和藍盆花醇提物含藥血清低、中、高濃度組（將大鼠含藥血清稀釋至10%、15%、20%，濃度根據本課題組前期預實驗結果設置），每組設置3 個復孔。常規培養細胞至貼壁后，給予空白血清/含藥血清干預24 h。采用Trizol 法提取各組細胞的總RNA，以U6為內參，采用RT-PCR 法檢測miRNA-21 的表達水平，具體檢查條件同“2.3.4”項。其中，內參U6的引物序列為5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′，擴增產物長度為23 bp；miRNA-21的引物序列為5′-TGTGGTAGCTTATCAGACTGATGTTG-3′，擴增產物長度為26 bp。實驗重復3次。

2.4.2 轉染miRNA-21 模擬物/抑制劑對細胞中PI3K/Akt信號通路相關mRNA及其蛋白表達的影響

取對數生長期HSC-T6 細胞，接種至24 孔板中（每孔1×105～5×05個細胞），實驗設置miRNA-21 模擬物組、miRNA-21 模擬物NC 組、miRNA-21 抑制劑組和miRNA-21抑制劑NC組，每組設置5個復孔。各組的轉染方法如下：當各組細胞在常規培養后密度為30%～50%時，分別加入miRNA-21 模擬物（50 nmol/L）、miRNA-21模擬物NC（50 nmol/L）、miRNA-21抑制劑（100 nmol/L）、miRNA-21 抑制劑NC（100 nmol/L）混合液，繼續培養48 h。分別按照“2.3.4”“2.3.5”項下方法提取和測定各組細胞中PI3K/Akt信號通路相關mRNA及其蛋白的表達水平。

2.5 統計學方法

采用Graphpad Prism 8軟件進行數據統計分析及作圖。滿足正態分布和方差同質性檢驗的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 體內動物實驗結果

3.1.1 大鼠肝組織病理變化觀察結果

HE 染色結果顯示，空白組大鼠肝組織中肝細胞核大而圓，肝細胞排列均勻，無脂肪變性和纖維組織增生。模型組大鼠肝組織中實質細胞減少，ECM過度沉積，肝細胞排列不規則，有大量的炎癥細胞浸潤。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中纖維組織增生、炎癥細胞浸潤及纖維化程度均得到一定改善。結果見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織的HE染色顯微圖

Masson染色結果顯示，空白組僅有少量膠原出現在匯管區；而模型組大鼠肝組織有大量膠原纖維沉積，且出現較多纖維間隔；各給藥組大鼠肝組織中膠原纖維明顯減少，纖維間隔變窄，詳見圖2。統計分析結果顯示，與空白組[（23.60±0.03）%]比較，模型組大鼠肝組織中膠原百分比[（42.80±0.01）%]顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，藍盆花醇提物低、中、高劑量組大鼠肝組織中膠原百分比[分別為（34.90±0.06）%、（32.30±0.04）%、（28.50±0.02）%]均顯著降低（P＜0.01）。

3.1.2 大鼠肝組織中HF指標及PI3K/Akt信號通路相關mRNA表達的測定結果

與空白組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K和Akt的mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01），PTEN 的mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt 的mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.01），PTEN 的mRNA 表達水平均顯著升高（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠肝組織中HF指標及PI3K/Akt信號通路相關mRNA的表達水平比較（±s，n＝10）

表2 各組大鼠肝組織中HF指標及PI3K/Akt信號通路相關mRNA的表達水平比較（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別空白組模型組藍盆花醇提物低劑量組藍盆花醇提物中劑量組藍盆花醇提物高劑量組PTEN 1.00±0.00 0.39±0.02a 1.76±0.16b 1.64±0.32b 1.76±0.30b α-SMA 1.00±0.00 2.82±0.27a 1.08±0.44b 1.42±0.26b 1.03±0.08b Collagen Ⅰ1.00±0.00 2.92±0.22a 1.18±0.12b 1.60±0.37b 1.20±0.23b PI3K 1.00±0.00 1.82±0.33a 0.86±0.10b 1.13±0.18b 1.05±0.18b Akt 1.00±0.00 2.18±0.32a 1.18±0.24b 1.22±0.13b 1.14±0.17b

3.1.3 大鼠肝組織中HF指標及PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的測定結果

與空白組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.01），PTEN 蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.01），PTEN蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.01）。結果見圖3、表3。

表3 各組大鼠肝組織中HF指標及PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達水平比較（±s，n＝10）

表3 各組大鼠肝組織中HF指標及PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達水平比較（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別空白組模型組藍盆花醇提物低劑量組藍盆花醇提物中劑量組藍盆花醇提物高劑量組PTEN/GAPDH 0.06±0.01 0.02±0.01a 0.19±0.01b 0.17±0.02b 0.20±0.05b α-SMA/GAPDH 0.49±0.07 0.66±0.05a 0.43±0.12b 0.26±0.05b 0.23±0.04b Collagen Ⅰ/GAPDH 0.19±0.02 0.40±0.02a 0.22±0.06b 0.20±0.05b 0.23±0.01b PI3K/GAPDH 0.33±0.05 0.69±0.04a 0.50±0.04b 0.42±0.05b 0.42±0.04b Akt/GAPDH 0.67±0.06 1.29±0.05a 1.03±0.06b 0.93±0.02b 0.92±0.07b

3.2 體外細胞實驗結果

3.2.1 藍盆花醇提物含藥血清對HSC-T6 細胞中miRNA-21表達的影響

與對照組比較，藍盆花醇提物含藥血清低、中、高濃度組細胞中miRNA-21表達水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖4。

圖4 藍盆花醇提物含藥血清干預后細胞中miRNA-21表達水平測定結果（±s，n＝3）

3.2.2 轉染miRNA-21模擬物/抑制劑后對細胞中PI3K、Akt、PTEN mRNA及其蛋白表達的影響

與miRNA-21模擬物NC組比較，miRNA-21模擬物組細胞中PI3K、Akt的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），PTEN的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與miRNA-21抑制劑NC組比較，miRNA-21抑制劑組細胞中PI3K、Akt的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），PTEN的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）。結果見表4、圖5。

圖5 轉染miRNA-21 模擬物/抑制劑后細胞中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的電泳圖

表4 轉染miRNA-21 模擬物/抑制劑后細胞中PI3K/Akt 信號通路相關mRNA 和蛋白表達水平比較（±s，n＝5）

表4 轉染miRNA-21 模擬物/抑制劑后細胞中PI3K/Akt 信號通路相關mRNA 和蛋白表達水平比較（±s，n＝5）

a：與對應的NC組比較，P＜0.01。

組別miRNA-21模擬物NC組miRNA-21模擬物組miRNA-21抑制劑NC組miRNA-21抑制劑組PI3K mRNA 0.51±0.46 0.80±0.01a 0.54±0.03 0.40±0.01a蛋白0.10±0.01 0.02±0.05a 0.10±0.01 0.41±0.02a蛋白0.99±0.00 2.16±0.12a 1.00±0.03 0.84±0.02a Akt mRNA 0.31±0.03 1.69±0.15a 0.29±0.02 0.07±0.06a蛋白0.61±0.02 0.84±0.06a 0.51±0.06 0.49±0.05a PTEN mRNA 0.34±0.03 0.17±0.01a 0.43±0.05 0.53±0.02a

4 討論

HF 作為肝臟損傷及修復時發生的病理過程，如不及時干預治療，則有逐漸演變為肝硬化、肝癌等的危險。傳統醫藥在肝病治療方面積累了很多好的經驗，本課題組基于前期研究結果，通過體內外實驗驗證蒙藥藍盆花醇提物抗HF的作用機制。

PI3K/Akt 信號通路中的一系列磷酸化過程可以激活轉錄因子，而這些轉錄因子參與并改變了重要的細胞過程，如分化、增殖、凋亡等[11]。PTEN 作為PI3K/Akt 信號通路的負性調控因子，可以抑制PI3K/Akt信號通路的激活，進而抑制細胞增殖和腫瘤進展[12]。有文獻報道，PI3K/Akt 信號通路可以有效地調節HF 的進展，如促進ECM 重塑、肌成纖維細胞轉化和膠原表達[13]。miRNA作為一種短鏈非編碼RNA，被證實可以參與HF 的發生和演變過程。PTEN 的mRNA 是miRNA-21 的靶標之一，miRNA-21 可以抑制PTEN 蛋白的表達，從而調控PI3K/Akt通路[14]。在HF動物模型中，miRNA-21在血清和肝臟中的表達均明顯上調[15]。且研究發現，轉染miRNA-21 模擬物促進了HSC-T6 細胞的增殖，而轉染miRNA-21 抑制物抑制了HSC-T6 細胞的增殖[16]。上述研究表明，調控miRNA-21 的表達能影響HSC-T6 細胞的活化與增殖。

在體內實驗中，筆者發現藍盆花醇提物能明顯改善模型大鼠肝組織中炎癥細胞浸潤，減少模型大鼠纖維化增生。此外，筆者還觀察到，經藍盆花醇提物灌胃后模型大鼠肝組織中HF指標（α-SMA、Collagen Ⅰ）及PI3K/Akt 信號通路相關指標（PI3K、Akt）的mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低，這提示藍盆花醇提物改善HF 的作用機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路有關。同時，體外實驗也發現，HSC-T6 細胞經藍盆花醇提物含藥血清干預后，細胞中miRNA-21表達下調。抑制miRNA-21后，PI3K/Akt 信號通路中PTEN 的mRNA 和蛋白表達上調，PI3K、Akt的mRNA和蛋白表達下調；而過表達miRNA-21后，上述指標變化相反。

綜上所述，蒙藥藍盆花醇提物通過抑制miRNA-21表達、上調PTEN 表達，進而抑制PI3K/Akt 信號通路活性，最終發揮抗HF 的作用。筆者在本研究中還發現藍盆花醇提物中黃酮含量較高，但由于時間所限，未對藍盆花醇提物中的化合物進行定性研究，具體是提取物中的何種化合物、通過何種途徑發揮抗HF的作用，有待進一步深入研究。