小檗堿誘導骨肉瘤細胞鐵死亡的作用及機制 Δ

姬健鈞，邱文奎 （開封市中心醫(yī)院骨科二病區(qū)，河南 開封 475000）

骨肉瘤具有局部侵襲、快速浸潤轉移和組織特異性等特性，是青少年和兒童中最為常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，給患者生命健康和生活質量帶來了嚴重威脅。目前，臨床上針對骨肉瘤的治療方式仍以常規(guī)的手術切除、放療和化療為主，但骨肉瘤患者易耐受并且其5年總體生存率較低[1]。因此，亟須尋找高效的輔助藥物或者替代療法。

小檗堿是從中藥黃連以及其他小檗屬植物里面分離出來的異喹啉類生物堿，能夠用于多種疾病的治療，如代謝、消化、神經(jīng)和心血管系統(tǒng)疾病以及腫瘤[2—3]。有研究指出，小檗堿能夠通過誘導骨肉瘤細胞的凋亡、自噬來抑制其增殖[4—5]。鐵死亡（ferroptosis）是一種新的調節(jié)性細胞死亡方式，其特征是鐵離子依賴的脂質過氧化物大量蓄積，與骨肉瘤細胞生長、耐藥等密切相關[6]。本課題組前期預實驗發(fā)現(xiàn)，小檗堿可抑制骨肉瘤細胞的增殖，但采用凋亡或自噬抑制劑并不能有效緩解小檗堿誘導的骨肉瘤細胞死亡，這提示可能存在其他的細胞死亡方式?；诖耍狙芯恳匀斯侨饬黾毎鸐G63為研究對象，初步探討鐵死亡在小檗堿抑制MG63細胞中的作用及其可能機制，以期為臨床上骨肉瘤的防治提供新的思路和治療靶點。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：Nanodrop 2000 型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司），Spectra Max iD型酶標儀（美國Molecular Devices公司），DM2500 型熒光倒置顯微鏡（德國Leica 公司），JEM-1400型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司），5200型化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），1658003-Mini-Protean?Tetra 小型垂直電泳裝置、1703930-Mini Trans-Blot?型電泳槽（美國Bio-Rad 公司），5452 型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 主要藥品與試劑

小檗堿對照品（批號BWB50137，純度≥98%）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基均購自美國Gibco 公司；兔源信號轉導及轉錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、腫瘤蛋白53（tumor protein 53，p53）、磷酸化STAT3（phosphated STAT3，p-STAT3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（貨號分別為bs-20382R、bsm-33058、bs-1658R、bs-41373R、bs-80295G）均購自北京博奧森生物技術有限公司；轉染試劑lipofectamine 2000（批號11668500）購自美國Invitrogen公司；過表達質粒pEGFP-N1和pEGFP-N1-STAT3（批號分別為172281、111934）均購自美國Addgene 公司；CCK-8試劑盒和細胞核增殖相關抗原Ki-67（nuclear proliferation associated-antigen Ki-67，Ki67）一抗（批號分別為G4103、GB111499）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Fe2+檢測熒光探針FerroOrange（批號F374）購自日本同仁化學研究所；活性氧（reactive oxygen species，ROS）探針H2DCFDA（批號HY-D0940）購自美國MCE公司；免疫染色通透液、免疫染色封閉液、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、細胞核蛋白提取試劑盒、電泳遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）試劑盒、生物素標記EMSA 探針、Alexa Fluor 647 標記的山羊抗兔熒光二抗、四甲基羅丹明乙酯（TMRE）線粒體膜電位檢測試劑盒（批號分別為P0096、P0102、S0131M、S0052、P0011、P0027、GS002、GS083B、A0468、C2001S）均購自上海碧云天生物技術有限公司；p53 小干擾RNA（siRNA）和陰性對照siRNA（negative control siRNA，NC siRNA）套裝（批號A10001）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；兔源溶質載體家族7 成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）一抗（批號D2M7A）購自美國Cell Signa- ling Technology公司。

1.3 細胞株

本研究所用人骨肉瘤細胞MG63 購自中國科學院上海細胞庫。將MG63 細胞接種于含1%青-鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞傳至第5 代后用于后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 小檗堿對MG63 細胞鐵死亡和STAT3/p53/SLC7A11信號通路的影響

2.1.1 細胞分組及處理

參考預實驗結果，將細胞分為對照組和不同濃度（2.5、5.0、10.0 μmol/L）小檗堿處理組。除對照組不作干預外，其余各組MG63細胞分別加入含上述藥物的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后進行以下檢測。

2.1.2 MG63細胞存活率的檢測

將細胞按照5×103個/孔的密度接種于96 孔板中，按“2.1.1”項下方法進行分組（每組設6 個復孔）、給藥和培養(yǎng)。處理結束后，每孔中加入CCK-8工作液10 μL，隨后繼續(xù)培養(yǎng)30 min。以不加細胞和藥物的空白培養(yǎng)基為空白組，采用酶標儀在450 nm波長條件下測定各孔細胞的吸光度（A），并計算細胞存活率：細胞存活率（%）＝（A實驗組－A空白組）/（A對照組－A空白組）×100%。

2.1.3 MG63細胞中Ki67蛋白表達水平的檢測

將細胞按照1×105個/孔的密度接種于12 孔板中，按照“2.1.1”項下方法進行分組（每組設3 個復孔）、給藥和培養(yǎng)，然后用4%多聚甲醛固定細胞20 min；以免疫染色通透液透化10 min后，加入免疫染色封閉液封閉1 h；加入Ki67 一抗（稀釋比例為1∶200），4 °C 孵育過夜；加入Alexa Fluor 647 標記的山羊抗兔熒光二抗（稀釋比例為1∶200），室溫下避光孵育2 h；DAPI 染核10 min 后用熒光倒置顯微鏡進行拍照觀察，采用Image J 軟件計算其相對熒光強度來表示蛋白表達水平。

2.1.4 MG63細胞中線粒體超微結構觀察

將細胞按照1×105個/孔的密度接種于12 孔板中，按照“2.1.1”項下方法進行分組（每組設3 個復孔）、給藥與處理。處理結束后，用2.5%戊二醛在4 °C 下固定過夜，之后加入1%鋨酸，放置2 h 后用乙醇和丙酮進行脫水；待包埋固化后進行切片（切片厚度50 nm），用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛進行雙染色，最后用透射電鏡觀察線粒體超微結構變化。

2.1.5 MG63細胞內(nèi)Fe2+水平的檢測

將細胞按照1×105個/孔的密度接種于12 孔板中，按照“2.1.1”項下方法進行分組（每組設3 個復孔）、給藥與處理。處理結束后，用無血清的細胞培養(yǎng)基將細胞洗滌3次，加入1 μmol/L的FerroOrange熒光探針工作溶液避光孵育30 min，之后用DAPI染核5 min。采用熒光倒置顯微鏡進行拍照，采用Image J 軟件測定熒光強度來表示Fe2+水平。

2.1.6 MG63細胞內(nèi)ROS水平的檢測

將細胞按照1×105個/孔的密度接種于12 孔板中，按照“2.1.1”項下方法進行分組（每組設3 個復孔）、給藥與處理。處理結束后加入用無血清培養(yǎng)基稀釋的H2DCFDA 探針（10 μmol/L），繼續(xù)孵育30 min。DAPI染核后用熒光顯微鏡拍照，采用Image J 軟件測定ROS的平均熒光強度來表示ROS水平。

2.1.7 MG63細胞內(nèi)MDA含量和GSH水平的檢測

將細胞按照2.5×105個/孔的密度接種于6 孔板中，按照“2.1.1”項下方法進行分組（每組設3 個復孔）、給藥與處理。處理結束后，收集細胞，嚴格按照檢測試劑盒說明書方法操作，使用酶標儀分別在530、410 nm波長條件下測定A，計算MDA含量和GSH水平。

2.1.8 MG63細胞內(nèi)STAT3與DNA結合活性的檢測

采用EMSA試劑盒進行檢測。將細胞按照2.5×105個/孔的密度接種于6孔板中，按照“2.1.1”項下方法進行分組（每組設3個復孔）、給藥與處理。按照試劑盒說明書方法提取細胞核蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度。按照EMSA試劑盒說明書要求配制反應體系，加入生物素標記的STAT3探針，室溫靜置25 min。進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，最后與鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶（streptavidin-HRP）反應后經(jīng)化學發(fā)光法進行成像，采用Image J軟件檢測STAT3與DNA的結合活性。

2.1.9 MG63 細胞內(nèi)p-STAT3、p53 和SLC7A11 蛋白表達水平的檢測

采用Western blot 法進行檢測。將細胞按照2.5×105個/孔的密度接種于6 孔板中，按照“2.1.1”項下方法進行分組（每組設3個復孔）、給藥與處理。處理結束后，收集細胞并充分裂解，提取細胞中總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（起始電壓80 V，待樣品基本平齊后將電壓轉為120 V，待溴酚藍到達分離膠底部時終止電泳），轉膜（恒流250 mA，轉膜時間2 h），封閉（5%脫脂奶粉）；加入p-STAT3、p53、SLC7A11、GAPDH一抗（除GAPDH一抗的稀釋比例為1∶4 000 外其余一抗的稀釋比例均為1∶1 000），4 °C 孵育過夜；漂洗結束后，加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育1 h。采用化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)成像后，采用Image J軟件進行灰度分析，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白GAPDH條帶的灰度值比值計算目的蛋白的表達水平。

2.2 p53在小檗堿誘導MG63細胞鐵死亡中的作用

2.2.1 p53 siRNA轉染與細胞分組

將細胞按照2×105個/孔的密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到60%左右進行轉染。按轉染試劑說明書配制p53 siRNA 和NC siRNA 的轉染體系，分別轉染細胞6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將細胞分為對照組（細胞經(jīng)NC siRNA 處理）、p53 siRNA 組（細胞經(jīng)p53 siRNA 處理）、小檗堿組（細胞經(jīng)NC siRNA 處理后再用10 μmol/L 的小檗堿處理）、p53 siRNA+小檗堿組（細胞經(jīng)p53 siRNA處理后再用10 μmol/L的小檗堿處理），每組設3個復孔，加入空白培養(yǎng)基/含藥培養(yǎng)基孵育24 h。

2.2.2 p53 siRNA對細胞中p53和SLC7A11蛋白表達的影響

取細胞按照“2.2.1”項下方法進行接種、分組與處理。培養(yǎng)結束后，按“2.1.9”項下方法檢測細胞中p53 和SLC7A11 蛋白表達水平。p53、SLC7A11 和GAPDH 一抗的稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000 和1∶4 000。以p53、SLC7A11 與內(nèi)參蛋白GAPDH 條帶的灰度值比值表示p53、SLC7A11蛋白的表達水平。

2.2.3 p53 siRNA對細胞線粒體膜電位的影響

取細胞按照“2.2.1”項下方法進行接種、分組與處理。培養(yǎng)結束后，加入TMRE 染色工作液，放置在培養(yǎng)箱中孵育30 min；采用熒光顯微鏡觀察，采用Image J軟件分析線粒體膜電位變化。

2.2.4 p53 siRNA 對細胞中MDA 含量和GSH 水平的影響

取細胞按照“2.2.1”項下方法進行接種、分組與處理。培養(yǎng)結束后，按“2.1.7”項下方法檢測細胞中MDA含量與GSH水平。

2.3 過表達STAT3 對經(jīng)小檗堿處理的MG63 細胞中p53/SLC7A11信號通路的影響

2.3.1 STAT3過表達質粒的轉染與細胞分組

將MG63 細胞按照2×105個/孔的密度接種于6 孔板中，待細胞密度達到70%時，向每孔中加入800 μL完全培養(yǎng)基（不含抗生素），待轉染。用超微量分光光度計檢測質粒濃度。取pEGFP-N1和pEGFP-N1-STAT3質粒各4 μg，按照轉染試劑說明書方法進行細胞轉染。將細胞分為對照組（轉染pEGFP-N1 質粒）、小檗堿組（轉染pEGFP-N1 質粒后再用10 μmol/L 小檗堿處理）、STAT3組（轉染pEGFP-N1-STAT3 質粒）、STAT3+小檗堿組（轉染pEGFP-N1-STAT3 質粒后再用10 μmol/L 小檗堿處理），每組設3個復孔，加入空白培養(yǎng)基/含藥培養(yǎng)基孵育24 h后進行以下檢測。

2.3.2 過表達STAT3 對細胞中p-STAT3、STAT3、p53 和SLC7A11蛋白表達的影響

按照“2.3.1”項下方法進行細胞接種、分組與處理。培養(yǎng)結束后，按照“2.1.9”項下方法檢測細胞中p-STAT3、STAT3、p53 和SLC7A11 蛋白表達水平。p-STAT3、STAT3、p53 和SLC7A11 一抗的稀釋比例均為1∶1 000，GAPDH 一抗的稀釋比例為1∶4 000。以各目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.01 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 小檗堿對MG63 細胞鐵死亡和STAT3/p53/SLC7A11信號通路的影響結果

3.1.1 小檗堿對MG63細胞存活率的影響

與對照組[（100.00±1.75）%，n＝6]比較，2.5、5.0、10.0 μmol/L 小檗堿處理組細胞24 h 的存活率[分別為（81.62±1.94）%、（68.58±1.62）%、（56.96±1.80）%，n＝6]均顯著降低（P＜0.01）。

3.1.2 小檗堿對細胞中Ki67蛋白表達水平的影響

與對照組[（100.00±2.09）%，n＝3]比較，2.5、5.0、10.0 μmol/L 小檗堿處理組細胞中Ki67 蛋白表達水平[相對熒光強度分別為（71.36±2.23）%、（45.58±1.75）%、（34.92±1.44）%，n＝3]均顯著降低（P＜0.01），且Ki67 蛋白的表達水平有隨著藥物濃度增加而逐漸降低的趨勢。結果見圖1。

圖1 小檗堿對MG63細胞內(nèi)Ki67蛋白表達影響的熒光染色圖

3.1.3 小檗堿對MG63細胞線粒體超微結構的影響

經(jīng)不同濃度的小檗堿處理后，MG63 細胞線粒體體積逐漸變小，線粒體膜破裂，線粒體嵴減少或消失。結果見圖2。

圖2 小檗堿對MG63細胞線粒體超微結構影響的透射電鏡圖

3.1.4 小檗堿對MG63細胞內(nèi)Fe2+水平的影響

與對照組比較，小檗堿各濃度處理組細胞內(nèi)Fe2+水平均顯著升高（P＜0.01），且有隨著藥物濃度增加而逐漸升高的趨勢。結果見圖3、表1。

表1 各組細胞內(nèi)Fe2+和ROS 水平的檢測結果（±s，n＝3）

表1 各組細胞內(nèi)Fe2+和ROS 水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01。

分組對照組2.5 μmol/L小檗堿處理組5.0 μmol/L小檗堿處理組10.0 μmol/L小檗堿處理組Fe2+熒光強度9.58±1.04 16.13±1.76a 30.74±2.91a 43.26±3.15a ROS熒光強度7.36±1.19 13.54±1.35a 22.41±2.07a 29.87±2.42a

圖3 小檗堿對MG63細胞內(nèi)Fe2+水平影響的熒光顯微圖

3.1.5 小檗堿對MG63細胞內(nèi)ROS水平的影響

與對照組比較，小檗堿各濃度處理組細胞內(nèi)ROS水平均顯著升高（P＜0.01），且有隨著藥物濃度增加而逐漸升高的趨勢。結果見表1、圖4。

圖4 小檗堿對MG63 細胞內(nèi)ROS 水平影響的熒光顯微圖

3.1.6 小檗堿對MG63細胞內(nèi)MDA含量和GSH水平的影響

與對照組比較，小檗堿各濃度處理組細胞內(nèi)MDA含量均顯著升高（P＜0.01），GSH 水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組細胞內(nèi)MDA 含量和GSH 水平的檢測結果（±s，n＝3）

表2 各組細胞內(nèi)MDA 含量和GSH 水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01。

分組對照組2.5 μmol/L小檗堿處理組5.0 μmol/L小檗堿處理組10.0 μmol/L小檗堿處理組GSH/%100.00±1.86 81.35±2.52a 46.17±3.04a 34.63±2.39a MDA/（μmol/mg）1.24±0.11 2.09±0.16a 3.53±0.23a 4.62±0.36a

3.1.7 小檗堿對MG63 細胞內(nèi)STAT3 與DNA 結合活性的影響

與對照組（1.00±0.08，n＝3）比較，2.5、5.0、10.0 μmol/L小檗堿處理組細胞中STAT3與DNA的結合活性（分別為0.71±0.05、0.28±0.02、0.13±0.01，n＝3）均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖5。

圖5 各組細胞內(nèi)STAT3與DNA結合活性的檢測結果

3.1.8 小檗堿對MG63細胞內(nèi)p-STAT3、p53和SLC7A11蛋白表達水平的影響

與對照組比較，小檗堿各濃度處理組細胞內(nèi)p-STAT3 和SLC7A11 蛋白表達水平均顯著降低，p53 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且具有一定的濃度依賴性趨勢。結果見圖6和表3。

表3 各組細胞內(nèi)p-STAT3、p53 和SLC7A11 蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

表3 各組細胞內(nèi)p-STAT3、p53 和SLC7A11 蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與對照組比較，P＜0.01。

分組對照組2.5 μmol/L小檗堿處理組5.0 μmol/L小檗堿處理組10.0 μmol/L小檗堿處理組SLC7A11/GAPDH 0.71±0.05 0.60±0.06a 0.36±0.03b 0.28±0.03b p-STAT3/GAPDH 0.32±0.01 0.27±0.02a 0.15±0.01b 0.11±0.01b p53/GAPDH 0.39±0.02 0.54±0.04b 0.82±0.05b 1.10±0.08b

圖6 各組細胞內(nèi)p-STAT3、p53 和SLC7A11 蛋白表達的電泳圖

3.2 p53 在小檗堿誘導MG63 細胞鐵死亡中的作用考察結果

3.2.1 p53 siRNA 對各組MG63 細胞內(nèi)p53 和SLC7A11蛋白表達的影響

與對照組比較，小檗堿組細胞內(nèi)p53 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），SLC7A11 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。與小檗堿組比較，p53 siRNA+小檗堿組細胞中p53 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），SLC7A11 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。結果見圖7和表4。

表4 各組細胞內(nèi)p53 和SLC7A11 蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

表4 各組細胞內(nèi)p53 和SLC7A11 蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與小檗堿組比較，P＜0.01。

分組對照組p53 siRNA組小檗堿組p53 siRNA+小檗堿組p53/GAPDH 0.27±0.03 0.05±0.01 0.84±0.06a 0.12±0.02b SLC7A11/GAPDH 1.19±0.11 1.13±0.08 0.35±0.03a 0.80±0.07 b

圖7 各組細胞內(nèi)p53和SLC7A11蛋白表達的電泳圖

3.2.2 p53 siRNA對MG63細胞線粒體膜電位的影響

與對照組比較，小檗堿組細胞線粒體膜電位顯著降低（P＜0.01）；與小檗堿組比較，p53 siRNA+小檗堿組細胞線粒體膜電位顯著升高（P＜0.01）。結果見圖8和表5。

表5 各組細胞的線粒體膜電位和細胞內(nèi)GSH 水平、MDA含量測定結果（±s，n＝3）

表5 各組細胞的線粒體膜電位和細胞內(nèi)GSH 水平、MDA含量測定結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與小檗堿組比較，P＜0.01。

分組對照組p53 siRNA組小檗堿組p53 siRNA+小檗堿組MDA/（μmol/mg）1.37±0.12 1.40±0.16 3.75±0.34a 2.53±0.22b線粒體膜電位1.00±0.07 0.98±0.05 0.29±0.02a 0.71±0.05b GSH/%100.00±2.36 98.45±1.93 45.67±1.74a 74.02±2.59b

圖8 各組細胞線粒體膜電位的熒光顯微圖

3.2.3 p53 siRNA 對MG63 細胞內(nèi)GSH 水平和MDA 含量的影響

與對照組比較，小檗堿組細胞內(nèi)GSH水平顯著降低（P＜0.01），MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與小檗堿組比較，p53 siRNA+小檗堿組細胞內(nèi)GSH 水平顯著升高（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.01）。結果見表5。

3.3 過表達STAT3 對MG63 細胞內(nèi)p-STAT3、STAT3、p53和SLC7A11蛋白表達水平的影響結果

與對照組比較，小檗堿組細胞內(nèi)p-STAT3、STAT3和SLC7A11蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），p53蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與小檗堿組比較，STAT3+小檗堿組細胞內(nèi)p-STAT3、STAT3和SLC7A11蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），p53蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。結果見圖9、表6。

表6 各組細胞內(nèi)p-STAT3、STAT3、p53、SLC7A11蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

表6 各組細胞內(nèi)p-STAT3、STAT3、p53、SLC7A11蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與小檗堿組比較，P＜0.01。

分組對照組小檗堿組STAT3組STAT3+小檗堿組SLC7A11/GAPDH 1.07±0.10 0.36±0.05a 1.09±0.12 0.73±0.06b p-STAT3/GAPDH 0.41±0.05 0.04±0.01a 0.57±0.06 0.30±0.04b STAT3/GAPDH 0.38±0.04 0.17±0.02a 0.82±0.07 0.65±0.07b p53/GAPDH 0.35±0.04 0.89±0.09a 0.33±0.03 0.51±0.04b

圖9 各組細胞內(nèi)STAT3/p53/SLC7A11 信號通路相關蛋白表達的電泳圖

4 討論

近年來，小檗堿因其低毒與抗腫瘤特性受到了廣泛關注，其對多種惡性腫瘤細胞均具有良好的抑制作用。本研究結果表明，小檗堿能夠降低MG63骨肉瘤細胞的存活率。Ki67是一種與細胞增殖相關的蛋白，僅在處于分裂期的細胞核內(nèi)表達，是評價腫瘤細胞增殖活性、侵襲能力的重要指標。有研究指出，Ki67表達水平的升高與骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展呈正相關[7]。本研究結果顯示，小檗堿處理后細胞中Ki67蛋白表達下調，這也進一步證實了小檗堿能抑制骨肉瘤細胞的增殖。

相關研究已證實，鐵死亡在骨肉瘤的治療、預后以及降低耐藥性等方面發(fā)揮著重要作用[8]。細胞內(nèi)Fe2+過載是細胞鐵死亡的重要標志，ROS 和脂質過氧化物MDA的蓄積以及GSH的過度消耗則是細胞鐵死亡的必要條件[9]。在本研究中，小檗堿處理MG63細胞后，細胞內(nèi)Fe2+、ROS 水平和MDA 含量均升高，而GSH 水平降低。此外，透射電鏡結果顯示，小檗堿處理后出現(xiàn)了細胞線粒體體積變小、膜密度增加、線粒體嵴減少甚至消失等鐵死亡特征。這些結果表明，小檗堿能夠誘導MG63細胞鐵死亡。

SLC7A11可以將細胞外胱氨酸轉運至細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)部將胱氨酸還原為半胱氨酸，進而參與細胞內(nèi)重要抗氧化物GSH的合成。GSH在抑制細胞中脂質過氧化物累積方面有著重要作用，可防止細胞中鐵死亡程序的啟動[10]。p53 作為一種腫瘤抑制蛋白，越來越多的證據(jù)指出，p53可通過抑制SLC7A11蛋白的表達來誘導多種腫瘤細胞鐵死亡[11]。本研究結果顯示，小檗堿處理后MG63 細胞內(nèi)p53 蛋白表達水平升高，而SLC7A11 蛋白表達水平降低；抑制p53 的表達能夠提高小檗堿處理組細胞內(nèi)SLC7A11 蛋白表達水平，改善GSH、MDA 和線粒體膜電位等鐵死亡特異性指標。這些結果表明，小檗堿誘導MG63 細胞鐵死亡的作用可能與調節(jié)p53/SLC7A11信號通路有關。

STAT3的磷酸化在STAT3信號活化中起關鍵作用，p-STAT3 蛋白表達水平也與細胞鐵死亡有著密切關系[12]。研究指出，p53 作為鐵死亡的重要調節(jié)因子，STAT3 對于p53 的表達具有負調控作用。磷酸化后的STAT3 能夠轉位至細胞核，通過與p53 的啟動子區(qū)域結合來抑制p53 的表達[13]。有文獻報道，STAT3 信號失活引起的p53表達水平上調參與了糖饑餓誘導的腎腫瘤細胞鐵死亡[14]。骨肉瘤細胞中過度活化的STAT3 信號與骨肉瘤細胞增殖和耐藥性的產(chǎn)生密切相關[15]。這提示STAT3 可能是骨肉瘤治療的一個重要潛在靶標。本研究結果表明，小檗堿處理后，MG63 細胞中p-STAT3、STAT3 表達水平均降低，表明小檗堿抑制了MG63 細胞中STAT3 的活化；而過表達STAT3 則減弱了小檗堿對MG63 細胞p53/SLC7A11 信號通路的影響。這些研究結果表明，小檗堿可通過抑制STAT3 活化對p53/SLC7A11信號通路起調控作用。但需要注意的是，活化的STAT3能夠下調促凋亡因子，同時促進抗凋亡蛋白的表達，來達到抑制腫瘤細胞凋亡的目的[16]。未來還需要進一步通過不同細胞系和體內(nèi)研究，探究STAT3在小檗堿抑制骨肉瘤細胞增殖中的具體作用。

綜上所述，小檗堿可誘導MG63 骨肉瘤細胞鐵死亡，其作用機制可能是通過作用于STAT3/p53/SLC7A11信號通路實現(xiàn)的。