秫米提取物對失眠小鼠睡眠的改善作用及機制研究 Δ

王 娟 ，呂辰子 ，趙彩蓉 趙泓瑜 李子昂 韓 香 孟祥龍 張朔生 （1.山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西 晉中 00619；.山西中醫藥大學中藥炮制山西省重點實驗室，山西 晉中 00619；.東國大學韓醫學院，韓國 慶州 8066）

失眠，又稱睡眠障礙，主要表現為入睡困難或者難以維持睡眠狀態，其不僅會影響人們學習記憶的正常功能，還容易導致免疫功能紊亂，誘發并增加神經炎癥[1]。目前臨床上常用苯二氮類或非苯二氮類化學藥物治療失眠，這類藥物價格高、不良反應明顯，長期使用易產生藥物依賴性[2]。因此，開發具有療效明確和安全性高的天然草本藥物具有極大的現實意義。據報道，炎癥因子是失眠的重要發病機制之一，磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路是體內調節細胞存活、凋亡及炎癥的重要通路，其可通過調控核因子κB 亞基p65（nuclear factor-κB subunit p65，NF-κB p65）的表達，調節炎癥因子水平，實現神經保護作用，從而延緩失眠的發生[3]。

秫米為禾本科植物粱Setariaitalica（L.）Beauv.或粟Setariaitalica（L.）Beauv.var.germanica（Mill.）Schrad.的黏性種子，味甘，性微寒，入肺、胃、大腸經，具有祛風除濕、和胃安神、解毒斂瘡的功效[4]。秫米與半夏組成的半夏秫米湯被譽為治療失眠的第一方，臨床應用極為廣泛[5]。現代藥理研究表明，方中半夏水提物對小鼠有鎮靜催眠作用[6]；而秫米作為一種天然草本藥物，目前關于其鎮靜安神作用的研究鮮有報道。基于此，本研究擬以對氯苯丙氨酸（para-chlorophenylalanine，PCPA）誘導失眠小鼠模型，通過觀察小鼠行為學變化和測定生化指標，圍繞PI3K/Akt/NF-κB信號通路初步探究秫米提取物改善失眠的作用及可能機制，為秫米的進一步開發利用提供實證支持，也為中醫藥防治失眠提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用儀器主要包括HC-2518 型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），OFT-100型大小鼠開場活動實驗系統（成都泰盟科技有限公司），Synergy HTX型酶標儀（美國Bio-Tek公司），KZ-Ⅲ-F型研磨儀、SVE-2型垂直電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司），DYY-6C型電泳儀電源（北京六一生物科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

秫米（批號220508）購自山西省農業科學院高寒區作物研究所，經山西中醫藥大學中藥與食品工程學院張朔生教授鑒定為禾本科植物粱S.italica（L.）Beauv.或粟S.italica（L.） Beauv.var.germanica （Mill.） Schrad.的黏性種子。地西泮片（國藥準字H10970219，批號20220701，每片含地西泮1.25 mg）購自濟寧市安康制藥有限責任公司；對照品葡萄糖、人參皂苷Rb1、沒食子酸（批號分別為17042603、21101405、21012903，純度均≥98%）均購自成都普菲德生物技術有限公司；PCPA（批號C13957194）購自上海麥克林生化科技有限公司；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HTAA）、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-6、B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）酶聯免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號均為202210）均購自上海泛柯實業有限公司；兔源NF-κB p65、磷酸化NFκB p65（p-NF-κB p65）、PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號分別為BS1253、AP0124、BS3678、AP0854、BS1810、BS4006、AP0060）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號BA1054）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF 級雄性ICR 小鼠，共60 只，體重（20±2） g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0010，合格證號為10011230101930023。動物購入后，先在潔凈環境中適應性飼養3 d，飼養環境溫度為（23±1） ℃。飼養期間，給予普通飼料喂養，自由飲水，并保持墊料干燥、環境安靜。本研究動物實驗設計和實施方案通過了山西中醫藥大學倫理委員會審核和批準（編號為AWE202304295）。

2 方法

2.1 藥物制備

（1）秫米提取物細粉：稱取秫米50 g，加10 倍量（mL/g）蒸餾水浸泡15 min 后，加熱回流提取30 min，過濾后加8倍量蒸餾水二次提取，合并上清液并濃縮至適宜濃度，冷凍干燥后收集細粉（得率45.3%），經紫外分光光度法[7—9]測得提取物中總皂苷、總多酚、總多糖含量分別為0.31%、0.08%、4.95%。將提取物干燥保存，備用。

（2）PCPA 溶液配制：精密稱定 PCPA 1.0 g，溶于30 mL生理鹽水中，再加入20 μL 聚山梨酯80促溶，渦旋混勻后得到PCPA混懸液。

（3）地西泮混懸液的制備：取地西泮1片，研成粉末，加入12.5 mL 生理鹽水，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）15 min，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的混懸液。

2.2 動物分組、造模與給藥

小鼠適應性喂養3 d 后，按隨機數字表法分為空白組、模型組、陽性對照組（地西泮2.6 mg/kg，為成人臨床等效劑量）和秫米提取物低、中、高劑量組（給藥劑量分別為1.2、2.4、4.8 g/kg；按照《中華本草》中記載的秫米臨床劑量并根據人和小鼠間體表面積折算的等效劑量為2.4 g/kg，以此作為中劑量），每組10只。除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射350 mg/kg PCPA混懸液，每天1次，持續3 d，以建立失眠小鼠模型；造模結束后，觀察小鼠行為，當小鼠出現活動次數增加、易激惹、晝夜節律缺失、白天與夜晚活動不間斷等行為則為造模成功[10]。造模成功后，空白組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組小鼠灌胃相應藥物，灌胃體積為0.01 mL/g，每天1 次，連續7 d。每天觀察小鼠的精神活動狀態、進食量、飲水量、對外界刺激的反應及體重變化等一般情況。

2.3 曠場行為學實驗

末次給藥60 min 后進行曠場行為學測試。將小鼠放置在反應箱正中央，采用小鼠的開場活動實驗系統采集5 min 內小鼠的總運動距離、總靜止時間、總運動時間、站立次數、修飾次數等活動軌跡。實驗在安靜、光線穩定的環境中進行。每只小鼠實驗結束后，用75%乙醇擦拭方箱內壁及底面，防止留下氣味及排泄物等。

2.4 標本采集與處理

曠場行為學實驗之后，腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉小鼠，腹主動脈取血約1 mL，室溫下靜置1 h后以4 000 r/min 離心15 min，分離血清，－80 ℃保存備用。小鼠取血后處死，剝離顱骨并分離海馬，稱取海馬質量，加入9 倍體積預冷的磷酸鹽緩沖液制備組織勻漿，并在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液于－80 ℃保存備用。

2.5 小鼠血清和海馬組織中單胺類神經遞質和炎癥指標測定

取“2.4”項下血清，采用ELISA法測定血清中5-HT、BDNF、IL-2、IL-6、Bcl-2、Bax 的含量以及海馬組織中5-HT、5-HTAA 的含量，并計算Bcl-2/Bax 比值。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.6 小鼠海馬組織中PI3K/Akt/NF-κB 信號通路相關蛋白表達檢測

采用Western blot 法進行測定。取凍存的海馬組織樣本30 mg，經蛋白提取、BCA 蛋白濃度定量及煮沸5 min 變性后，上樣10 μg 蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離（濃縮膠電壓80 V、電泳時間20 min，分離膠電壓120 V、電泳時間90 min），然后轉移至硝酸纖維素（NC）膜（轉膜電流300 mA，轉膜時間120 min），以5%脫脂奶粉封閉2 h；加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗（稀釋比例均為1∶1 000）和β-actin 一抗（稀釋比例為1∶2 000），4 ℃孵育過夜；TBST清洗4次后，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育4 h；洗滌后暗室內采用ECL法檢查，通過熒光化學發光凝膠成像系統檢測目的條帶，采用Image J 軟件分析目的條帶灰度值。以目的蛋白條帶與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平，以p-NF-κB p65 與NFκB p65、p-PI3K與PI3K、p-Akt與Akt蛋白表達水平的比值分別表示NF-κB p65、PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS 24軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 秫米提取物對小鼠一般情況的影響

模型組小鼠白天活動增多，晝夜節律消失，精神亢奮，易激惹，毛發豎起且無光澤，體形消瘦；各給藥組小鼠上述一般狀態較模型組均明顯改善。

3.2 秫米提取物對小鼠曠場實驗行為學表現的影響

與空白組比較，模型組小鼠的總靜止時間、站立次數及修飾次數均顯著延長/增加（P＜0.05），總運動距離、總運動時間均顯著縮短（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和秫米提取物中、高劑量組小鼠的總運動時間均顯著延長（P＜0.01），總靜止時間均顯著縮短（P＜0.01），并且秫米提取物各劑量組小鼠的站立次數及修飾次數均顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組小鼠曠場實驗行為學實驗結果（±s，n＝10）

表1 各組小鼠曠場實驗行為學實驗結果（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

修飾次數4.80±0.84 7.20±0.84a 5.60±0.89 4.80±1.30c 4.60±0.55b 4.20±1.30b組別空白組模型組陽性對照組秫米提取物低劑量組秫米提取物中劑量組秫米提取物高劑量組總運動距離/mm 40 351.24±6 197.83 28 953.16±2 206.19a 35 827.18±2 494.41 29 372.82±1 346.61 34 533.60±2 166.02 35 607.24±4 662.43總靜止時間/s 50.52±6.88 94.24±3.88a 73.56±7.42b 85.48±9.23 75.00±6.29b 74.02±6.83b總運動時間/s 245.10±6.65 198.78±12.40a 238.46±13.14b 214.52±15.74 232.82±9.61b 238.06±9.19b站立次數43.00±4.85 53.60±4.34a 49.80±3.27 38.00±4.74c 37.60±3.21b 34.40±6.11b

3.3 秫米提取物對小鼠血清中單胺類神經遞質和炎癥指標的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中5-HT、BDNF、Bcl-2 含量和Bcl-2/Bax 比值均顯著降低（P＜0.05），IL-6、IL-2 和Bax 含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和秫米提取物高劑量組小鼠血清中上述指標水平均被顯著逆轉（P＜0.05或P＜0.01）；秫米提取物中劑量組小鼠血清中5-HT、IL-2、Bax含量均被顯著逆轉（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組小鼠血清中單胺類神經遞質和炎癥指標含量測定結果（±s，n＝10）

表2 各組小鼠血清中單胺類神經遞質和炎癥指標含量測定結果（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組秫米提取物低劑量組秫米提取物中劑量組秫米提取物高劑量組Bcl-2/Bax 28.56±5.00 14.03±2.02a 27.60±7.31b 17.39±3.24 20.82±4.99 24.51±2.47c 5-HT/（ng/mL）204.35±7.22 151.75±19.36a 196.65±13.07b 157.75±11.20 188.85±13.61c 199.35±14.69b BDNF/（pg/mL）755.06±67.38 626.99±66.47a 754.26±23.10b 675.74±39.22 693.38±31.10 727.63±32.43c IL-6/（pg/mL）99.47±10.55 119.55±7.62a 107.69±2.12c 110.75±5.29 110.20±5.91 108.64±6.97c IL-2/（pg/mL）69.94±24.83 129.60±17.56a 79.65±12.00b 101.53±7.08 84.61±3.83b 81.84±6.95b Bax/（ng/mL）4.74±0.13 6.64±0.83a 4.92±0.64b 5.65±0.46 5.26±0.86c 5.03±0.75b Bcl-2/（ng/mL）135.49±25.35 91.92±6.10a 132.09±17.10b 97.40±12.54 106.55±14.92 123.79±25.94c

3.4 秫米提取物對小鼠海馬組織中5-HT和5-HTAA含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠海馬組織中5-HT 和5-HTAA 含量均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和秫米提取物高劑量組小鼠海馬組織中5-HTAA含量顯著升高（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組小鼠海馬組織中5-HT 和5-HTAA 含量測定結果（±s，n＝10）

表3 各組小鼠海馬組織中5-HT 和5-HTAA 含量測定結果（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組秫米提取物低劑量組秫米提取物中劑量組秫米提取物高劑量組5-HTAA/（ng/L）17.65±1.29 12.86±1.59a 18.03±6.21b 14.36±3.03 16.29±1.99 17.73±1.52b 5-HT/（ng/mL）171.58±25.98 105.35±18.03a 161.17±24.96b 133.69±25.81 130.85±28.76 137.23±48.85

3.5 秫米提取物對小鼠海馬組織中PI3K/Akt/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠海馬組織中PI3K、Akt蛋白磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05），NF-κB p65蛋白磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和秫米提取物低、高劑量組小鼠海馬組織中PI3K蛋白磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），陽性對照組和秫米提取物高劑量組小鼠海馬組織中Akt蛋白磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），秫米提取物中、高劑量組小鼠海馬組織中NF-κB p65蛋白磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖1、表4。

表4 各組小鼠海馬組織中PI3K/Akt/NF-κB 信號通路相關蛋白的磷酸化水平測定結果（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.60±0.20 1.06±0.17a 0.83±0.15 0.76±0.15 0.69±0.08c 0.67±0.12c組別空白組模型組陽性對照組秫米提取物低劑量組秫米提取物中劑量組秫米提取物高劑量組p-PI3K/PI3K 0.74±0.11 0.46±0.09a 1.08±0.17b 0.72±0.10c 0.68±0.16 1.06±0.15b p-Akt/Akt 1.17±0.23 0.65±0.10a 1.03±0.20c 0.68±0.10 0.73±0.09 1.07±0.19b

4 討論

PCPA是一種5-HT合成抑制劑，通過抑制色氨酸羥化酶阻滯5-HT的合成。隨著大腦中5-HT的減少，會導致失眠、抑郁等病癥發生[11]。因此，本研究采用腹腔注射PCPA 的方法來制備失眠小鼠模型，以探究秫米提取物對失眠小鼠的改善作用。地西泮是一種苯二氮類藥物，通常被用作鎮靜藥、抗焦慮藥和肌肉松弛劑，故本研究選擇地西泮作為陽性對照藥。實驗過程中筆者發現，小鼠在腹腔注射PCPA 3 d 后，出現了焦慮、煩躁、精神亢奮、體重增長緩慢等情況，而在秫米提取物干預下失眠小鼠的上述情況均有所改善。本研究發現，當小鼠處于失眠狀態時，其運動路程明顯縮短，探索能力下降；而經秫米提取物干預后，小鼠的總運動距離增加、總運動時間延長，總靜止時間縮短，站立次數及修飾次數減少，這說明秫米提取物能影響失眠小鼠的自主活動，改善其失眠癥狀。

海馬組織是大腦中重要的神經元區域，與記憶、情感和空間定向等功能密切關聯，海馬體積減小和神經元密度下降均與失眠相關，而神經炎癥可以導致海馬組織損傷和炎癥反應[12]。5-HT 在海馬組織中具有重要的生理和神經調節作用[13]，5-HTAA 是5-HT 的主要代謝物。本研究結果顯示，各給藥組小鼠海馬組織中5-HT 的含量均明顯升高，這說明秫米提取物可促進小鼠體內5-HT的合成，改善失眠癥狀。

抗凋亡蛋白Bcl-2是一種環磷腺苷效應元件結合蛋白介導的蛋白質，有助于修復海馬區神經元細胞；Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值在細胞凋亡過程中有著重大意義[14]。BDNF 是一種神經營養因子，可抑制胱天蛋白酶3 活性并增加Bcl-2 的表達，保護神經細胞，防止細胞損傷[15]。本研究采用秫米提取物干預后，小鼠血清中Bcl-2/Bax比值和BDNF含量升高，提示秫米提取物可減緩小鼠神經元凋亡。

NF-κB 作為一種轉錄因子可以介導多種炎癥反應和免疫反應，其過度活化會導致神經遞質的改變和神經元的死亡，從而影響睡眠質量[16]。此外，一些炎癥因子紊亂也會導致睡眠障礙，如IL-2、IL-6 等[17]。PI3K 是生長因子超家族信號轉導過程中的重要分子，在多種生長因子的刺激下可被激活；Akt 可介導細胞生長、轉化、分化等修復功能[18]。本研究結果表明，經秫米提取物干預后，小鼠血清中IL-6 和IL-2 水平降低，海馬組織中Akt、PI3K蛋白磷酸化水平均升高，NF-κB p65蛋白磷酸化水平降低。該結果提示，秫米提取物可能通過調控PI3K/Akt/NF-κB信號通路，降低炎癥因子水平，修復神經元細胞，進而改善小鼠失眠癥狀。

綜上所述，秫米提取物可通過調控海馬組織中PI3K/Akt/NF-κB信號通路相關蛋白的表達，減輕炎癥反應，從而改善小鼠失眠癥狀。但本研究僅初步探究了秫米提取物調節炎癥相關通路改善失眠癥狀，具體作用機制還需深入探索。