3 種常用碳青霉烯類抗生素血藥濃度UPLC-MS/MS 檢測方法的建立 Δ

秦 怡 ，張瑞霞 ，呂雅瑤 ，翁莉莉 ，張 弋 （.天津醫科大學一中心臨床學院，天津 3009；.天津市第一中心醫院藥學部，天津 3009）

碳青霉烯類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強、耐藥率低的特點，已成為治療重癥感染的主要選擇。最佳的抗生素劑量、適當的抗生素濃度和足夠的給藥療程是重癥感染治療成功的關鍵[1]。碳青霉烯類抗生素多為親水性藥物，主要以原型形式通過腎臟排泄，故其易受腎臟清除率和分布容積的影響[2]。半數以上的重癥患者在使用與非重癥患者劑量相同的抗生素給藥時，會出現劑量不足的現象，造成抗生素耐藥和感染控制無效，從而增加患者的住院時間，甚至降低患者的生存質量[3]。此外，碳青霉烯類抗生素的蓄積還會導致神經毒性[4]。目前，治療藥物監測的目的已逐步從避免藥物毒性反應轉移為確保療效和減少治療指數較寬藥物的不良反應[5—6]。《重癥患者β-內酰胺類抗生素治療的優化指南（2019 版）》明確指出，使用治療藥物監測可提高β-內酰胺類抗生素藥動學/藥效學目標實現的達標率，降低藥物處于次優濃度和發生劑量相關不良反應的風險[7]。

目前，我國臨床用碳青霉烯類抗生素主要為亞胺培南（imipenem，IPM）、美羅培南（meropenem，MEM）、厄他培南（ertapenem，ETP），通常為單一用藥。然而有研究表明，雙碳青霉烯聯合療法（ETP 聯合MEM）可以增強碳青霉烯類藥物對耐藥腸桿菌/肺炎克雷伯菌的抗菌作用，用于多黏菌素類抗生素導致腎功能受損的重癥感染患者[8—9]。由于臨床用藥方案的改進及血漿中碳青霉烯類抗生素的不穩定性[10]，故需滿足臨床上重癥患者不同碳青霉烯類抗生素血藥濃度定量需求，即定量方法應達到同時快速定量多種藥物血藥濃度的要求。超高效液相色譜-質譜聯用（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法靈敏度和特異度高，操作簡單快速，適用于多種藥物監測。本研究建立了一種簡單快速測定3種常用碳青霉烯類抗生素（ETP、IPM、MEM）血藥濃度的UPLC-MS/MS法，用于監測重癥患者的血藥濃度，以期為患者個體化給藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Waters ACQUITY UPLC Ⅰ-Class 系統、Xevo TQD系統、Masslynx V4.2 工作站均購自美國Waters 公司；MX-F 型固定式渦旋混合儀購自美國Scilogex 公司；BY-G20 型高速離心機購自北京白洋醫療器械有限公司；SB-5200DT型超聲波清洗機購自寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

ETP（純度98.16%，批號V-806800-NU1）、IPM（純度98.14%，批號V-804800-NU1）、MEM（純度86.80%，批號130506-202004）均購自中國食品藥品檢定研究院；ETPD4（內標，同位素豐度99.00%，批號12-MRS-161-1）購自上海甄準生物科技有限公司；IPM-D4（內標，同位素豐度99.50%，批號7-MMH-92-2）、3-嗎啉丙磺酸（3-morpholinopropanesulfonic acid，MOPS）緩沖劑購自美國CFW公司；MEM-D6（內標，同位素豐度99.70%，批號5-JUZ-42-1）購自譜析（上海）生物科技有限公司。甲醇、乙腈均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；甲酸購自上海安譜科學儀器有限公司；水為屈臣氏蒸餾水。

1.3 人血漿

血漿為健康者未用藥的空白血漿。本研究獲天津醫科大學一中心臨床學院倫理委員會審批，倫理號為科研20240124-1。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相A 為98%水+2%乙腈+0.1%甲酸，流動相B 為98%乙腈+2%水+0.1%甲酸，梯度洗脫（0～0.50 min，95%A；0.50～0.51 min，95%A→85%A；0.51～1.60 min，85%A→65%A；1.60～1.70 min，65%A→95%A；1.70～3.50 min，95%A）；流速為0.3 mL/min；進樣量為8 μL；柱溫為40 ℃；進樣器為8 ℃。離子源為電噴霧離子源，采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）方式，檢測模式為正離子模式。ETP、IPM、MEM及其內標的質譜檢測參數見表1。

表1 ETP、IPM、MEM及其內標的質譜檢測參數

2.2 相關溶液與血漿樣品的配制

2.2.1 穩定劑配制

精密稱取MOPS 緩沖劑10.46 g，置于250 mL 容量瓶中，加純水溶解并定容，得0.2 mol/L MOPS緩沖液，用1 mol/L NaOH 調節pH 至6.8，即得穩定劑，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

2.2.2 ETP、IPM、MEM標準品溶液配制

精密稱取ETP、IPM、MEM 各1.00 mg，分別置于EP管中，加“2.2.1”項下穩定劑250 μL 溶解，配制成質量濃度均為4 000 μg/mL 的標準品儲備液。將上述適量ETP、IPM、MEM 儲備液以2∶1∶1 比例混勻，得質量濃度分別為2 000、1 000、1 000 μg/mL 的混合標準品溶液。取混合標準品溶液，用穩定劑倍比稀釋，得ETP 質量濃度分別為2 000、1 000、200、100、20、10、5、2 μg/mL，IPM、MEM質量濃度分別均為1 000、500、100、50、10、5、2.5、1 μg/mL 的混合系列標準工作液。同時，用穩定劑配制ETP質量濃度為1 600、100、5 μg/mL，IPM、MEM質量濃度分別均為800、50、2.5 μg/mL 的混合質控樣品溶液。各標準品儲備液于－80 ℃避光保存，系列標準工作液和混合質控樣品溶液現配現用。

2.2.3 內標溶液配制

精密稱取ETP-D4、IPM-D4、MEM-D6各1.00 mg，分別置于5 mL 棕色容器中，加穩定劑溶解并定容，搖勻，配制成ETP-D4、IPM-D4、MEM-D6 質量濃度均為200 μg/mL的內標儲備液。取適量儲備液，加穩定劑稀釋得ETP-D4、IPM-D4、MEM-D6 質量濃度分別為25、100、25 μg/mL的混合內標溶液，分裝后于－80 ℃避光保存備用。

2.2.4 混合標準曲線樣品和質控血漿樣品的配制

精密吸取180 μL空白血漿，置于1.5 mL離心管中，加入ETP、IPM、MEM 混合系列標準工作液20 μL，渦旋15 s 混勻，得ETP 質量濃度為200、100、20、10、2、1、0.5、0.2 μg/mL，IPM、MEM質量濃度分別均為100、50、10、5、1、0.5、0.25、0.1 μg/mL的混合標準曲線樣品。混合步驟同標準曲線樣品，配制成ETP 質量濃度為160、10、0.5 μg/mL，IPM、MEM質量濃度分別均為80、5、0.25 μg/mL的高、中、低濃度的混合質控血漿樣品溶液。

2.3 血漿樣品預處理

精密吸取100 μL 血漿樣品，與穩定劑1∶1 混合，加入10 μL 混合內標溶液（ETP-D4 為25 μg/mL，IPM-D4為100 μg/mL，MEM-D6 為25 μg/mL），渦旋15 s；加入400 μL甲醇，渦旋30 s，以13 000 r/min離心10 min；取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液100 μL，加超純水300 μL，渦旋10 s，以13 000 r/min離心10 min后取上清液，進樣。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性

分別取健康者的空白血漿加入中濃度的混合質控樣品溶液和混合內標溶液，均按“2.3”項下方法處理，記錄色譜圖。結果顯示，ETP、IPM、MEM與對應內標色譜峰峰形良好，完全分離。ETP 和ETP-D4 保留時間均為1.60 min；MEM和MEM-D6保留時間均為1.30 min；IPM和IPM-D4以雙峰存在，其中IPM雙峰保留時間為0.49、0.62 min，IPM-D4 雙峰保留時間為0.56、0.72 min。人血漿中內源性物質不干擾藥物和對應內標的測定，該方法專屬性良好。結果見圖1（空白血漿圖略）。

圖1 ETP、IPM、MEM及其內標的MRM圖譜

2.4.2 標準曲線與定量下限

取ETP、IPM、MEM混合標準曲線樣品，每一質量濃度各3 份，按“2.3”項下方法處理，記錄峰面積。分別以對照品質量濃度為橫坐標（X），3種藥物與其內標的峰面積比值為縱坐標（Y），采用W＝1/X2進行線性回歸運算，得到ETP、IPM、MEM 在0.2～200、0.1～100、0.1～100 μg/mL范圍內線性良好，線性方程分別為Y＝2.877 67X－0.082 915（r2＝0.997）、Y＝4.195 77X－0.167 327（r2＝0.993）、Y＝6.256 62X－0.074 893（r2＝0.994）。以最低濃度為定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）。取6 份ETP、IPM、MEM 質量濃度為0.2、0.1、0.1 μg/mL的混合標準曲線樣品，按照“2.3”項下方法處理后記錄實測濃度。實測濃度的相對誤差（relative error，RE）＜3.60%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）＜9.41%。

2.4.3 提取回收率與基質效應

取不同來源空白血漿配制低（ETP 為0.5 μg/mL，IPM、MEM分別均為0.25 μg/mL）、中（ETP為10 μg/mL，IPM、MEM 分別均為5 μg/mL）、高（ETP 為160 μg/mL，IPM、MEM 分別均為80 μg/mL）3 種質量濃度的質控樣品，按“2.3”項下方法處理，每個質量濃度平行制備6份，將對照品與內標峰面積的比值記為A。取6份不同來源的空白血漿按“2.3”項下方法處理后，加入高、中、低3種質量濃度混合質控樣品溶液和混合內標溶液，對照品和內標峰面積比值記為B。取6 份低（ETP 為5 μg/mL，IPM、MEM分別均為2.5 μg/mL）、中（ETP為100 μg/mL，IPM、MEM分別均為50 μg/mL）、高（ETP為1 600 μg/mL，IPM、MEM分別均為800 μg/mL）3種質量濃度的混合質控樣品溶液10 μL，與190 μL穩定劑、400 μL甲醇混勻，以超純水適當稀釋后上樣檢測，對照品和內標峰面積比值記為C。提取回收率（%）＝A/B×100%，基質效應（%）＝B/C×100%。結果顯示，ETP、IPM、MEM 低、中、高3種質量濃度混合質控樣品內標歸一化的提取回收率及基質效應較一致，全部RSD≤12.99%，詳見表2。

表2 ETP、IPM、MEM 混合質控樣品內標歸一化的提取回收率及基質效應（n＝6）

2.4.4 精密度和準確度

配制ETP 質量濃度分別為0.2、0.5、10、160 μg/mL，IPM、MEM 質量濃度分別均為0.1、0.25、5、80 μg/mL 的LLOQ 和低、中、高質量濃度的混合血漿標準樣品，按“2.3”項下方法處理，每個質量濃度平行制備5 份，連續3 d重復測定，根據隨行標準曲線計算樣品的實測濃度。ETP、IPM、MEM的LLOQ和低、中、高質量濃度的批內、批間RE均≤5.14%、RSD均≤11.15%，詳見表3。

表3 ETP、IPM、MEM 在血漿中的批內及批間精密度和準確度（n＝5）

2.4.5 穩定性

待測物低、中、高3個質量濃度的混合質控樣品溶液與血漿混合后，分別在室溫放置4、8、12、24 h 和4 ℃放置4、8、12、24 h 考察血漿樣品短期穩定性，在－80 ℃冰箱凍存60 d考察血漿樣品長期穩定性；凍融循環3次考察血漿樣品凍融穩定性。血漿樣品按“2.3”項下方法處理后置于處理進樣器（8 ℃）和室溫4、8、12、24 h，室溫放置4、8、12、24 h，考察處理后血漿樣品穩定性。4 000 μg/mL的ETP、IPM、MEM 標準品儲備液分裝，置于－80 ℃凍存60 d，考察儲備液穩定性。RE 和RSD 均＜15%視為穩定性良好。結果顯示，ETP、IPM、MEM血漿樣品在室溫條件下分別可以穩定8、4、8 h，在4 ℃下分別可以穩定24、8、24 h，在－80 ℃冰箱凍存60 d、凍融循環3 次穩定性良好。ETP、IPM、MEM 血漿樣品處理后在進樣器（8 ℃）中分別可以穩定24、4、24 h，室溫條件下分別可以穩定8、4、8 h。ETP、IPM、MEM標準品儲備液在－80 ℃冰箱凍存60 d可以保持穩定。

3 討論

3.1 內標物質的選擇

穩定性同位素內標是UPLC-MS/MS 定量分析方法的首選，本實驗選擇ETP-D4、IPM-D4、MEM-D6 這3 種同位素內標，分別與3種待測物ETP、IPM、MEM一一對應。同位素內標與待測物的理化性質完全一致，不僅可以消除儀器進樣的誤差，還在最大程度上消除了基質效應。本實驗根據調諧結果分別比較了4 對IPM-D4 離子對（304.14→107.01、304.14→141.98、304.07→97.91、304.07→106.96）的質譜監測參數和響應強度。結果顯示，304.14→141.98、304.07→97.91 這2 組保留時間與IPM 一致，但其信噪比和響應強度均不佳；304.14→107.01 雖與IPM 保留時間不一致，但其峰面積位于IPM線性范圍中段且線性范圍良好。

3.2 血漿樣品與前處理方法的選擇

研究顯示，與血清、檸檬酸鹽乙二胺四乙酸血漿樣品相比，肝素化血漿樣品中IPM 和MEM 質量濃度超過標稱值的115%，低濃度尤其明顯，故本實驗血樣采集選擇檸檬酸鹽乙二胺四乙酸抗凝管[4]。生物樣品前處理方法常用蛋白沉淀法、液-液萃取法、固相萃取法等，碳青霉烯類抗生素較不穩定，簡單、高效的前處理方法可最大限度地縮短樣品周轉時間，因此本實驗選擇了操作簡單的蛋白沉淀法。本實驗前處理中比較了以甲醇（分別為3∶1、4∶1、5∶1）和乙腈（分別為2∶1、3∶1、4∶1）沉淀血漿樣品蛋白的6種方式。結果發現，乙腈沉淀血漿樣品蛋白時，無論其比例如何，ETP 均出現裂峰，IPM、MEM 出現不同程度的分峰或拖尾。以甲醇3∶1 沉淀血漿樣品蛋白時，IPM分峰；以甲醇5∶1沉淀血漿樣品蛋白時，IPM 峰展寬，ETP 出現前沿峰；以甲醇4∶1 沉淀血漿樣品蛋白時，ETP、IPM、MEM 峰形和響應強度均較好，同時蛋白沉淀效果良好，故本研究最終選擇甲醇4∶1沉淀血漿樣品蛋白。沉淀蛋白后上清液與流動相初始梯度極性相差較大，直接上樣后ETP、IPM、MEM不同程度地出現拖尾峰。為確保分析物峰形良好并降低基質效應，上樣前應加水稀釋上清液，且當上清液與水的比例為1∶3時，化合物的峰形、線性范圍、基質效應、提取回收率均良好。

3.3 碳青霉烯類抗生素穩定性分析

碳青霉烯類抗生素，尤其是IPM 在血漿中極不穩定，并且會受到濃度與溫度的影響[10]。兼性離子緩沖液可延緩碳青霉烯類抗生素的降解[11—12]，故本實驗選擇0.2 mol/L MOPS 作為穩定劑。但是MOPS 可能會損傷色譜柱，干擾方法穩定性，并且會增加檢測成本[13]。所以本實驗只在保存樣品與制備樣品時加入穩定劑，不在流動相中加入穩定劑。此外，β-內酰胺類抗生素環狀結構對pH 敏感，當pH＞6 時，會產生降解，且堿性越強降解越快。因此，本實驗在流動相的水相和有機相中加入0.1%甲酸調節pH，使流動相pH 為酸性，同時避免堿性物質加入，減少藥物降解[14]。

臨床上若對碳青霉烯類抗生素進行治療藥物監測，應重視取血到上機分析時的保存條件和溫度。此外，本實驗發現，將IPM置于4 ℃保存12 h或凍融循環3次后，僅高濃度組不滿足穩定性要求（RE＞15%）。以往研究表明，更高的溫度與藥物濃度會導致IPM注射液穩定性降低，故臨床上檢測IPM 血藥濃度應傾向選擇穩態谷濃度[10]。

3.4 IPM雙峰現象

IPM 已被證明在水溶液中存在順式和反式兩種形式的構象異構體[4]。IPM的兩種構象異構體處于平衡狀態，可以通過UPLC 分離[15—16]。本實驗中IPM 以穩定的雙峰形式存在，未發生展寬或者合并現象，且基線未完全分離，因此根據雙峰的總面積進行定量。此外，本實驗用穩定同位素內標IPM-D4矯正了在測量濃度范圍內IPM 的峰形變化及與IPM 共洗脫極性內源性化合物的基質效應。

綜上所述，本實驗建立了一種可以同時定量臨床3種常用碳青霉烯類抗生素（ETP、IPM、MEM）血藥濃度的UPLC-MS/MS 法，該方法樣品前處理簡單，檢測時間短，所需樣品量少，可以滿足臨床上（尤其重癥患者）對碳青霉烯類抗生素血藥濃度的監測需求。