基于匹配頻數統計矩法的六味地黃濃縮丸譜量學質量控制與評價研究

王玉釵 ，劉 湘 #，田 麗 ，李文姣 ，譙 茹 ，張偉龍 ，潘 雪 ，唐 昱 ，賀福元 , 3, 4*

1. 湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208

2. 中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

3. 湖南中醫藥大學 中醫藥超分子機理與數理特征化實驗室，湖南 長沙 410208

4. 中藥藥性與藥效國家中醫藥管理局重點實驗室，湖南 長沙 410208

六味地黃丸（Liuwei Dihuang Pills，LD）為滋陰補腎[1]的著名方劑，用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟等癥狀[2-4]，配方由熟地黃、山藥、酒萸肉、茯苓、牡丹皮、澤瀉[5]6 味中藥組成的。六味地黃濃縮丸在OTC 領域銷量較高，然而，由于六味地黃濃縮丸（Liuwei Dihuang Concentrated Pills，LDCP）的生產廠家眾多，所用原藥材質量不一，生產工藝復雜多變，造成其質量參差不齊，影響臨床療效，故其質量控制與評價一直是研究的難點與熱點。

目前，研究者們多通過測定單指標或多指標成分含量的方法，來進行LDCP 的質量控制與評價研究，并通過系統聚類[6]、主成分分析、偏最小二乘法[7]和多指標含量測定[8-9]等方法對指紋圖譜進行分析。然而，LDCP 原藥材受遺傳多態性，生長環境和制劑技術的影響，具有化學成分復雜多變、多成分協同發揮整體調控療效的特點，單一或多個有效成分的含量不能完全代表LDCP 的整體質量。此外，整體性和模糊性是中藥指紋圖譜的2 大特性，中藥藥效不是幾個單成分簡單的線性加合，而是應該從色譜的整體特征考慮“譜-效”關系。藥效的強弱與有效成分含量的大小相關聯，故作為衡量藥效強弱的“量”也應該從色譜圖整體出發，在整體的基礎上闡明“譜”與“量”的關系。前期研究中，本團隊建立了指紋圖譜與中藥成分含量的譜量學研究體系，包括成分群含量與浸出物含量之間的關系[10-11]。該研究方法不以指紋圖譜單個特征峰為信息單元，而是在超分子“印跡模板”理論的指導下，通過匹配頻數統計矩法將色譜圖劃分為一簇簇的段帶色譜峰成分簇，以成分簇為“物質單元”將成分群含量與浸膏物含量有機結合起來，通過對“物質單元”的分析對中藥化學成分含量進行預測。在實際生產應用中，浸膏量是中藥的藥效物質基礎，是看得見的產品，且出膏率的高低波動對含量有極大影響，最容易體現在內含指標成分含量也隨之同比波動[12]。因此，本研究在匹配頻數統計矩法的基礎上，將譜量學應用于LDCP 的質量控制研究中，將各物質單元對出膏率的貢獻進行排序，并預測LDCP 的出膏率與平均出膏率，確定LDCP 的出膏率范圍，為LDCP 的質量控制提供新方法與新思路。

1 基本原理

1.1 中藥成分群與色譜柱固定相按超分子“印跡模板”相互作用

超分子化學根源于配位化學，其以分子間多種弱相互作用力為研究對象，是研究非共價作用結合起來的分子有序組裝體的化學[13]?；诔肿踊瘜W，中藥可看成由單分子，超分子，聚合超分子以及巨復超分子構成的復雜超分子體系，中藥成分群是這一超分子體系的“印跡模板”聚集客體，能夠按照“印跡模板”規律與色譜柱固定相產生作用[14-15]，在指紋圖譜上呈現凹凸狀分布，越接近“印跡模板”的成分，面積越大，出現的頻率越高，反映到多個樣品指紋圖譜匹配時的頻數就越大。

1.2 “物質單元”的劃分與整合

在超分子化學理論的指導下，匹配頻數統計矩法首先根據匹配頻數的統計學原理劃分出色譜峰成分簇[16]，獲得段帶色譜總峰面積。其次根據各“印跡模板”成分簇對應的匹配頻數，采用總量統計矩原理劃分出兩兩“印跡模板”成分簇的界線，將同一“印跡模板”的成分簇整合為“物質單元”（段帶色譜峰成分簇）進行表征。根據中藥成分群在與色譜柱上的印跡作用規律，建立以“物質單元”印跡作用的總量統計矩參數為表征的評價體系。該法具有極大地壓縮色譜峰數、降低中藥物質基礎表征單元數目、保留原指紋圖譜總量統計矩特征，不改變樣本間變異性等優點。據此進行“物質單元”的劃分與整合，其物質單元劃分與整合思路見圖1。

圖1 匹配頻統計矩法劃分與整合LDCP 指紋圖譜“印跡模板”物質單元的研究路線圖Fig.1 Research roadmap of division and integration of “imprinting template” material units of LDCP fingerprint by matching frequency statistical moment method

1.3 譜量學

前期研究中，本團隊對大黃的特征成分簇譜量學進行了初步的研究[10]。研究表明，當物質的化學成分完全能在指紋圖譜上進行表征時，其指紋圖譜可以看成為由m個色譜峰的零階矩（AUCT）對物質總濃度（CT）的反映。但由于中藥成分復雜，含量高低不一，很多成分難以完全分離，故以吸光度大者為特征峰，與其周圍的小峰構成物質單元，并將整張指紋圖譜分成多個物質單元。然后，根據朗伯-比爾定律，物質的吸光度與濃度成正比，當進樣量為一定值時，物質的含量與濃度呈正比，而物質的含量又峰面積成正比，與故原色譜峰的AUCT與其對應的成分濃度呈線性關系。通過匹配頻數統計矩法劃分與整合后的各物質單元的總AUCT與其物質單元內對應的成分的總濃度也呈線性關系，呈現線性疊加性。然后根據總量統計矩原理將CT與段帶成分簇的AUCT進行了線性回歸，發現二者之間具有良好的線性關系，從整體上分析了大黃化學成分總的含量，并建立了中藥譜量學的數學模型與實驗方法。在后續研究中，本團隊又對百合進行了譜量學研究[11]，并將其浸出率與多批次百合的各物質單元總峰面積進行了關聯分析，同樣獲得了良好的線性關系，并找出了各物質單元對浸出率的貢獻大小。

2 儀器與材料

2.1 儀器

Acquity UPLC H-Class 型超高效液相色譜儀，美國Waters 公司；DZ-1AIV 型真空干燥箱，天津市泰勒斯儀器有限公司；H3-20KR 型臺式高速冷凍離心機，湖南可成儀器開發有限公司；AUY220 型電子天平，島津企業管理（中國）有限公司；SHZ-D（III）型循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；KH-300DE 型超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；DZKW-D-2 型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司；FW-200 型高速萬能粉碎機，北京中興偉業世紀儀器有限公司。

2.2 試劑與藥材

乙腈（批號22035335）、甲醇（批號22015112）均為色譜純，美國天地試劑公司；甲酸，批號20181201，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇，批號20200105，分析純，太倉滬試試劑有限公司；水，批號14310Z10J，華潤怡寶飲料有限公司；0.22 μm 微孔濾膜，批號160531014，天津津騰實驗設備有限公司；對照品莫諾苷（批號B20872，HPLC 質量分數≥98%）、馬錢苷（B20822，HPLC質量分數≥98%）、丹皮酚（批號B20266，HPLC 質量分數≥98%），上海源葉生物科技有限公司；LDCP，批準文號：國藥準字Z43020145，由九芝堂股份有限公司提供，50 個樣品均符合《中國藥典》2020 年版標準，每8 丸相當于3 g 飲片，產品批號見表1。

表1 50 批LDCP (S1～S50) 的產品信息和出膏率Table 1 Information and paste rate of 50 batches of LDCP (S1 - S50)

3 方法與結果

3.1 供試品溶液的制備

參考《中國藥典》2020 年版[17]進行LDCP 供試品溶液制備：LDCP 粉碎后過4 號篩，精密稱定粉末1.0 g，置于50 mL 圓底形瓶中，加入50%甲醇15 mL，稱定并記錄質量。90 ℃水浴回流提取1 h，用50%甲醇補足減失的質量，提取液于10 000 r/min離心機離心10 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，置于進樣小瓶中，待測。

3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱定莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚各1.00 mg，置1 mL 量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，過0.22 μm 微孔濾膜，取各對照品溶液各200 μL，置1 mL 量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，制成混合對照品溶液。

3.3 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（A），梯度洗脫：0～0.5 min，0.1%乙腈；0.5～20.5 min，0.1%～18.0%乙腈；20.5～23.5 min，18.0%～21.0%乙腈；23.5～30.5 min，21.0%～35.0%乙腈；30.5～34.5 min，35.0%～45.0%乙腈；34.5～36.5 min，45.0%～68.0%乙腈；36.5～37.5 min，68.0%～100.0%乙腈；柱溫35 ℃；體積流量0.2 mL/min；進樣量2 μL；全波長掃描200～400 nm，圖例顯示選取波長250 nm。

3.4 方法學考察

3.4.1 精密度試驗 取“3.1”項下配制的供試品溶液（S1），在“3.3”項的色譜條件下連續進樣6 次，考察各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 為0.05%～0.17%，各共有峰相對峰面積的RSD 為0.62%～2.23%，表明儀器精密度良好。

3.4.2 重復性試驗 取LDCP 粉末（S1）6 份，每份精密稱取1.0 g，按照“3.1”項下方法平行配制LDCP 供試品溶液6 份，在“3.3”項下色譜條件進樣測定，考察各共有峰的相對保留時間與相對峰面積，結果顯示，共有峰相對保留時間的RSD 為0.04%～0.12%，各共有峰相對峰面積的RSD 為1.30%～2.96%，表明方法重復性良好。

3.4.3 穩定性試驗 精密稱取LDCP 粉末（S1）1.0 g，按照“3.1”項下方法制備供試品溶液，按照“3.3”項下色譜條件，在制備后0、4、8、16、24、48 h 進樣分析，考察各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 為0.26%～1.51%，各共有峰相對峰面積的RSD 為0.66%～2.34%，結果表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

3.5 出膏率測定

取LDCP 待測定溶液，置已干燥至恒定質量的蒸發皿中[18]，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥至恒定質量，移至干燥器中，冷卻至室溫，迅速精密稱定質量，以干燥品質量計算各對應條件下的出膏率，結果見表1。

3.6 50 批LDCP 的UPLC 指紋圖譜分析

取“2.3.1”項下方法制備的LDCP 供試品溶液和“2.3.2”項下制備的混合對照品溶液，按上述色譜條件進行測定，得到50 批LDCP 的UPLC 指紋圖譜，將其導入《中藥色譜指紋相似度評價系統》（2012 版）進行分析，得到指紋圖譜疊加圖（圖2），以對照品指認出1 號峰為莫諾苷，2 號峰為馬錢苷，3 號峰為丹皮酚（圖3）。

圖2 50 批LDCP (S1～S50) 的UPLC 指紋圖譜Fig.2 UPLC fingerprint of 50 batches of LDCP (S1 - S50)

圖3 50 批LDCP 對照譜峰 (R) 及混合對照品 (C) 的指紋圖譜Fig.3 50 batches of LDCP reference peak (R) and mixed reference substance (C) fingerprint

3.7 50 批LDCP 指紋圖譜物質單元的劃分與整合

將50 批LDCP 指紋圖譜進行全峰匹配后獲得不同色譜峰的匹配頻數，通過匹配頻數法計算出50批LDCP 指紋圖譜劃分成“印跡模板”中心成分的最少匹配頻數為32.92 個，所以取大于等于匹配數33 的匹配頻數色譜峰為物質單元中心成分，共確定了35 個物質單元（A1～A35）；再根據總量統計原理劃分出兩兩物質單元間的保留時間的界值，并計算出新的保留時間和峰面積，50 批LDCP 壓縮后生成的新指紋圖譜信息見表2（S1～S50）。

表2 50 批樣品 (S1～S50) 劃分與整合后的新指紋圖譜Table 2 New fingerprints of 50 batches of samples (S1 - S50) after division and integration

3.8 匹配頻數統計矩法劃分與整合前后的指紋圖譜的總量統計矩參數對比

導出50 批LDCP 的UPLC 指紋圖譜，計算總量零階矩、一階矩、二階矩[19]，并對劃分與整合前后的指紋圖譜進行總量統計矩參數比較，結果見表3。結果發現，表3 中峰數目整合前后的RSD 變化很大，均大于80%。整合前各批次峰數目不等，RSD為2.39%，整合后各批次峰數目相同，RSD 為0?？偭苛汶A矩的RSD 為0，表明整合前后的色譜總峰面積保持不變；整合前后的總量一階矩和總量二階矩的RSD 均在5%以內，變化微小，表明總量統計矩參數總體穩定。

表3 50 批LDCP (S1～S50) 劃分與整合前后的指紋圖譜進行總量統計矩參數Table 3 Total statistical moment parameters of the fingerprints before and after the division and integration of 50 batches of LDCP (S1 - S50)

由此發現，匹配頻數統計矩法在壓縮色譜峰數的同時，還保留了原指紋圖譜的總量統計矩特性，能以較高準確度來劃分與整合LDCP 的指紋圖譜，將其表征為物質單元，為簡便、科學的指紋圖譜分析方法。

3.9 譜量學方程的建立及實驗驗證

3.9.1 譜量學方程 根據朗伯-比爾定律，色譜峰面積與其成分濃度呈線性關系，整合后的各物質單元色譜總峰面積與物質單元內成分總濃度也呈線性關系，呈現線性的疊加性。故將出膏率（PT）作為因變量，將35 個物質單元（A1～A35）總峰面積作為自變量，用SPSS 軟件進行多元線性回歸，方程如下：PT＝23.390＋0.041 06 A1-9.100×10-3A2＋0.014 68 A3＋0.027 98 A4-0.033 61 A5-0.042 25 A6-6.608×10-3A7-0.025 90 A8-0.145 60 A9＋0.165 00 A10-0.027 50 A11＋3.408×10-3A12-0.021 03 A13-1.070×10-3A14＋2.833×10-5A15-8.774×10-3A16＋0.018 52 A17-1.882 9×10-3A18＋0.023 61 A19＋8.566×10-3A20＋0.013 94 A21-5.894×10-3A22-0.012 27 A23-0.014 91 A24＋1.792×10-3A25-1.571×10-4A26-3.942×10-3A27-0.054 80 A28＋0.083 15 A29＋0.119 30 A30-0.060 71 A31-0.083 42 A32＋0.014 96 A33-2.989×10-3A34＋0.063 17 A35（r＝0.915）。各物質單元總峰面積與回歸系數乘積的絕對值為作用量，通過計算得到35 個物質單元（A1～A35）與常數項的貢獻率，其結果按照作用量進行排序，結果見表4。

表4 35 個物質單元的作用量、貢獻率、累積貢獻率、回歸系數排序Table 4 Order of action, contribution rate, cumulative contribution rate and regression coefficient of 35 material units

在表4 中，作用量可表示該物質單元對浸出物體系印跡量的占比，作用量越大，貢獻率越大，代表該物質單元內的化學成分的種類或含量越大。本研究中，作用量最大值和最小值分別為物質單元A10和A15，表明物質單元A10內的化學成分出現的頻率最高，其種類最豐富，而物質單元A15與之相反。回歸系數的正負代表物質單元對浸出物的促進或抑制作用，正值代表促進浸出物溶出，負值代表抑制浸出物溶出。

在本研究中，物質單元A1、A3、A4、A10、A12、A15、A17、A19、A20、A21、A25、A29、A30、A33、A35促進浸出物溶出；而物質單元A2、A5、A6、A7、A8、A9、A13、A14、A16、A18、A22、A23、A24、A26、A27、A28、A31、A32、A34抑制浸出物溶出，兩者相互作用，達到平衡時的出膏率為21.95%，RSD 為8.51%，符合中藥制劑質量允許變化10%范圍的要求。B 為儀器測定時總物質單元響應常數，是回歸方程中不受自變量所影響，長期穩定存在的非隨機部分。

3.9.2 實驗驗證 另取LDCP 樣品（n＝3，批號202110011、202111009、20211169），按“2.3.1”項下處理得供試品溶液，進樣后獲得指紋圖譜，并對其指紋圖譜進行物質單元的劃分，所得各物質單元總峰面積帶入譜量學方程，計算PT分別為23.79%、20.79%、25.01%，其均值為23.20%。

通過分析均值與譜量學常數項B 的RSD 值，結果顯示RSD 為1.15%，說明常數項B 與出膏率均值較為接近，能較好的預測LDCP 的平均出膏趨勢。通常均值在加減偏差3 倍（70%～130%）左右為出膏率的允許范圍，根據常數項B 值計算出的出膏率變化范圍為16.37%～30.41%，故其LDCP 的出膏率應在該范圍內波動，超出范圍的則不符合LDCP 的質量控制要求。

4 討論

本課題組前期已經建立了匹配頻數統計矩法，并對大黃和百合進行了譜量學研究，得出了一套將超分子“印跡模板”物質單元與浸出物含量相關聯的質量控制研究方法，本研究將該方法應用于預測LDCP 的出膏率和平均出膏率研究中，并對所得的物質單元進行作用量排序，有望對LDCP 的質量控制與評價提供新思路與新方法。

基于超分子“印跡模板”理論，通過匹配頻數統計矩法將50 批LDCP 指紋圖譜進行劃分與整合，最終得到35 個物質單元，每個物質單元中的化學成分生物理化性質類似。運用統計學軟件，將35 個物質單元總峰面積與出膏率進行線性回歸，得到譜量學方程與和每個物質單元的回歸系數?；貧w系數與相應的峰面積相乘得到作用量，可確定各物質單元對浸出物體系的印跡量占比與該物質單元內的化學成分的種類范圍與含量高低。本研究中物質單元A10的作用量最大，說明該物質單元對出膏率的貢獻率最高，越需要進行控制；物質單元A15的作用量最小，代表該物質單元對出膏率的貢獻率最小，對LDCP 的整體質量影響不大。此外，譜量學方程中的常數項B，能較好地預測出膏率的平均出膏趨勢，并根據常數項確定了出膏率的變化范圍，依此可實現對LDCP 的質量控制與評價。

中藥及其制劑具有整體性，依靠單一成分或同時以幾個成分作為質量控制的指標成分的方法，不能全面客觀地評價中藥的質量，更不能保證藥效，故從整體上實現對中藥的質量控制與評價一直是當下的難點[20-22]。而基于超分子“印跡模板”理論，可弄清色譜柱與中藥成分群的作用機制，根據匹配頻數統計學原理從整體上把握成分群動態變化規律，在中藥質量控制中具有重要作用，是破解目前中藥質控碎片化，突破“找成分、測含量、訂下限”模式的重要指導，突破單純的“唯成分論”，是實現中藥現代化的思路之一。

綜上，本研究基于匹配頻數統計矩法對LDCP進行了譜量質量控制研究，通過計算得到各物質單元的作用量排序，并預測了了LDCP 的出膏率與平均出膏率，確定了出膏率的變化范圍。后續研究需要進一步對作用量較大的物質單元進行深入分析，并進行體內實驗驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突