補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)小窩蛋白1 調(diào)控Shh 信號(hào)通路促進(jìn)腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化

陳博威，歐陽(yáng)銀，曾繁佐，劉英飛，田豐銘，徐雅倩，易 健，劉柏炎, ,

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007

2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

3. 湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410006

腦缺血是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，腦缺血患者在發(fā)病后經(jīng)常出現(xiàn)肢體癱瘓、語(yǔ)言障礙等各類后遺癥，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[1]。因此，尋找到能夠減輕腦缺血損傷、促進(jìn)腦缺血患者神經(jīng)功能重建的有效藥物或途徑是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的普遍關(guān)注點(diǎn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最廣泛、數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞類型，在清除有害物質(zhì)、維持腦微環(huán)境穩(wěn)態(tài)和保護(hù)病理性腦損傷等方面發(fā)揮著重要作用[2-3]。最新的研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞能在轉(zhuǎn)錄因子、小分子化合物或外泌體等的誘導(dǎo)下，進(jìn)行細(xì)胞重編程，從而轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元或神經(jīng)母細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建，給腦缺血的治療帶來(lái)了新希望[4-6]。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療缺血性腦卒中的經(jīng)典方劑，其療效已得到循證醫(yī)學(xué)的證實(shí)[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠通過(guò)小窩蛋白1（caveolin-1，Cav1）調(diào)控線粒體質(zhì)量控制[8]、促進(jìn)血管新生[9]、影響N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾[10]等途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，提示Cav1 可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療腦缺血的潛在靶點(diǎn)。音猬因子（sonic hedgehog，Shh）信號(hào)通路是一條參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化以及神經(jīng)發(fā)育的重要通路，近期研究表明Shh 信號(hào)通路在星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程中可能具有重要的調(diào)控作用[11]。然而，Cav1 調(diào)控Shh信號(hào)通路對(duì)腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本研究嚴(yán)格參照國(guó)際公認(rèn)的民族藥理學(xué)研究共識(shí)[12-13]，首先采用多劑量干預(yù)的方式探尋補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療腦缺血小鼠的理想劑量。隨后以Cav1基因敲除（Cav1-/-）小鼠為研究對(duì)象，并借助腺相關(guān)病毒腦內(nèi)注射標(biāo)記原位星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav1-/-小鼠腦缺血后Shh 信號(hào)通路及星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠40 只，6～8 周齡，體質(zhì)量23～28 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004，動(dòng)物合格證號(hào)2023000268。Cav1-/-（KO）小鼠與同源野生型（WT）C57BL/6 小鼠各40 只，6～8 周齡，體質(zhì)量23～28 g。Cav-1-/-小鼠引種自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)202111473，由課題組長(zhǎng)期飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物房，小鼠子代經(jīng)PCR 鑒定為KO 小鼠與同源WT 小鼠后納入實(shí)驗(yàn)[14]。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)ZYFY20201215-1）。

1.2 藥材

黃芪飲片（批號(hào)CK20122902）、赤芍飲片（批號(hào)NG20112502）、川芎飲片（批號(hào)20091001120）、桃仁飲片（批號(hào)2020050402）、當(dāng)歸飲片（批號(hào)TH20122201）、地龍飲片（批號(hào)2020090902）及紅花飲片（批號(hào)2020062001）購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。以上中藥飲片經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院龍紅萍副研究員分別鑒定為豆科植物蒙古黃芪AstragalusmongholicusBunge 的干燥根、毛茛科植物川赤芍PaeonialactifloraPall 的干燥根、傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort 的干燥根、薔薇科植物桃Prunuspersica(L.) Batsch 的干燥成熟種子、傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels 的干燥根、鉅蚓科環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E. Perrier)的動(dòng)物全體及菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。

1.3 藥品與試劑

HBAAV9-GFAP-EGFP 腺相關(guān)病毒由上海漢恒生物定制；丁苯酞軟膠囊（0.1 g/粒，批號(hào)H20050299）購(gòu)自石家莊恩必普藥業(yè)有限公司；動(dòng)脈栓線（貨號(hào)2432A2）購(gòu)自北京西濃科技有限公司；RNA wait 非凍型組織保存液（批號(hào)20220417）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；Shh 兔抗（批號(hào)D-B1-07G07A）、平滑同源物（smootened，Smo）兔抗（批號(hào)XA4802BP11397）、神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)聯(lián)癌基因同源物1（glioma associated oncogene homolog 1，Gli1）兔抗（批號(hào)ZP663BP63）、HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號(hào)BST18F26C18G54）購(gòu)自武漢博士德公司；βactin 兔抗（批號(hào)10025487）購(gòu)自武漢三鷹公司；神經(jīng)元核心抗原（neuronal nucleus，NeuN）兔抗（批號(hào)AC230312006）、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein ，GFAP ）兔抗（批號(hào)AC230823018）購(gòu)自武漢塞維爾公司；PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 儀器

68025 型腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；600 系列微量注射器（美國(guó)Hamilton公司），SH01D 型高速離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）；DT5-2 型低速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；DYY-7C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Tanon5200 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；SCIENTZ-24 型組織勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；SK-O180-E 型搖床[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司]；9700 型PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）；Vectra3智能組織切片成像系統(tǒng)（美國(guó)PerkinElmer 公司）。

2 方法

2.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯的制備

補(bǔ)陽(yáng)還五湯由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花按120∶6∶4.5∶3∶3∶3∶3 比例混合，常規(guī)浸泡、煎煮后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液濃縮至原藥材質(zhì)量濃度2 g/mL。濃縮液經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)，黃芪甲苷Ⅳ、芒柄花素、阿魏酸、芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)量濃度分別為78.1、46.7、45.6、468.4 μg/mL[15]。

2.2 腦缺血模型的制備

采用大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）法復(fù)制腦缺血模型。小鼠ip 0.3%戊巴比妥鈉麻醉后固定，取頸正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，將線栓經(jīng)頸總動(dòng)脈送入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)線栓上黑色標(biāo)記點(diǎn)恰好位于頸總動(dòng)脈分叉時(shí)固定線栓，消毒并縫合皮膚。假手術(shù)組小鼠僅切開(kāi)皮膚游離血管，隨后縫合皮膚。術(shù)后2 h 參照Longa 法[16]對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分1～3 分為模型復(fù)制成功。

2.3 動(dòng)物分組與給藥

首先將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量（9.25、18.50、39.00 g/kg，分別為臨床劑量的0.5、1、2 倍）組和丁苯酞（54 mg/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）組。除假手術(shù)組外，其余組采用MCAO 法復(fù)制腦缺血模型，術(shù)后6 h 首次ig 藥物（10 mL/kg），假手術(shù)組和模型組ig 等體積蒸餾水，1 次/d，連續(xù)21 d。

篩選出補(bǔ)陽(yáng)還五湯理想劑量后，將KO 小鼠和WT 小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯（18.5 g/kg）組，每組12 只，造模方式、給藥劑量和時(shí)間同上。

2.4 腦立體定位儀注射

鑒于腺相關(guān)病毒注射后需要21～28 d才能自發(fā)綠色熒光，因此在造模前7 d 分別給KO 小鼠和WT小鼠進(jìn)行腦立體定位后注射腺相關(guān)病毒以標(biāo)記原生星形膠質(zhì)細(xì)胞。依據(jù)文獻(xiàn)方法[5]，小鼠ip 0.3%戊巴比妥鈉麻醉后固定在腦立體定位儀上，剪開(kāi)頭皮，根據(jù)坐標(biāo)（囟門前0.5 mm，左側(cè)旁開(kāi)0.8 mm，深度2.5 mm），鉆一小孔后，進(jìn)針予以微量注射，注射量為0.8 μL，每次持續(xù)10 min，注射后留針15 min，隨后緩慢移除微量注射器，消毒并縫合皮膚。術(shù)后小鼠被單獨(dú)飼養(yǎng)，自由獲得常規(guī)飲食和水。

2.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

在術(shù)后第21 天末次給藥2 h 后，采用Clark 等[17]報(bào)道的28 分神經(jīng)功能評(píng)分法評(píng)定各組小鼠神經(jīng)功能。分?jǐn)?shù)越高，小鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

2.6 蘇木素-伊紅（HE）染色

神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，小鼠ip 0.3%戊巴比妥鈉麻醉，斷頭取腦，全腦于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、透明、包埋及切片，HE 染色，選取缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)400 倍放大圖像。

2.7 免疫組化染色

取全腦石蠟切片，依次脫蠟、抗原修復(fù)及封閉，加入兔抗NeuN（1∶2 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加二抗，37 ℃孵育1 h，PBS 沖洗后室溫下與SABC 孵育30 min。PBS 沖洗后用DAB 和蘇木素染色，最后用甘油封片。選取缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)400 倍放大圖像。根據(jù)課題組前期研究[8]，運(yùn)用Image J 軟件分析圖像，使用組織化學(xué)評(píng)分（H 評(píng)分）評(píng)估NeuN的表達(dá)情況。

H 評(píng)分＝弱強(qiáng)度細(xì)胞的百分比＋中等強(qiáng)度細(xì)胞的百分比×2＋強(qiáng)強(qiáng)度細(xì)胞的百分比×3

2.8 免疫熒光染色

GFAP 用來(lái)標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，首先通過(guò)EGFP/GFAP 雙熒光評(píng)估腺相關(guān)病毒是否能夠成功標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞。此外，NeuN 常用來(lái)標(biāo)記成熟的神經(jīng)元，而EGFP 綠光標(biāo)記原生星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此，EGFP/NeuN 能夠代表星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化的情況。取冰凍切片，依次晾干、PBS 浸泡和通透后，加入兔抗GFAP（1∶500）和NeuN（1∶500）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加熒光二抗，避光孵育1 h，PBS 沖洗后滴加DAPI 染色液，繼續(xù)孵育10 min，PBS 沖洗后甘油封片。選取缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)400 倍放大圖像，運(yùn)用Image J 軟件Colocalization Finder 插件對(duì)EGFP-NeuN 共定位進(jìn)行分析，依據(jù)Pearson’sR值進(jìn)行定量[18]。

2.9 Western blotting 測(cè)定缺血側(cè)皮質(zhì)中Shh、Smo和Gli1 蛋白表達(dá)

取100 mg 缺血側(cè)皮質(zhì)腦組織樣本，剪碎后加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白。測(cè)定蛋白濃度后將蛋白變性后上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉2 h 后分別加入兔抗Shh（1∶1 000）、兔抗Smo（1∶800）和兔抗Gli1（1∶800），4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗，室溫孵育2 h。掃描膠片，并計(jì)算各蛋白的相對(duì)光密度值。用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

2.10 qRT-PCR 檢測(cè)缺血側(cè)皮質(zhì)中神經(jīng)分化因子的表達(dá)

取30 mg 缺血側(cè)皮質(zhì)腦組織置于1.5 mL 離心管中，嚴(yán)格參照試劑盒步驟抽提RNA。將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算神經(jīng)分化因子acoete-scute 同系物1（achaete-scute complex homolog 1，Ascl1）、神經(jīng)源性分化因子1（neurogenic differentiation 1，NeuroD1）、神經(jīng)源性分化因子2（neurogenic differentiation 2，NeuroD2）、神經(jīng)元素1（neurogenin-1，Ngn1）、神經(jīng)元素2（neurogenin-2，Ngn2）及配對(duì)盒基因2（paired box gene 2，Pax2）的mRNA 相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)標(biāo)本均設(shè)置1 個(gè)復(fù)孔。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，符合正態(tài)分布組間比較根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別采用單因素或多因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響

如圖1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低（P＜0.05、0.01）。補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分有顯著差異（P＜0.01），而補(bǔ)陽(yáng)還五湯中、高劑量組和丁苯酞組之間無(wú)明顯差異。

3.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)病理學(xué)損傷的影響

如圖2 所示，假手術(shù)組小鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)豐富，胞核清晰；與假手術(shù)組比較，模型組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元排列不規(guī)整，細(xì)胞間隙增寬，存在明顯的空泡，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮；與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯各量組和丁苯酞組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)病理?yè)p傷均有不同程度的改善，神經(jīng)元排列相對(duì)規(guī)整，細(xì)胞間隙減小，核仁較清晰，空泡明顯減少。

3.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血小鼠神經(jīng)元損傷的影響

如圖3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織NeuN 表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組小鼠NeuN 的表達(dá)明顯升高（P＜0.05、0.01）。此外，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組小鼠NeuN 的表達(dá)有顯著差異（P＜0.01），而補(bǔ)陽(yáng)還五湯中、高劑量組和丁苯酞組之間無(wú)明顯差異。

圖3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元損傷的影響 (±s, n = 6)Fig.3 Effect of Buyang Huanwu Decoction on neuronal injury in ischemic cortex of mice with cerebral ischemia(±s, n = 6)

3.4 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav1-/-小鼠腦缺血后缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

首先，免疫熒光染色顯示EGFP 與GFAP 熒光基本共定位（圖4），表明腺相關(guān)病毒能夠有效標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞。隨后，基于上述神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、病理學(xué)和免疫組化結(jié)果，選擇補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組進(jìn)行接下來(lái)的研究。如圖5 所示，與WT 假手術(shù)組比較，KO 假手術(shù)組EGFP-NeuN 共定位無(wú)明顯變化。與同基因型假手術(shù)組比較，WT、KO 模型組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)EGFP-NeuN 共定位明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；與同基因型模型組比較，WT、KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)的EGFP-NeuN 共定位明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；與WT 模型組比較，KO 模型組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)EGFP-NeuN 共定位明顯降低（P＜0.01）；與WT 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)EGFP-NeuN 共定位明顯降低（P＜0.01）。

圖4 腺相關(guān)病毒注射成功標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞Fig.4 Adeno associated virus injection successfully labeled astrocytes

圖5 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav1-/-小鼠腦缺血后缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響 (±s, n = 6)Fig.5 Effect of Buyang Huanwu Decoction on trans-differentiation of astrocytes in ischemic cortex of Cav1-/- mice after cerebral ischemia (±s, n = 6)

3.5 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav1-/-小鼠腦缺血后缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Shh 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6 所示，與WT 假手術(shù)組比較，KO 假手術(shù)組Shh、Smo 和Gli1 的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。與同基因型假手術(shù)組比較，WT、KO 模型組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Shh、Smo 和Gli1 的蛋白表達(dá)菌明顯升高（P＜0.05、0.01）；與同基因型模型組比較，WT、KO補(bǔ)陽(yáng)還五湯組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)的Shh、Smo 和Gli1 的蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05、0.01）；與WT模型組比較，KO 模型組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Shh、Smo 和Gli1 的蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與WT補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Shh、Smo 和Gli1 的蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

圖6 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav1-/-小鼠腦缺血后缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Shh 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 ( ± s, n = 3)Fig.6 Effect of Buyang Huanwu Decoction on Shh signaling pathway related-protein expressions in ischemic cortex of Cav1-/- mice after cerebral ischemia (±s, n = 3)

3.6 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav1-/-小鼠腦缺血后缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)分化因子基因表達(dá)的影響

如圖7 所示，與WT 假手術(shù)組比較，KO 假手術(shù)組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Ascl1、NeuroD1、NeuroD2、Ngn1、Ngn2及Pax2的mRNA 表達(dá)水平無(wú)明顯變化。與同基因型假手術(shù)組比較，WT、KO 模型組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Ascl1、NeuroD1、NeuroD2、Ngn1、Ngn2及Pax2的mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與同基因型模型組比較，WT、KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)的Ascl1、NeuroD1、NeuroD2、Ngn1、Ngn2及Pax2的mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與WT 模型組比較，KO 模型組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Ascl1、NeuroD1、NeuroD2、Ngn1、Ngn2及Pax2的mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05、0.01）；與WT 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，KO 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Ascl1、NeuroD1、NeuroD2、Ngn1、Ngn2及Pax2的mRNA 表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。

圖7 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav1-/-小鼠腦缺血后缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)分化因子基因表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig.7 Effect of Buyang Huanwu Decoction on gene expressions of neurodifferentiation factors in ischemic cortex of Cav1-/-mice after cerebral ischemia (±s, n = 3)

4 討論

中醫(yī)學(xué)將腦缺血?dú)w納于“中風(fēng)”范疇，并認(rèn)為氣虛血瘀為卒中病的基本證候之一[19]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯由清代著名醫(yī)家王清任所創(chuàng)，專用于卒中氣虛血瘀證的診治[20]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血小鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠改善腦缺血小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，降低缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)病理?yè)p傷，修復(fù)缺血側(cè)神經(jīng)元損傷，并且發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能需要達(dá)到一定的劑量才能完全發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量可能是治療腦缺血小鼠的理想劑量。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠促進(jìn)腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化，其具體機(jī)制可能與通過(guò)Cav1 調(diào)控Shh 信號(hào)通路的活性，上調(diào)各類神經(jīng)分化因子的表達(dá)有關(guān)。

大腦中動(dòng)脈閉塞是腦缺血的常見(jiàn)原因，會(huì)導(dǎo)致缺血側(cè)神經(jīng)元的缺氧及能量供應(yīng)障礙，造成難以逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)功能損傷[21]。大量研究表明，腦缺血可以誘導(dǎo)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞原位轉(zhuǎn)分化為功能成熟的神經(jīng)元，這些神經(jīng)元可以在功能上與原始神經(jīng)回路整合以取代受損的神經(jīng)元[22]。本研究首先采用腺相關(guān)病毒感染原位星形膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞均可自發(fā)EGFP 的高密度及高強(qiáng)度綠色熒光，提示腺相關(guān)病毒能夠成功的標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞。此外，目前的研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程需要21～28 d 的時(shí)間[23]。因此，在這項(xiàng)研究中，首先在術(shù)后第21 天觀察小鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)是否存在星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象。結(jié)果表明，在腦缺血后缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)域存在少量的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象，這與之前的報(bào)道一致[24]。而補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療后EGFP-NeuN 共定位明顯增強(qiáng)，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠增強(qiáng)腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象。

洞穴是細(xì)胞膜上的特殊凹陷，其中積累了各種細(xì)胞信號(hào)分子。Cav1 是洞穴中重要的功能結(jié)構(gòu)和核心蛋白，它不僅參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，還能通過(guò)調(diào)節(jié)血腦屏障通透性，炎癥，血管生成和神經(jīng)再生，參與腦缺血損傷的調(diào)控，被認(rèn)為是治療腦缺血的新靶點(diǎn)[25]。Cav1 最初被認(rèn)為僅限存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，然而隨著研究的深入，Cav1 已被證實(shí)與星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能密切相關(guān)[26]。如有學(xué)者已發(fā)現(xiàn)Cav1敲除小鼠在腦缺血后相比正常小鼠，有更多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖和瘢痕形成[27]，并且星形膠質(zhì)細(xì)胞末端腳呈現(xiàn)明顯腫脹[28]。此外，研究表明Cav1沉默會(huì)加重糖氧剝奪損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸攝取及能量代謝，而過(guò)表達(dá)Cav1會(huì)激活有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，并抑制細(xì)胞凋亡[29]。綜上，Cav1 是星形膠質(zhì)細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，但截至目前還沒(méi)有Cav1 通過(guò)調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化對(duì)腦缺血后神經(jīng)修復(fù)的影響的報(bào)道。與此同時(shí)，課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠促進(jìn)腦缺血后Cav1 的表達(dá)，提示Cav1 可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療腦缺血的靶點(diǎn)之一[15,30]。在本研究中，課題組發(fā)現(xiàn)雖然補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠增強(qiáng)腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，但相應(yīng)KO 組與相應(yīng)WT 組相比，其星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象被一定程度的抑制，提示Cav1的缺失抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能是通過(guò)Cav1 促進(jìn)腦缺血后的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

Shh 信號(hào)通路被認(rèn)為參與了大腦內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)的建立與維持，并與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)[31]。目前已有學(xué)者在體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化過(guò)程進(jìn)行持續(xù)追蹤，發(fā)現(xiàn)Shh 信號(hào)通路的激活伴隨了星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的全過(guò)程，而隨著Shh 信號(hào)通路的激活，Ascl1、NeuroD1、NeuroD2、Ngn1及Ngn2等神經(jīng)分化因子的表達(dá)量亦呈現(xiàn)出級(jí)聯(lián)上調(diào)[11]。目前的研究表明，Ascl1的過(guò)表達(dá)增加了星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)祖細(xì)胞的局部轉(zhuǎn)化并改善了腦缺血小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)[5]。而過(guò)表達(dá)NeuroD1同樣可以將反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為功能性神經(jīng)元[32]。此外，亦有學(xué)者證實(shí)過(guò)表達(dá)Ngn2可以將皮質(zhì)區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)為特異性功能神經(jīng)元[33]。上述研究表明，Shh 信號(hào)通路及各類神經(jīng)分化因子能夠影響細(xì)胞命運(yùn)的決定，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)元。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后Shh 信號(hào)通路被激活，各類神經(jīng)分化因子表達(dá)上升，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠增強(qiáng)此效應(yīng)并促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。但值得注意的是Cav1敲除后會(huì)抑制該現(xiàn)象，提示Cav1 可能在腦缺血后調(diào)控Shh 信號(hào)通路的活性，影響各類神經(jīng)分化因子的表達(dá)，參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化調(diào)控。補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能是通過(guò)Cav1 調(diào)控Shh信號(hào)通路的活性，上調(diào)各類神經(jīng)分化因子的表達(dá)，最終促進(jìn)腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化（圖8）。

圖8 補(bǔ)陽(yáng)還五湯促進(jìn)腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制圖Fig.8 Mechanisms of BHD promoting astrocyte trans-differentiation after cerebral ischemia

不可否認(rèn)的是，當(dāng)前關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞是否可以轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元一直存在爭(zhēng)議[34]。有研究表明，當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的身份將喪失，EGFP 的表達(dá)無(wú)法被激活，導(dǎo)致一些成功轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的細(xì)胞不會(huì)自發(fā)EGFP 的綠色熒光[35]。而目前基于GFAP 啟動(dòng)子設(shè)計(jì)的腺相關(guān)病毒，暫時(shí)不能完全避免其熒光標(biāo)記物在內(nèi)源性神經(jīng)元中的泄露表達(dá)，從而誤被認(rèn)為是被轉(zhuǎn)分化形成的新生神經(jīng)元[36]。此外，本研究雖然表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠通過(guò)Cav1 促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化，但應(yīng)進(jìn)一步通過(guò)神經(jīng)電生理學(xué)以驗(yàn)證其是否具有類神經(jīng)元的生物學(xué)功能。后續(xù)課題組將在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面對(duì)其潛在機(jī)制進(jìn)行下一步探索。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠改善腦缺血小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，降低缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)病理?yè)p傷，其潛在機(jī)制可能與通過(guò)Cav1 調(diào)控Shh 信號(hào)通路的活性，上調(diào)各類神經(jīng)分化因子的表達(dá)，最終促進(jìn)腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化有關(guān)。但仍需在未來(lái)以更嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)證實(shí)這項(xiàng)研究的結(jié)果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突