基于PI3K/Akt/HIF-1α 通路探討桂枝茯苓膠囊-散結鎮痛膠囊-宮血寧膠囊聯用抑制子宮腺肌病進展的作用機制

王楚矗，王 信，于敏敏，王 哲，曹 涵，師 偉*，劉志勇*

1. 山東中醫藥大學，山東 濟南 250355

2. 山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014

子宮腺肌病（adenomyosis，AM）是一種婦科常見疑難病，以子宮內膜腺體與間質侵入子宮肌層為主要病理特征[1]。近年來，越來越多證據表明AM的發病率呈逐年上升和年輕化趨勢[2-3]。主要臨床癥狀包括進行性痛經加重、月經量過多及慢性盆腔疼痛等，可導致不孕并對輔助生殖技術助孕產生不利影響[4-5]，嚴重威脅女性身心健康。盡管現代醫學采用孕激素、促性腺激素類似物等控制疾病進展[6]，但也存在明顯的不良反應，且復發率高；手術切除子宮雖為根治性解決方案，但難以兼顧女性生育需求。因此，尋求更加安全有效的AM 治療方法是當下亟待解決的問題。

AM 的發病機制十分復雜，至今尚未完全闡明。AM 雖被歸類為良性疾病，但卻表現出與惡性腫瘤相似的異常增殖生長特點。已有報道表明，與正常內膜細胞相比，AM 異位內膜細胞增殖能力明顯增強[7]，這可能進一步導致子宮內膜-肌層交界區（endometrial-myometrial interface，EMI）的不規則增厚并引發功能異常[8]。磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/缺氧誘導因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）通路是一個調控細胞增殖等生物過程的重要信號軸[9]，該通路的異常激活常在癌癥[10]及炎癥損傷相關疾病[11-12]中被熱切關注。同時，研究表明p-Akt 與HIF-1α 的表達水平在AM 中也明顯上調[13-15]。提示PI3K/Akt/HIF-1α 通路在AM 的發生、發展中可能起到關鍵作用。

與化學藥治療不良反應較大、容易反復相比，中醫治療AM 具有其獨特的優勢，如控制痛經癥狀、調經助孕等，被2020 年《子宮腺肌病診治中國專家共識》治療指南所推薦[16]。近年來，中醫藥療法在治療AM 中展現出獨特的優勢。AM 在中醫古籍中并無病名記載，可歸于“痛經”“癥瘕”“月經過多”等，以“瘀血阻滯”為主要病機[17]。本課題組認為，AM 病程長、癥狀重且纏綿難愈，“久病入絡”[18]，當行通陽化瘀法，故治以桂枝茯苓膠囊-散結鎮痛膠囊-宮血寧膠囊聯用（簡稱GSG）方案，在臨床診療中效果較好。因此，本研究基于PI3K/Akt/HIF-1α 信號通路，探究GSG 方案對AM 的改善作用，并闡釋相關分子機制。

1 材料

1.1 AM 患者組織收集

選擇2019 年6 月在臨沂市中心醫院接受腹腔鏡手術的AM 患者1 例，年齡42 歲，術前3 個月內未進行激素治療，于手術室無菌獲取AM 病灶組織。本研究方案已獲得山東中醫藥大學附屬醫院倫理委員會的批準（批準號2019ky061），遵循赫爾辛基宣言進行，患者已簽署知情同意書。

1.2 動物

7 周齡SPF 級ICR 雌鼠24 只及雄鼠12 只，購自維通利華有限公司［SYXK（魯）2018-0015］，飼養于山東中醫藥大學附屬醫院動物實驗中心的SPF屏蔽環境，飼養條件為（22±2）℃的穩定飼養溫度，12 h/12 h 晝夜循環，常規喂養。動物實驗經山東中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理委員會批準（批準號AWE-2022-071）。

1.3 藥品與試劑

桂枝茯苓膠囊（國藥準字Z10950005，批號220914）、散結鎮痛膠囊（國藥準字Z20030127，批號220909）購自江蘇康緣藥業股份有限公司；宮血寧膠囊（國藥準字Z20020087，批號ZHC2301）購自云南白藥集團股份有限公司；米非司酮（批號26593）購自美國MedChemExpress 公司；復方米非司酮片（國藥準字H20040365，批號07221001）購自武漢九瓏人福藥業有限責任公司；他莫昔芬（批號WXBD7619V）購自美國Sigma-Aldrich 公司；DMEM-F12 培養基（批號F3023N1）、磷酸鹽緩沖液（批號C2123N3）購自中科邁晨（北京）科技有限責任公司；胎牛血清（批號TA01501）購自蘇州雙洳生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶（批號J121102）、青鏈霉素混合液（批號J121004）購自上海源培生物科技股份有限公司；4%組織細胞固定液（批號20191217）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號1130W052）、Triton X-100（批號304L022）、2.5%結晶紫染色液（批號202111009）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒（批號2306001）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測試劑盒（批號2305001）購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 試劑盒（批號ECK-A362）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；kFluor488-Edu 法細胞增殖檢測試劑盒（批號20221114）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號HADGP）、DAB 顯色試劑盒（批號DUKLY）、HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號HPHHP）購自山東思科捷生物技術有限公司；p-Akt 抗體（批號3523071101）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；p-PI3K 抗體（批號6）購自美國CST 公司；HIF-1α抗體（批號10017918）購自美國Proteintech 公司。

1.4 儀器

Memmert 二氧化碳培養箱（德國Memmert 公司）；5424R 型高速低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；DK-8D 型電熱恒溫水浴鍋（上海比朗儀器制造有限公司）；Multiskan Go1510 型酶標儀（美國Thermo 公司）；Axiovert 40 型倒置相差顯微鏡（德國Carlzeiss 公司）；DHG-9070A 型鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HP30 型自動組織脫水機［達科為（深圳）醫療設備有限公司］；BM450A型包埋機、BM450 型包埋冷凍臺、PH60 型病理組織漂烘儀（常州派斯杰醫療設備有限公司）；531CMY43 型輪轉式切片機（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 給藥溶液的制備

參照藥品說明書中的標準臨床用量與藥物規格，將桂枝茯苓膠囊、散結鎮痛膠囊、宮血寧膠囊以0.47∶0.80∶0.13 的比例充分混合，溶解至14 mL PBS 中，以37 ℃、50 Hz 超聲振蕩30 min 后，使用濾菌器濾過，制成質量濃度為100 mg/mL 的GSG母液。稱取米非司酮粉末25 mg，溶解于100 μL 二甲基亞砜中，制成250 mg/mL 的米非司酮母液。母液存于-20 ℃長期避光保存，用前以培養基稀釋，用于體外實驗。

按人與小鼠體表面積比值換算法計算不同給藥組各藥劑量，GSG 的1/2、1、2 倍臨床劑量相當于0.635、1.270、2.539 g/kg，復方米非司酮的1 倍臨床劑量相當于3.25 mg/kg。根據各組劑量，將桂枝茯苓膠囊、散結鎮痛膠囊、宮血寧膠囊按比例充分混合后溶解于生理鹽水中，復方米非司酮片溶解至生理鹽水中[19]，用于體內實驗。

2.2 體外實驗

2.2.1 原代細胞提取及培養 取AM 患者新鮮子宮組織，剪切至1 mm3大小，利用膠原酶IV 在37 ℃下消化4 h，期間每隔10 min 振蕩混勻1 次，至組織呈乳糜狀，先后使用70 μm 和40 μm 的過濾器濾過，以1 000 r/min 離心5 min，收集細胞沉淀后使用PBS 清洗，再次離心后加入含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12 完全培養基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。參照Suzuki-Kakisaka 等[20]方法對原代細胞進行表型鑒定，確定為AM 異位內膜衍生細胞（adenomyosis derived cells，AMDC）。取3～10 代原代培養細胞用于后續實驗。

2.2.2 CCK-8 法檢測細胞活力 AMDC 以3.5×103個/孔接種至96 孔板中，每孔100 μL，培養24 h 后，加入不同質量濃度（1、2、4、8、16 mg/mL）的GSG溶液或不同質量濃度（12.89、25.78、51.55、103.10、206.20 μg/mL）的米非司酮，對照組加入不含藥物的培養基，每組設置3 個復孔。干預48 h 后，更換為含10% CCK-8 試劑的完全培養基，37 ℃恒溫培養2 h，采用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度（A）值。通過GraphPad Prism 9 軟件對數據進行統計分析，計算藥物處理AMDC 后的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

2.2.3 克隆形成實驗 AMDC 以2×103個/孔接種至6 孔板中，每孔2 mL，培養24 h 后，分別加入不同質量濃度（0.2、0.4、0.8 mg/mL）的GSG 溶液，對照組加入不含藥物的培養基，置于培養箱中繼續培養，每3 天換液1 次，10 d 后終止培養。使用4%組織細胞固定液固定細胞30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS 沖洗2 次，待干燥后拍照并計數。

2.2.4 EdU法檢測細胞增殖能力 AMDC以2×105個/孔接種至24 孔板中，每孔1 mL，培養24 h 后，分別加入不同質量濃度（0.4、0.8、1.6 mg/mL）的GSG溶液，對照組加入不含藥物的培養基，干預48 h 后終止培養，按照試劑盒說明書加入2×EdU 工作液100 μL，37 ℃孵育2 h，棄去培養基，使用4%組織細胞固定液、0.5% Triton X-100 固定及通透，以3%BSA 沖洗2 次，每次5 min，加入Click 反應液均勻覆蓋各孔底部，避光孵育30 min。再次以3% BSA沖洗2 次，每次5 min，PBS 沖洗5 min，加入Hoechst 33342 溶液，避光孵育10 min，吸出后以PBS 沖洗2 次，每次5 min，最后進行熒光拍照。

2.3 AM 發病機制的生信分析

2.3.1 AM 數據集檢索及差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）分析 從GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/#）中檢索“adenomyosis”、種屬為“homo sapiens”、表達類型為“expression profiling by array”的數據集。通過GEO2R 在線分析網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）對DEGs 進行歸一化與差異分析，獲取滿足P＜0.05、|log2FC|＞1 的DEGs。利用R 4.2.1 軟件ggplot2 包對差異結果進行可視化。

2.3.2 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 對獲取的DEGs 進行ID 轉換，導入R 4.2.1 軟件clusterProfiler包進行GO 和KEGG 富集分析，利用ggplot2 包對結果進行可視化。

2.4 體內實驗

2.4.1 動物造模、分組與給藥 ICR 小鼠適應性飼養1 周后，以雌雄為2∶1 的比例合籠飼養，獲取新生雌性ICR 小鼠48 只，通過隨機法將小鼠分為對照組、模型組、復方米非司酮（3.25 mg/kg）組和GSG低、中、高劑量（0.635、1.270、2.539 g/kg）組，每組8 只。對照組小鼠于出生第2～5 天滴喂5 μL/g的花生油-卵磷脂-煉乳混合液（2∶0.2∶3），每天1次。除對照組外，其余小鼠于出生第2～5 天滴喂5 μL/g 花生油-卵磷脂-煉乳＋2.7 μmol/kg 他莫昔芬，每天1 次。造模后常規飼養90 d，各給藥組小鼠每日ig 100 μL 給藥溶液，對照組和模型組ig 等體積生理鹽水，連續干預30 d。小鼠ip 150 mg/kg 戊巴比妥鈉處死，獲取子宮、肝、脾、腎組織和血液樣本，置于4%組織細胞固定液中固定過夜。

2.4.2 HE 染色觀察子宮及肝脾腎病理形態 將經固定的各組小鼠子宮、肝、脾、腎組織脫水包埋，放入切片機中切片，將切片展開并黏附于載玻片上，晾干。對切片進行脫蠟水化，蘇木素染色20 s、伊紅復染30 s 并流水沖洗，再對切片進行脫水透明處理，用封片劑封片，對切片進行鏡下觀察與拍照，子宮組織切片以20、40 倍鏡分別拍攝，肝、脾、腎組織切片均以20 倍鏡拍攝。請經驗豐富的病理科于敏敏醫師對切片的形態學改變情況進行判斷。

2.4.3 免疫組化檢測子宮組織中p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 蛋白表達 將子宮組織切片進行脫蠟水化，再通過內源性過氧化物酶封閉液封閉去除內源性過氧化物酶。將切片置于稀釋后的檸檬酸鈉抗原修復液中，95 ℃水浴條件下修復25 min，用山羊血清封閉液封閉30 min，滴加一抗孵育過夜（p-Akt 抗體稀釋比為1∶150、p-PI3K 抗體稀釋比為1∶100、HIF-1α 抗體稀釋比為1∶200），滴加二抗孵育40 min（稀釋比為1∶200），加入DAB 工作液后根據顯微鏡下觀察的情況終止顯色。蘇木素染色液復染30 s，進行脫水透明處理后封片，觀察p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 免疫組化染色情況。使用Image J 軟件IHC Profiler 插件根據染色強度與染色面積統計陽性面積比。

2.4.4 血清ALT 活性和BUN 含量的檢測 取各組小鼠血液，3 200 r/min 離心15 min 后，獲得上清液，按照試劑盒說明書測定ALT 活性和BUN 含量。

2.5 統計學分析

采用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統計分析，數據以±s表示，多組間數據采用 One-way ANOVA 分析。

3 結果

3.1 體外實驗

3.1.1 GSG 和米非司酮對AMDC 活力的影響 為探究細胞對藥物的敏感性，利用梯度質量濃度的GSG 溶液及陽性對照藥米非司酮分別干預AMDC 48 h 后，采用CCK-8 法對細胞活力進行檢測。如圖1 所示，GSG 和米非司酮均能有效抑制AMDC 活力，GSG 和米非司酮的IC50值分別為（1.59±0.04）mg/mL、（47.94±2.73）μg/mL，表明GSG 對AMDC活力的具有較強的抑制作用。因此，后續采用梯度質量濃度（0.4、0.8、1.6 mg/mL）的GSG 溶液處理AMDC，檢測相關指標改變。

圖1 GSG (A) 和米非司酮 (B) 對AMDC 活力的影響 (±s, n = 3)Fig.1 Effects of GSG (A) and mifepristone (B) on viability of AMDC (±s, n = 3)

3.1.2 GSG 抑制AMDC 的克隆形成能力 AM 具有惡性腫瘤的特征，利用克隆形成實驗檢測GSG 對AMDC 克隆能力的影響。由于以1.6 mg/mL 的GSG溶液干預細胞后無法產生細胞團，故以梯度質量濃度（0.2、0.4、0.8 mg/mL）的GSG 溶液干預AMDC 10 d，4%組織細胞固定液固定染色后晾干，拍照并統計各孔內細胞數量＞50 個的細胞團數量。如圖2所示，與對照組比較，GSG（0.4、0.8 mg/mL）組細胞克隆形成數目均顯著降低（P＜0.001），表明GSG能夠有效抑制AMDC 的克隆形成能力。

圖2 GSG 抑制AMDC 的克隆形成能力 (±s, n = 3)Fig.2 GSG inhibits clonal formation ability of AMDC (±s, n = 3)

3.1.3 GSG 抑制AMDC 的增殖能力 克隆形成與細胞增殖密切相關，為了更直觀地評估藥物對AMDC 增殖能力的影響，采用EdU 增殖檢測試劑盒檢測GSG 對AMDC 增殖能力的影響。以梯度質量濃度的GSG 溶液干預AMDC 48 h 后，使用EdU工作液孵育處理2 h，4%組織細胞固定液固定染色，檢測其在2 h 內的細胞增殖情況。如圖3 所示，與對照組比較，GSG（0.4、0.8、1.6 mg/mL）組細胞增殖率顯著降低（P＜0.001），表明GSG 對AMDC增殖能力具有較強的抑制作用。

圖3 GSG 抑制AMDC 的增殖能力 (±s, n = 3)Fig.3 GSG inhibits proliferation ability of AMDC (±s, n = 3)

3.2 AM 發病機制的生信分析

為探究AM 發病相關分子機制，在GEO 數據庫中獲取鑒定AM DEGs 的數據集GSE68870（包括4 個AM 組織樣本和4 個正常組織樣本）。通過GEO2R 在線分析網站對本數據集包含的70 523 個基因進行歸一化及差異分析，共獲得來自GSE68870 數據集的266 個DEGs，其中包括111 個上調基因和155 個下調基因（圖4-A）。

圖4 AM 發病機制的生信分析Fig.4 Bioinformatics analysis of pathogenesis of AM

基于DEGs 在疾病的起源與進展中扮演重要角色，進一步分析了其主要影響的生物學過程及信號通路。對DEGs 進行GO 和KEGG 富集分析，結果顯示，缺氧反應相關條目在GO 分析中富集（圖4-B），PI3K/Akt 信號通路則在KEGG 分析中富集（圖4-C）。已有報道表明，AM 異位內膜組織中可能存在缺氧環境，并促進疾病進展，引起異常增殖[21]，PI3K/Akt 信號通路在AM 異位內膜細胞增殖中發揮重要作用，并且低氧環境中HIF-1α 穩定表達，是PI3K/Akt 通路下游重要的調控因子[22]，并對缺氧環境做出應答[23]。以上結果提示PI3K/Akt 通路介導的HIF-1α 激活是缺氧環境下AM 異位內膜細胞異常增殖的驅動因素。因此，進一步通過體內實驗驗證GSG 方案是否通過該通路發揮作用。

3.3 體內實驗

3.3.1 GSG 改善AM 小鼠模型中腺體向肌層侵襲基于AM 是以子宮內膜的腺體、間質侵入肌層為病理特征的疾病，利用滴喂他莫昔芬法構建小鼠AM模型，采用HE 染色法觀察各組小鼠子宮的病理學改變。如圖5 所示，對照組小鼠子宮內膜與肌層邊界清晰，無子宮內膜腺體與間質侵入子宮肌層表現；模型組小鼠子宮內膜與肌層邊界模糊，可見多處子宮內膜腺體與間質侵入肌層深部，腺體增多；GSG低劑量組子宮內膜與肌層邊界欠清晰，可見子宮內膜腺體與間質侵入肌層，較模型組浸潤深度減輕、數量較少；復方米非司酮組和GSG 中劑量組子宮內膜與肌層邊界較清晰，偶見腺體與間質侵入肌層，較模型組浸潤深度明顯減輕、數量減少；GSG 高劑量組子宮內膜與肌層邊界清晰，肌層連續，少見明顯子宮內膜腺體與間質侵入肌層。表明GSG 能夠改善AM 的病理進展，以高劑量組改善效果最為明顯，子宮肌層結構恢復最接近對照組，腺體侵入肌層數量明顯減少；GSG 中劑量組和復方米非司酮組改善效果相似，即中劑量的GSG 與米非司酮藥效基本相同。

圖5 各組小鼠子宮組織HE 染色Fig.5 HE staining of uterine tissue of mice in each group

3.3.2 GSG 抑制AM 小鼠模型子宮組織中p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 的表達 生信分析結果提示PI3K/Akt 通路及HIF-1α 表達與AM 發病密切相關，采用免疫組化法檢測各組小鼠子宮組織中p-PI3K、p-Akt和HIF-1α 的表達，如圖6 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮組織中p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 表達水平顯著增加（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，各給藥組子宮組織p-PI3K、p-Akt 表達均顯著降低（P＜0.01、0.001），復方米非司酮組和GSG 中、高劑量組HIF-1α 表達顯著降低（P＜0.05、0.01）。綜合以上結果，GSG 能夠降低AM 小鼠子宮組織中p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 的表達，抑制PI3K/Akt/HIF-1α 通路。

圖6 免疫組化檢測各組小鼠子宮組織中p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 的表達 (±s, n = 3)Fig.6 p-PI3K, p-Akt and HIF-1α expressions in uterine tissue of mice in each group by immunohistochemistry (±s, n = 3)

3.3.3 GSG 對AM 模型小鼠肝、脾、腎組織病理變化的影響 為觀察GSG 對肝、脾和腎組織是否具有損傷性，采用HE 染色觀察各組小鼠肝、脾和腎組織的形態學改變。如圖7 所示，各組小鼠肝、脾和腎組織病理形態均未見明顯改變，表明GSG 處理未引起AM 模型小鼠肝、脾和腎的病理性變化。

圖7 各組小鼠肝、脾和腎組織HE 染色 (×20)Fig.7 HE staining of liver, spleen and kidney tissues of mice in each group (× 20)

3.3.4 GSG 對AM 模型小鼠血清ALT 活性和BUN水平的影響 ALT 是一種指示肝功能的常規指標，其活性升高提示肝功能受損。BUN 是由腎臟排出的代謝廢物，其水平升高通常提示腎功能異常。如圖8 所示，各給藥組血清ALT 活性和BUN 水平無統計學差異，表明GSG 處理未引起AM 模型小鼠明顯肝、腎功能損傷。

圖8 GSG 對AM 模型小鼠血清ALT 活性和BUN 水平的影響 (±s, n = 4)Fig.8 Effect of GSG on ALT activity and BUN level in serum of AM model mice (±s, n = 4)

4 討論

AM 是一種易反復的婦科常見疑難病，嚴重影響患者生活質量。近年來，隨著生育需求的增加，現有醫學方法難以同時滿足AM 患者的癥狀控制與生育問題。然而，中醫藥在改善癥狀、調經助孕方面顯示出潛在優勢，中成藥因應用便捷和對控制癥狀的積極效果廣泛應用于臨床。《中成藥治療痛經臨床應用指南（2021 年）》[24]明確推薦，在AM 的治療中，桂枝茯苓膠囊可以縮小異位病灶，散結鎮痛膠囊可緩解痛經、降低復發率。《宮血寧膠囊婦產科臨床應用指導建議》[25]也明確指出宮血寧膠囊能夠減少異常子宮出血患者的出血量。此3 藥針對AM的癥狀各有所長，且有研究表明，中成藥聯用可打破單用的局限性，減毒增效，更貼合中醫辨證論治的特點[26]。本課題組常以GSG 方案用于臨床，收效甚佳，但其作用機制尚不明確，故本研究結合體內外實驗對此展開深入探討。

在中醫理論中，AM 的主要病理因素為“瘀血”。《臨證指南醫案》曰：“初為氣結在經，久則血傷入絡”，氣滯血停，久病入絡，瘀血膠著阻滯絡脈，則易積聚為癥瘕，纏綿難愈[27]。故以“通陽化瘀”法通利脈絡、祛瘀消癥，治以GSG 方案。桂枝茯苓膠囊源于經方桂枝茯苓丸，是治療“癥瘕”的基礎用方。其中桂枝溫經通陽，可以辛散之性引諸藥于營衛絡脈之中；茯苓甘淡，利水滲濕；桃仁辛潤入絡、丹皮辛寒入血、赤芍苦平除血痹，三者入絡消癥、清熱涼血；諸藥合用可通陽化瘀、清熱利濕。散結鎮痛膠囊藥簡力繁，其中血竭味咸，可入絡搜邪，破癥祛瘀止痛；三七通脈行瘀，和營止血；浙貝、薏苡仁清熱散結，通利絡脈；諸藥合用可破癥祛瘀、化痰散結。宮血寧膠囊由重樓單味藥組成，長于清熱解毒、散腫止痛、化瘀止血[28]。現代藥理研究表明，重樓還具有抗腫瘤、抗菌消炎、抗病毒、止血鎮痛的作用[29]。GSG 方案基于消癥化瘀，以辛散溫通之品引諸藥入絡，直達病所，同時避免苦寒之品凝滯氣血，多藥協同，辯證靈活。

子宮內膜腺體與間質異位并侵入肌層是AM 的病理基礎，異位內膜細胞的異常增殖可加重AM 進展[30]。Xu 等[31]研究顯示，槲皮素可以通過抑制子宮異位內膜基質細胞的增殖能力，影響細胞遷移與侵襲能力，進而改善AM。因此，抑制異位內膜細胞增殖是干預AM 發生過程的重要措施。本研究發現，GSG 可抑制AMDC 活力，0.8 mg/mL GSG 溶液可有效抑制AMDC 克隆形成和增殖能力。

在表觀遺傳學研究中，疾病的DEGs 富集情況常指示疾病潛在的分子機制。本研究對AM的DEGs進行分析后發現，GO 分析中與缺氧相關的條目被富集，這與AM 組織中可能存在缺氧微環境相一致，PI3K/Akt 信號通路則富集在KEGG 分析中。PI3K作為脂質激酶家族成員[32]，可以通過誘導磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2 ） 向 磷 脂 酰 肌 醇 3,4,5- 三 磷 酸（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3）的轉化進而促進Akt 磷酸化，介導下游重要效應因子的表達[33-34]，進而調節細胞增殖。研究提出，在AM發生過程中，異位內膜細胞的快速增殖與炎性反應的發生通常導致了氧氣快速消耗并造成組織缺血缺氧狀態[35]。此時，具有調節多種細胞功能能力的PI3K/Akt 通路可通過調節促進或抑制細胞凋亡的相關蛋白參與對缺血缺氧狀態的抗性反應，并誘導HIF-1α 表達，進一步誘導下游蛋白表達，促進細胞發生適應性改變。在缺氧條件下，AM 異位內膜中的HIF-1α 與p-Akt 表達增加，且p-Akt 表達峰值早于HIF-1α[35]。因此，PI3K/Akt/HIF-1α 通路是參與AM 發生發展的重要通路。

基于PI3K/Akt/HIF-1α 通路在AM 中的重要作用，本研究進行了GSG 的體內實驗研究，以評估藥物在真實生理環境中的治療效果。結果表明，在子宮病理學形態改變上，低、中、高劑量的GSG 均能減輕AM 病灶腺體浸潤深度，減少腺體數量，且中劑量的GSG 與米非司酮顯示出大致相同的療效。同時發現，GSG 可降低子宮組織中p-Akt、p-PI3K和HIF-1α 蛋白表達，顯示出對PI3K/Akt/HIF-1α 通路的下調作用。提示GSG 對AM 小鼠的改善作用可能與抑制PI3K/Akt/HIF-1α 通路相關。而中劑量的GSG 和米非司酮之所以能夠達到相似的療效，可能是由于兩藥通過影響不同的生物學過程，但導致了相似的治療結果。米非司酮作為孕激素受體拮抗劑，可阻斷孕酮，抑制腺體分泌，縮小病灶，并改善臨床癥狀[36]。而中劑量的GSG 可能是通過PI3K/Akt/HIF-1α 通路抑制AMDC 增殖、減輕腺體和間質侵入肌層的傾向從而改善AM。這也說明AM的發病機制具有多樣性和復雜性，不同的治療方法間可能存在協同作用。

桂枝茯苓膠囊-散結鎮痛膠囊-宮血寧膠囊聯用中的3 種中成藥分別經安全性分析，顯示總體安全性較好[37-39]。鑒于聯合用藥可能增加肝、腎損傷風險，本研究進行了體內實驗以對GSG 方案進行藥物安全性評估。研究發現，AM 小鼠經GSG 連續干預30 d 后，各組肝、脾和腎形態學均未見明顯改變，血清ALT 活性和BUN 水平無顯著性差異。即使在2.539 g/kg 藥物劑量下，即相當于2 倍人的臨床用量，在動物體內也未見明顯不良反應，這些初步結果提示，GSG 方案是安全的治療選擇。但目前研究僅集中于體外及動物實驗中，尚未進行廣泛的臨床試驗，接下來可將聯用方案進行臨床研究拓展，以驗證其安全性與有效性。

綜上，GSG 方案可能通過抑制PI3K/Akt/HIF-1α 通路來降低AMDC 增殖，阻斷AM 模型小鼠疾病進展，且不良反應有限，提示其是針對AM 臨床治療的潛在可用方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突